This research was supported in part by NSF grant CHE-1229562 (VDGM), the Office of Undergraduate Research at Elon University, the Elon Chemistry Department, and the Elon Lumen Prize (TL and TAD), the Elon College Fellows Program (JAC), and the Elon College Honors Program (TAD).

Tutti gli esperimenti sugli animali conformi alle linee guida del National Institutes of Salute e sono state approvate dalla Wake Forest University Animal Care and Use Committee. Coppie nidificanti di SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] modello di topo sono stati ottenuti da The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Wild-type (WT) femmine e maschi SOD1G93A nontransgenic [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] sono stati allevati per generare topi SOD1G93A e nontransgenic fratellini WT che sono stati utilizzati negli esperimenti. 1. Modelli per Investigation <ol><li> Colture cellulari <ol><li> Mantenere cellule renali di embrioni umani (HEK-T293) cellule in DMEM supplementato con 10% di calore inattivato siero fetale bovino, 1% di penicillina-streptomicina e 1% L-glutammina, a 37 ° C in 5% di CO 2. </li><li> Crescere cellule in fiasche T75 e consentire loro di raggiungere il 90% di confluenza. </li><li> Effettuare splitting cellulare tramite tripsinizzazione (0,25% tripsina-EDTA) per 3-5 minuti a 37 ° C in 5% CO 2 </sub&gt;, Inattivazione di tripsina con uguale volume del supporto cellulare, e centrifugazione delle cellule per 5 minuti a 700 xg in 4 ° C. </li><li> Aspirare i media e risospendere il pellet cellulare in coltura. </li><li> Cellule seme nel pallone o sulla piastra 7 x 10 4 cellule in un T75 boccetta 48 ore prima del trattamento con citochine. Questo dovrebbe dare ~ 70% di densità al momento del trattamento. </li><li> Cellule priveranno siero 24 ore dopo aspirando media e sostituendolo con lo stesso volume di mezzi privi di siero (DMEM, sterile). </li><li> Preparare TNF-α, β-IL1, e IFN-γ, dalla polvere liofilizzata con acqua ultra-pura a concentrazioni di lavoro di 5 pg / ml, 10 ng / ml, e 10 ng / ml, rispettivamente, e aggiungerli ai pozzetti / fiaschi. </li><li> Siero Treat cellule fame mediante aggiunta di citochine solubilizzate direttamente al mezzo di coltura cellulare di flaconi appropriati. Trattamenti consisteva di singoli citochine, un cocktail di tutti e 3 (denominato &quot;* 3&quot;), o steracqua ile come controllo (denominato &quot;0&quot;). </li><li> Incubare cellule trattate per 24, 48 o 72 ore prima della valutazione e la raccolta. </li></ol></li><li> Valutazione vitalità cellulare <ol><li> Fare una soluzione 5 mg / ml di 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) in PBS 1x. </li><li> Per piastre da 12 pozzetti, aggiungere 100 ml di soluzione MTT ad ogni pozzetto e mescolare delicatamente per assicurare una distribuzione uniforme. </li><li> Incubare le piastre per 15 min-1 ora a 37 ° C in 5% CO 2, e controllare al microscopio per la presenza di una colorazione viola. Se non è un viola presente, agitare di nuovo e consentono alle cellule di incubare in intervalli di 5 min fino viola si osserva. La quantità di tempo necessario deve essere determinato da ciascun ricercatore. </li><li> Utilizzando un pipettatore a ripetizione, aggiungere 700 ml di solvente MTT (HCl 4 mM e 0,1% NP40 in isopropanolo) a ciascun pozzetto e la piastra di roccia (s) a temperatura ambiente per 5-10 minuti, o fino a quando tutto il colore viola aveva lasciato le cellule . Se violacolore non esce di cellule, aggiungere altri 200 ml di solvente e continuare a turbinare. </li><li> Per l&#39;analisi, prendere 100 ml di ogni bene e mettere in una piastra a 96 pozzetti e leggere su un lettore di piastre con 570 nm e una lunghezza d&#39;onda di riferimento di 630 nm, ma 595 nm è accettabile a condizione che le letture sono prese a impostazioni coerenti. </li></ol></li><li> Modello animale di SLA <ol><li> Tutti gli esperimenti sugli animali conformi alle linee guida del National Institutes of Salute e sono state approvate dalla Wake Forest University Animal Care and Use Committee. Coppie nidificanti di SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] modello di topo sono stati ottenuti da The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Wild-type (WT) femmine e maschi SOD1G93A nontransgenic [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] sono stati allevati per generare topi SOD1G93A e nontransgenic fratellini WT che sono stati utilizzati negli esperimenti. </li><li> Eseguire genotipizzazione con primer standard, contro SOD1 mutante 25. </li></ol></li></ol> 2. Isolamento dei mitocondri NOTA: E &#39;importante lavorare velocemente e tenere tutto in ghiaccio durante tutta la procedura. <ol><li> Preparazione del tampone di isolamento mitocondriale (MIB), midollo spinale buffer di isolamento (SC MIB) e tampone sperimentale (EB) <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni madre prima del tempo per MIB e EB. </li><li> Fare 1 M Tris / MOPS sciogliendo 12,1 g di base di Tris in 70 ml di H 2 O. Aggiungi MOPS secco per arrivare a pH 7,4. Regolare il volume a 100 ml finale. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C. </li><li> Fare 1 M Kphos mescolando 80,2 ml di K 2 HPO 4 e 19,8 ml di KH 2 PO 4. Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Rendere 0,2 M EGTA / Tris aggiungendo 3,8 g di EGTA a 10 ml di H 2 O. Aggiungere 1 M Tris / MOPS fino disciolti, ~ 30-40 ml. Regolare a 50 ml, filtro sterile e conservare a temperatura ambiente. Si noti che il pH sarà ~ 6,7. </li><li> Fare 1 M glutammato facendo 10 ml diSoluzione 1 M di acido glutammico. