Per iniziare, prendi le cellule U2OS coltivate con confluenza dal 60% al 70% e dividile usando lo 0,25% di tripsina-EDTA. Preparare le lastre da 60 millimetri aggiungendo vetrini coprioggetti rotondi da 13 millimetri. Piastra 400.000 celle in una piastra da 60 millimetri contenente più vetrini di copertura rotondi da 13 millimetri.
Quindi, rimuovere il terreno di coltura dalle piastre. Aggiungere il terreno di coltura contenente 25 micromolari di etoposide e incubare le cellule per 20 minuti, 1 ora e 3 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno dalle piastre.
Lavare le celle con PBS tre volte. Per fissare le cellule, aggiungere metanolo ghiacciato in volume sufficiente a coprire la superficie del vetrino coprioggetti e incubare per 10 minuti a 20 gradi Celsius. Quindi, lavare tre volte i vetrini coprioggetto con PBS e trasferirli in una camera di umidità.
Dopo aver prelevato il PBS, aggiungere da 30 a 40 microlitri di tampone di permeabilizzazione e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, lavare i vetrini di copertura tre volte con PBS. Quindi, tocca il PBS dai campioni.
Aggiungere da 30 a 40 microlitri di soluzione bloccante fornita nel kit PLA a ciascun vetrino coprioggetto. Incubare la piastra in una camera di umidità preriscaldata a 37 gradi Celsius per 1 ora. Ora diluire gli anticorpi primari nel diluente anticorpale fornito nel kit.
Dopo aver prelevato la soluzione bloccante, aggiungere la soluzione di anticorpi primari a ciascun vetrino coprioggetti e incubare a quattro gradi Celsius per una notte in una camera di umidità. Diluire le sonde meno e più da uno a cinque nel diluente anticorpale. Usa combinazioni come Asino anti-Topo MINUS con Asino anti-Capra PLUS e Asino anti-Topo MINUS con Asino anti-Coniglio PLUS.
Ora, picchiettare la soluzione di anticorpi primari e lavare una volta con TBST. Dopo aver picchiettato il TBST in eccesso, aggiungere 20 microlitri della soluzione della sonda PLA ai vetrini coprioggetti. Quindi, incubare nella camera di umidità preriscaldata a 37 gradi Celsius per 1 ora.
Diluire il tampone di legatura 5x in acqua ad alta purezza. Picchiettare la soluzione della sonda PLA e lavare una volta con TBST. Ora, aggiungere la ligasi alla soluzione di legatura a diluizione 1:40 immediatamente prima di applicarla ai campioni.
Incubare nella camera di umidità preriscaldata a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, diluire il tampone di amplificazione 5x in acqua ad alta purezza. Una volta rimossa la soluzione di legatura dai campioni, lavare i campioni una volta con TBST.
Aggiungere la polimerasi alla soluzione di amplificazione a diluizioni 1:80 immediatamente prima di applicarla ai campioni. Incubare nella camera di umidità preriscaldata a 37 gradi Celsius per 100 minuti. Picchiettare il tampone di amplificazione, quindi lavare due volte con il tampone SSC per 10 minuti ciascuna.
Dopo aver lavato i campioni due volte con PBS, aggiungere la soluzione di anticorpi primari a ciascun vetrino coprioggetti e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Al termine dell'incubazione, picchiettare la soluzione di anticorpi primari e lavare tre volte con TBST. Quindi, aggiungere la soluzione di anticorpi secondari a ciascun vetrino coprioggetti e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti.
Successivamente, lavare cinque volte con TBST, due volte con tampone SSC e due volte con tampone SSC 0,01x. Infine, acquisire immagini da diversi pozzetti o regioni di vetrini coprioggetto per evitare artefatti dovuti a incubazione non omogenea e salvare tutti i canali con lo stesso modello di nome.