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C. </li><li> Fare 1 M Malate facendo 10 ml di soluzione 1 M di acido malico. Aggiungi Tris / MOPS a 50 mm. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C. </li><li> Effettuare MIB ad una concentrazione di saccarosio 200 mM, Tris 10 mM / MOPS, pH 7,4, e 1 mM EGTA / Tris. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C. </li><li> Rendere SC MIB ad una concentrazione di saccarosio 250 mM, 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, KCl 10 mM, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, e cocktail inibitore di proteasi. </li><li> Effettuare EB ad una concentrazione di 125 mM KCl, 10 mM Tris / MOPS, pH 7,4, 5 mM glutammato, malato 2,5 mM, 1 K mM fosfato, pH 7,4, e 10 mM EGTA / Tris. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparazione apparecchiature prima raccolta delle cellule. <ol><li> Risciacquare un piccolo recipiente di vetro e omogeneizzazione pestello tre volte con acqua sterile e disporli sul ghiaccio. </li><li> Raccogliere gli elementi necessari, ad esempio drill standard, SCRA cellularepers, 1,5 ml, 15 ml e 50 ml provette e soluzioni. </li></ol></li><li> I mitocondri Isolation <ol><li> Cellule in coltura <ol><li> Per ogni tipo di campione, utilizzare due palloni T175 di cellule. </li><li> Assicurarsi che le cellule sono ~ 90% confluenti e utilizzare in esperimenti di controllo, o piastra e trattare come descritto nel passaggio 1.2. </li><li> Sulla parte superiore del banco, i media aspirare e lavare le cellule aderenti due volte con 15 ml di 1x PBS ogni volta. </li><li> Aspirare il tampone e raschiare flaconi per rimuovere le cellule aderenti dal fondo del pallone. </li><li> Aggiungere 15 ml di PBS 1x per ogni pallone, turbine, e trasferire ai singoli 15 ml provette coniche e posto sul ghiaccio. </li><li> Una volta raschiatura è fatto, centrifugare le provette per 5 minuti a 700 xg, a 4 ° C utilizzando una centrifuga da tavolo utilizzando un rotore oscillante secchio. </li><li> Supernatanti Aspirare e risospendere ogni pellet in 1 ml di MIB. </li><li> Combinare entrambe le sospensioni e il trasferimento di un piccolo recipiente di vetro per omogeneizzazione. </li><li> Aggiungi MIBal recipiente fino buffer raggiunge la prima riga. Omogeneizzare cellule con il pestello collegati ad un trapano a velocità media per tre passaggi. Assicurarsi che la nave è in ghiaccio durante questa fase, non rimuovere il pestello sopra il liquido e di utilizzare una velocità costante con continui passaggi. </li><li> Trasferire la soluzione omogeneizzato in una provetta conica da 50 ml. </li><li> Aspirare la soluzione in una siringa da 3 ml con un calibro 18 1 ½ pollice ago e di espellere di nuovo nel tubo conico sul ghiaccio con una calibro 27 ½ ago pollici. Fare attenzione per espellere la soluzione contro la parete interna del tubo da utilizzare quella forza di sconvolgimento membrana cellulare. </li><li> Ripetere le fasi siringa per un totale di cinque volte. </li><li> Trasferire la soluzione in un tubo da 15 ml e centrifugare per 5 min a 600 xg, a 4 ° C in una centrifuga da tavolo utilizzando un rotore oscillante secchio. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante e distribuire tra tre 1,5 ml provette. NOTA: Mitochondria sono nel supernatante dopo questo primo, rotazione a bassa velocità, mentre le membrane cellulari e cellule intatte sono pellettizzati. </li><li> Provette per centrifuga in un rotore ad angolo fisso a 10.000 xg, a 4 ° C per 5 min. </li><li> Surnatanti Aspirare e combinano il pellet in 100 ml MIB e mettono immediatamente in ghiaccio. NOTA: mitocondri sono nel pellet dopo questa rotazione ad alta velocità. I mitocondri in genere a mantenere il loro potenziale di membrana per ~ 2-3 ioni di ghiaccio dopo l&#39;isolamento e sono più stabili come una soluzione madre concentrata in MIB. </li></ol></li><li> I mitocondri isolamento dal tessuto del mouse <ol><li> Anestetizzare il mouse secondo il protocollo IACUC. Impostare un vaporizzatore al 5,0% per indurre l&#39;anestesia. Confermato che l&#39;animale è anestetizzato da una mancanza di riflessione per pizzico piedi o riflesso corneale quando l&#39;occhio si avvicina o sfruttato con un batuffolo di cotone. Mantenere il mouse sotto anestesia per tutta la procedura chirurgica mantenendo il vaporizzatore tra 1,5% e 2,0%. </li><li> Excise il fegato e il midollo spinale di ogni animale e luogo separatamente nel freddo ghiaccio 1x PBS - / - per lavare via il sangue. </li><li> Per il fegato, trasferire il tessuto ad un piatto pesare su ghiaccio e tagliare a pezzi sottili usando una lama di rasoio fresco per 1 min. </li><li> Aggiungere tessuti e tampone appropriato (MIB per il fegato o SC MIB per il midollo spinale) al recipiente fino buffer raggiunge la prima riga. Omogeneizzare il tessuto con il pestello a mano per cinque passaggi. Assicurarsi che la nave è in ghiaccio durante questa fase, non rimuovere il pestello sopra il liquido e di utilizzare una velocità costante con continui passaggi. </li><li> Trasferimento omogenati per pulire 15 ml provette. </li><li> Provette per centrifuga in un rotore ad angolo fisso a 750 xg, a 4 ° C per 10 min. </li><li> Salvare il surnatante in provette pulite e disporli sul ghiaccio. NOTA: mitocondri sono nel supernatante dopo questo primo, rotazione a bassa velocità, mentre le membrane cellulari e cellule intatte sono pellettizzati. </li><li> Risospendere il pellet midollo spinale in 500 ml di SC MIB. </li><li> Re-omogeneizzare ogni tre volte, riempiendo solo la metà nave con SC MIB questa volta. </li><li> Trasferire il nuovo omogeneizzato in una nuova provetta. </li><li> Centrifugare la in un rotore ad angolo fisso a 750 xg, a 4 ° C per 10 min. </li><li> Combinare questi nuovi surnatanti, che contengono più mitocondri, con il primo supernatante da ogni campione. </li><li> Provette per centrifuga in un rotore ad angolo fisso a 10.000 xg, a 4 ° C per 5 min. </li><li> Supernatanti Aspirare e risospendere il pellet fegato in 500 ml di MIB e pellet del midollo spinale in 50 microlitri SC MIB e collocare immediatamente su ghiaccio. NOTA: mitocondri sono nel pellet dopo questa rotazione ad alta velocità. I mitocondri in genere a mantenere il loro potenziale di membrana per ~ 2-3 ioni di ghiaccio dopo l&#39;isolamento e sono più stabili come una soluzione madre concentrata in MIB. </li><li> Effettuare un saggio concentrazione proteica di stimare la concentrazione di mitocondri in soluzione. Seguire istruzionis per l&#39;utilizzo di un kit commerciale Protein Assay o metodo simile 26. Tipici concentrazioni di mitocondri sono: fiasche T175 rendimenti 2 ~ 2 mg / ml, 1 fegato di topo ~ 3-5 mg / ml e 1 midollo spinale di topo ~ 1-3 mg / ml. </li></ol></li></ol></li><li> Citocromo c test utilizzando un progetto di R &amp; S Rat / Mouse citocromo c Quantikine ELISA Kit (adattato dal protocollo fornito dal produttore). <ol><li> Immediatamente prima di impostare le reazioni, diluire mitocondri a 0,5 mg / ml concentrazione di lavoro con EB e distribuire mitocondri diluiti in 1,5 ml provette per le reazioni (di solito 30-50 ml di mitocondri per provetta). </li><li> Aggiungere sia EB o DMSO, all&#39;1% del volume totale, ai mitocondri diluito e incubare le reazioni sul banco per 7-10 min. Queste reazioni sono stabili per un massimo di 30 minuti a temperatura ambiente, se è necessario un periodo di tempo più lungo. </li><li> Mitocondri pellet per centrifugazione in un rotore ad angolo fisso a 10.000 xg, a 4 ° C per 5 min e accurataly separare il surnatante e mettere ciascuno in separata provette da 1,5 ml. NOTA: Tubes può o essere congelato a -20 ° C per un&#39;analisi successiva o utilizzato immediatamente. </li><li> Determinare rilascio del citocromo c da un confrontando la concentrazione del citocromo c nel pellet e supernatante 27. <ol><li> Preparare campioni solubilizzando il pellet nel volume originale della reazione con 0,5% Tx-100 in PBS 1x. </li><li> Per ogni campione, preparare 2 pozzetti della piastra ELISA, uno per il pellet ora solubilizzato e uno per il supernatante dalla reazione mediante aggiunta di 100 ml di citocromo c coniugato (utilizzare direttamente dalla bottiglia) più 100 ml di 0,5% Tx- 100 in PBS 1x e quindi il campione di pellet o surnatante. </li><li> Vortice delicatamente la piastra di un livello basso (livello 2-4) per 20 secondi per mescolare, coprire e incubare per 1 ora, 37 ° C. </li><li> Avanti, lavare la piastra quattro volte con tampone di lavaggio diluito secondo il manufacturistruzioni di Er. Rimuovere qualsiasi eccesso di soluzione picchiettando i pozzetti su carta assorbente. </li><li> Successivamente, aggiungere 150 ml di 1: 1 A + B soluzione di sviluppo a ciascun pozzetto ed incubare la piastra per 20-30 minuti al buio a temperatura ambiente. </li><li> Infine, aggiungere 50 ml di soluzione di stop in tutti i pozzetti e le letture di assorbanza a 540 nm con un lettore di micropiastre. Calcolare la quantità di rilascio del citocromo c confrontando la quantità di citocromo c nel pellet vs supernatante per ogni reazione. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Valutazione della funzione mitocondriale (Dys) <ol><li> Immediatamente prima reazioni sono impostati, diluire mitocondri a 0,5 mg / ml di concentrazione lavorare con EB e poste in provette da 1,5 ml per le reazioni (tipicamente 30-50 ml di mitocondri sono utilizzati per provetta). </li><li> Trattamenti mitocondriali <ol><li> Aggiungere trattamenti appropriati (controllo EB, 1 micron FCCP mescolato con 50 Nm Valinomicina, 10 micron rotenone, 5 mM oligomicina, 2 mM KCN, o 200 mM di ADP, concentrazioni finali) per separare reazioni a 1/10 del volume totale dei mitocondri diluiti. Incubare le reazioni sul banco per 7 min. NOTA: Si deve prestare attenzione quando si maneggiano tali sostanze come l&#39;ingestione accidentale o assorbimento attraverso la pelle potrebbe essere dannoso. </li><li> Diluire TMRE, ricostituito in acqua sterile alla concentrazione di lavoro di 100 mM e conservati a -20 ° C, a 2 mM e aggiungere un volume pari al volume di reazione mitocondriale. </li><li> Incubare le reazioni sul banco per 7 min. </li><li> Mitocondri pellet per centrifugazione in un rotore ad angolo fisso a 10.000 xg, a 4 ° C per 5 min. </li><li> Carico metà del volume supernatante di ciascun campione su una piastra 396 pozzetti e leggere la fluorescenza. NOTA: eccitazione e di emissione di TMRE devono essere ottimizzati in base alle istruzioni del fabbricante, con il volume e la piastra che verrà utilizzato per lail dosaggio. Utilizzando una piastra standard 384 pozzetti nero con 25 ml di 1 micron TMRE (concentrazione di reazione finale) il segnale più forte è stata ottenuta usando lunghezze d&#39;onda di eccitazione / emissione &#160; 485 nm / 535 nm. </li><li> Calcolare la piega-differenza tra il controllo della fluorescenza (EB) e ogni trattamento dividendo il valore di fluorescenza relativa (RFU) ottenuto dal lettore di piastre per il campione sperimentale dal RFU dal campione di controllo. </li></ol></li></ol>

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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+optical+oxygen+sensing:+protocols+and+critical+analyses.">Methods in optical oxygen sensing: protocols and critical analyses.</a> Methods in enzymology. 381, 715-735 (2004).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+assessment+of+mitochondrial+membrane+permeabilization+in+apoptosis.">Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis.</a> Apoptosis : An International Journal On Programmed Cell Death. 12, 803-813 (2007).</li><li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu,Zn+superoxide+dismutase+mutation.">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li><li>Certo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+primed+by+death+signals+determine+cellular+addiction+to+antiapoptotic+BCL-2+family+members.">Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members.</a> Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).</li><li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues;+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver;+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material.">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).</li><li>Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+cytochrome+oxidase+and+succinoxidase+in+the+cytoplasm+of+the+mammalian+liver+cell.">The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell.</a> The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).</li><li>Marques-Fernandez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNFalpha+induces+survival+through+the+FLIP-L-dependent+activation+of+the+MAPK/ERK+pathway.">TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway.</a> Cell Death &amp; Disease. 4, e493 (2013).</li><li>Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergistically+mediate+neurotoxicity:+involvement+of+nitric+oxide+and+of+N-methyl-D-aspartate+receptors.">Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors.</a> Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).</li><li>Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+death+in+cytokine-activated+primary+human+brain+cell+culture:+role+of+tumor+necrosis+factor-alpha.">Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha.</a> Glia. 28, 114-127 (1999).</li><li>Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+endothelial+cell+activation+in+experimental+sepsis+with+a+two-step+cell+culture+model.">Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model.</a> Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).</li><li>Brown, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes:+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria.">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li><li>Wong, A., Cortopassi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+in+a+neural+cell+line+using+a+fluorescence+plate+reader.">High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).</li><li>Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+assays+for+the+mitochondrial+permeability+transition+using+a+fluorescence+multiwell+plate+reader.">Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader.</a> Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).</li><li>Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+membrane+potential+in+the+cells+by+microchip+flow+cytometry.">Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry.</a> Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).</li><li>Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivator+of+transcription+fusion+protein+transduction+causes+membrane+inversion.">Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Il trattamento di cellule HEK-293T con citochine ricombinanti provoca una moderata quantità di morte cellulare oltre 48 ore (Figura 1). La quantità di morte cellulare indotta da TNF-alfa è simile agli studi precedentemente riportati 30 e vitalità cellulare diminuisce dopo la co-somministrazione di molteplici citochine che sono maggiori di quantità sommativi con qualsiasi citochine solo è anche coerente con la letteratura 31,32. La possibilità di modulare gli importi e tipi d...

Le cellule viventi Energy Bank metabolica sotto forma di grassi e carboidrati e utilizzare questa energia per biosintesi, trasporto di membrana e movimento. Alcuni energia viene ottenuta nel citosol attraverso la conversione di zuccheri alimentari direttamente in ATP durante glicolisi. Tuttavia, la principale fonte di produzione di ATP in una cella è sfruttata all&#39;interno dei mitocondri attraverso la catena respiratoria mitocondriale 1. L&#39;architettura dei mitocondri fornisce l&#39;orientamento spaziale necessaria per la produzione di ATP efficace ed efficiente. I mitocondri possiedono una doppia membrana separati da uno spazio intermembrane e insieme con la matrice, il compartimento mitocondriale interna, Casa componenti e coordinare le reazioni chimiche coinvolte nella produzione di ATP. La membrana interna contiene una serie di complessi proteina di membrana che compongono la catena respiratoria, nonché la ATP sintasi, il complesso proteico che porta ADP e Pi insieme per la formazione di ATP. La locandaer membrana viene ripiegato creste e gli elettroni passano attraverso la complessi della catena respiratoria attraverso il citocromo c, un vettore di elettroni solubile che si muove tra complessi all&#39;interno dello spazio intermembrane. Come gli elettroni si muovono, ossidazione di riduzione equivalenti verifica e ioni idrogeno vengono pompati dalla matrice allo spazio intermembrane. Come conseguenza della elevata concentrazione di ioni all&#39;interno dello spazio intermembrane, un gradiente elettrochimico costruisce un conseguente potenziale di membrana attraverso la membrana mitocondriale interna (Δψ) 2. L&#39;ossigeno è l&#39;elettrone accettore finale della catena di trasporto degli elettroni e gli ioni idrogeno fluire attraverso i sintasi ATP dallo spazio intermembrana torna alla matrice, e così facendo direttamente provoca la formazione di ATP. Questo processo come descritto nella sua interezza è noto come fosforilazione ossidativa. Le pieghe creste aumentano la superficie della membrana interna, consentendo il trasporto di elettroni massima e la produzione di ATP all&#39;internoogni mitocondrio. Le proteine, enzimi e altre molecole coinvolte nella fosforilazione ossidativa sono derivati ​​da entrambi i geni nucleari e mitocondriali. I mitocondri contengono un proprio DNA circolare, codifica per 13 proteine ​​e tRNA e mRNA necessari per la produzione di ATP 3. Tuttavia, molte più proteine ​​sono necessari e quindi sono codificati nucleare. La maggior parte di queste proteine ​​codificate dal nucleo sono mirati alla matrice mitocondriale mediante l&#39;uso di presequenze al N-terminale della proteina precursore, e la loro importazione è guidato in parte da Δψ 4,5. Oltre contribuendo alle bioenergetica di una cella, mitocondri influenzano anche importanti processi metabolici come TCA e beta-ossidazione, segnalazione cellulare tramite regolazione del calcio, come pure un ruolo chiave nell&#39;apoptosi 6. In particolare, durante i periodi di stress cellulare, proteine ​​BCL-2 familiari che risiedono o interagiscono a livello della membrana mitocondriale esterna può causare mitocondrialepermeabilità della membrana esterna (MOMP) 7,8. Durante MOMP, citocromo c e altre proteine ​​vengono rilasciati nel citoplasma, e insieme a diverse proteine ​​citosoliche formano un complesso chiamato apoptosoma 9,10. Il apoptosoma attiva caspasi che vanno a fendere proteine ​​e DNA cellulare durante la fase di esecuzione di apoptosi. Non appena si verifica MOMP, ΔΨ è crollato e la produzione di ATP si fermò. Funzione mitocondriale Così, come apoptosi è avviato viene compromessa e variazioni ΔΨ può essere correlato ad mitocondriale e cellule salute 12. Mentre l&#39;apoptosi è un endpoint in molti modelli di malattia, la funzione mitocondriale e modifiche ΔΨ può anche fornire informazioni preziose sulla origine e / o la progressione della malattia. Per esempio, cambiamenti strutturali e funzionali mitocondriali sono state documentate nel corso di malattie neurodegenerative 13,14. Nella prima parte del protocollo, isozione di mitocondri intatti che mantengono la loro ΔΨ è descritto. Cellule HEK-293T sono stati esposti a diverse concentrazioni e combinazioni di TNF-α ricombinante, IL1-β e IFN-γ di indurre apoptosi. Queste citochine sono stati scelti perché sono frequentemente segnalati per essere elevato in campioni settiche umani primari 15 e la via estrinseca di apoptosi può essere innescato da interazioni di legame al suo recettore TNF-α 6. Dato che ci sono sottili variazioni necessarie per isolare i mitocondri funzionale da tessuti primari rispetto alle cellule in coltura, e perché molte ricerche utilizza gli animali, il protocollo descrive anche come isolare i mitocondri dal fegato e midollo spinale di anteriore sclerosi laterale (ALS) modello di topo. La seconda parte del protocollo è stato sviluppato per monitorare perturbazioni al potenziale di membrana mitocondriale utilizzando un colorante fluorescente potenziale sensibile con un lettore di piastre a fluorescenza. Differenzas tra lo stato cellulare (cioè, sano vs malsana) si differenziano per la forza di quantificazione ΔΨ di mitocondri isolati in combinazione con agenti di disaccoppiamento, inibitori della catena respiratoria, inibitori e ionofori complessi, i quali provocano dissipazione del potenziale di membrana mitocondriale. Il sano mitocondri, maggiore è la variazione ΔΨ seguito al trattamento con inibitori mitocondriali, quindi la risposta dei mitocondri può essere usata come indicatore di (dis) funzione mitocondriale. L&#39;utilizzo di mitocondri isolati piuttosto che nella valutazione situ della funzione offre la prova definitiva che una patologia o trattamento modula direttamente modifiche alla organello 16-18. Mentre ci sono metodi in letteratura per isolare mitocondri da cellule in coltura, sono vaghi 17 e / o di utilizzare attrezzature specializzate 16. Questo protocollo descrive in dettaglio il metodo di isolamento ed èfacilmente adattabile ad altre linee cellulari, incluse tessuto primario e culture 13,14,19,20. Molti studi mitocondri isolati utilizzano gli stessi uncouplers mitocondriali e inibitori utilizzati in questo protocollo, ma con un elettrodo di Clark (21 è un esempio rappresentativo di numerose pubblicazioni in letteratura), che è ancora un pezzo molto specifico e specializzato di apparecchiature. Inoltre, questo metodo tradizionale ha limitazioni come la bassa velocità e di elevata complessità 22,23 e richiede una notevole quantità di mitocondri (~ 500 ug / reazione). In questo protocollo, la fluorescenza membrana sensing potenziale TMRE sonda viene usata in combinazione con un lettore di piastre a fluorescenza, che è una macchina standard in molti laboratori. TMRE è considerato poiché entra rapidamente cellule e mitocondri isolati e può essere utilizzato a basse concentrazioni 24. Le reazioni multiple possono rapidamente essere impostati in tandem e lotti analizzati con questo protocollo. Inoltre, la reaziones richiedono un gran piccola quantità di mitocondri isolati (~ 10 ug / reazione). Richiedendo meno materiale, campioni di tessuto o di colture cellulari più piccole possono essere utilizzate come punto di partenza per l&#39;isolamento mitocondri, più repliche o reazioni possono essere impostati e materiale potenzialmente sufficiente per altri esperimenti mitocondri isolati come la produzione di ATP, consumo di ossigeno, o l&#39;importazione saggi sono possibili.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:137px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1251</td>
			<td>Can use the potassium salt instead.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8304</td>
			<td>Can use the potassium salt instead.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trisma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Dilute down to 100uM as a working stock in ethanol and store at -20C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Valinomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0627</td>
			<td>Make in DMSO and use as a 5uM working stock. Store at -20C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sucrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCN</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td align="right">6379</td>
			<td>Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Highly toxic. Made in ethanol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Highly toxic. Made in ethanol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TMRE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8717-25mg</td>
			<td>Dilute 100uM stock with EB immediatley before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td>1x regular (high glucose).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pen/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3002101</td>
			<td>Store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-501F</td>
			<td>US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMSO</td>
			<td>SIgma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Protien Assay Dye (5x)</td>
			<td style="width:137px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:163px;">500-0006</td>
			<td>Any protein assay can substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">BSA</td>
			<td style="width:137px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">BP1600-100</td>
			<td>Make 2mg/mL stock in water for protein assay.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MTT powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2128</td>
			<td>Filter sterlize 5mg/mL stock made in PBS. Store aliquots at -20C; store at 4C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tergitol solution (NP-40)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NP40S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant Human IL-1B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PCH08014</td>
			<td>Once opened store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant Human TNF-alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC3015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IFN-gamma</td>
			<td style="width:137px;">Gibco</td>
			<td>PHC4031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Dulbeccos PBS (-/-)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:163px;">D8537</td>
			<td>Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytochrom c ELISA kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DTC0</td>
			<td>Human for HEK-293T cells.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Il trattamento di cellule HEK-293T con 200 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, e 75 ng / ml di IFN-γ (* 3) per 24-48 ore porta a quantità progressive di morte cellulare (Figura 1A ). La vitalità cellulare è stata valutata utilizzando test MTT e dimostra costantemente che non vi è ~ 10% di diminuzione della vitalità cellulare al trattamento con 24 ore e ~ 20% di diminuzione con il trattamento 48 ore. Le cellule trattate con concentrazioni simili (100 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, e 75 ng / ml I...

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Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Isolamento e analisi funzionale dei mitocondri da cellule in coltura e Tissue mouse

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

isolation-functional-analysis-mitochondria-from-cultured-cells-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

39.2K Views.  Elon University. Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress. 

Video: Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Isolamento e analisi delle cellule staminali ematopoietiche dalla placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

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Biologia

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Purificazione dei mitocondri da cellule di lievito

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissezione di giro dentato ippocampale di topo adulto

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolamento di primaria miofibroblasti da mouse e Colon Tessuto umano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Isolamento rapida e purificazione di mitocondri per il trapianto da tessuto Dissociazione e Filtrazione Differenziale

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

L&#39;isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Isolamento di miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità per misurazioni simultanee di transitori Ca2+ e corrente di calcio di tipo L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, which is regulated in response to cellular demands. The lipid molecule Coenzyme Q (CoQ) is essential in this process by transferring electrons to complex III in the electron transport chain (ETC) through constant oxidation/reduction cycles. Mitochondria status and, ultimately, cellular health can be assessed by measuring ETC oxygen consumption using respirometric assays. These studies are typically performed in established or primary cell lines that have been cultured for several days. In both cases, the respiration parameters obtained may have deviated from normal physiological conditions in&#160;any given organ or tissue.
Additionally, the intrinsic characteristics of cultured single fibers isolated from skeletal muscle impede this type of analysis. This paper presents an updated and detailed protocol for the analysis of respiration in freshly isolated mitochondria from mouse skeletal muscle. We also provide solutions to potential problems that could arise at any step of the process. The method presented here could be applied to compare oxygen consumption rates in diverse transgenic mouse models and study the mitochondrial response to drug treatments or other factors such as aging or sex. This is a feasible method to respond to crucial questions about mitochondrial bioenergetics metabolism and regulation.

Here, we describe a detailed method for mitochondria isolation from mouse skeletal muscle and the subsequent analysis of respiration by Oxygen Consumption Rate (OCR) using microplate-based respirometric assays. This pipeline can be applied to study the effects of multiple environmental or genetic interventions on mitochondrial metabolism.

Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo per saggi respirometrici

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow increases with decreasing diameter from arteries to arterioles that ultimately feed into capillaries. Due to their smaller size and location in the parenchyma, arterioles have been relatively understudied and with less reproducibility in findings than surface pial arteries. Regardless, arteriolar endothelial cell structure and function&#8212;integral to the physiology and etiology of chronic degenerative diseases&#8212;requires extensive investigation. In particular, emerging evidence demonstrates that compromised endothelial function precedes and exacerbates cognitive impairment and dementia.
In the parenchymal microcirculation, endothelial K+ channel function is the most robust stimulus to finely control the spread of vasodilation to promote increases in blood flow to areas of neuronal activity. This paper illustrates a refined method for freshly isolating intact and electrically coupled endothelial &#34;tubes&#34; (diameter, ~25 &#181;m) from mouse brain parenchymal arterioles. Arteriolar endothelial tubes are secured during physiological conditions (37 &#176;C, pH 7.4) to resolve experimental variables that encompass K+ channel function and their regulation, including intracellular Ca2+ dynamics, changes in membrane potential, and membrane lipid regulation. A distinct technical advantage versus arterial endothelium is the enhanced morphological resolution of cell and organelle (e.g., mitochondria) dimensions, which expands the usefulness of this technique. Healthy cerebral perfusion throughout life entails robust endothelial function in parenchymal arterioles, directly linking blood flow to the fueling of neuronal and glial activity throughout precise anatomical regions of the brain. Thus, it is expected that this method will significantly advance the general knowledge of vascular physiology and neuroscience concerning the healthy and diseased brain.

Intensive preparation of intact mouse cerebral endothelial &#34;tubes&#34; from cerebral parenchymal arterioles is illustrated for studying cerebral blood flow regulation. Further, we demonstrate the experimental strengths of this endothelial study model for fluorescence imaging and electrophysiology measurement of key cellular signaling pathways, including changes in intracellular [Ca2+] and membrane potential.

Isolamento e analisi funzionale dell'endotelio arteriolare del parenchima cerebrale del topo

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative stress has been suggested as a mechanism resulting in GEC dysfunction in the pathogenesis of some glomerular diseases. Historically the isolation of GECs from in vivo models has been notoriously challenging due to difficulties in isolating pure cultures from glomeruli. GECs have complex growth requirements in vitro and a very limited lifespan. Here, we describe the procedure for isolating and culturing conditionally immortalized GECs with fluorescent mitochondria, enabling the tracking of mitochondrial fission and fusion events. GECs were isolated from the kidneys of a double transgenic mouse expressing the thermolabile SV40 TAg (from the Immortomouse), conditionally promoting proliferation and suppressing cell differentiation, and a photo-convertible fluorescent protein (Dendra2) in all mitochondria (from the photo-activatable mitochondria [PhAMexcised] mouse). The stable cell line generated allows for cell differentiation after inactivation of the immortalizing SV40 TAg gene and photo-activation of a subset of mitochondria causing a switch in fluorescence from green to red. The use of mitoDendra2-GECs allows for live imaging of fluorescent mitochondria&#39;s distribution, fusion, and fission events without staining the cells.

The article describes the method for isolating conditionally immortalized glomerular endothelial cells from the kidneys of transgenic mice expressing the thermolabile simian virus 40 and photo-activatable mitochondria, PhAMexcised. We describe the procedure for glomeruli isolation from whole kidneys using beads, digestion steps, seeding, and culturing of GECs-CD31 positive.

Isolamento di cellule endoteliali glomerulari di topo condizionatamente immortalizzate con mitocondri fluorescenti

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...