시작하려면 60%에서 70%의 밀도를 가진 배양된 U2OS 세포를 0.25%Trypsin-EDTA를 사용하여 분할합니다. 60mm의 둥근 13mm 커버 슬립을 추가하여 13mm 플레이트를 준비합니다. 플레이트 400, 여러 13 밀리미터 라운드 커버 슬립을 포함하는 60 밀리미터 플레이트의 000 셀.
그런 다음 플레이트에서 배양 배지를 제거합니다. 25 마이크로몰 에토포사이드를 함유한 배양 배지를 추가하고 20분, 1시간 및 3시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 후 플레이트에서 배지를 제거합니다.
PBS로 세포를 세 번 씻으십시오. 세포를 고정하려면 커버 슬립 표면을 덮을 만큼 충분한 부피로 얼음처럼 차가운 메탄올을 넣고 섭씨 20도에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS로 커버 슬립을 세 번 세척하고 습도 챔버로 옮깁니다.
PBS를 탭한 후 30-40 마이크로리터의 투과화 완충액을 추가하고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS로 커버 슬립을 세 번 세탁하십시오. 그런 다음 샘플에서 PBS를 탭합니다.
PLA 키트에 제공된 30-40 마이크로 리터의 차단 용액을 각 커버 슬립에 첨가하십시오. 섭씨 37도에서 예열된 습도 챔버에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다. 이제 키트에 제공된 항체 희석제에 1차 항체를 희석합니다.
차단 용액을 두드린 후 각 커버 슬립에 1차 항체 용액을 추가하고 습도 챔버에서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 항체 희석액에 마이너스 및 플러스 프로브 1 내지 5를 희석합니다. Donkey anti-Mouse MINUS와 Donkey anti-Goat PLUS 및 Donkey anti-Mouse MINUS와 Donkey anti-Rabbit PLUS와 같은 조합을 사용하십시오.
이제 1차 항체 용액을 제거하고 TBST로 한 번 씻어냅니다. 여분의 TBST를 두드린 후 20마이크로리터의 PLA 프로브 용액을 커버 슬립에 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도의 예열된 습도 챔버에서 1시간 동안 배양합니다.
5x ligation buffer를 고순도 물에 희석합니다. PLA 프로브 용액을 두드리고 TBST로 한 번 세척합니다. 이제 샘플에 적용하기 직전에 1:40 희석으로 ligase를 ligation 용액에 첨가합니다.
섭씨 37도의 예열된 습도 챔버에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 5x 증폭 버퍼를 고순도의 물에 희석합니다. 샘플에서 연결 용액이 제거되면 TBST로 샘플을 한 번 세척합니다.
중합효소를 샘플에 적용하기 직전에 1:80 희석된 증폭 용액에 추가합니다. 섭씨 37도의 예열된 습도 챔버에서 100분 동안 배양합니다. 증폭 버퍼를 두드린 다음 SSC 버퍼로 각각 10분씩 두 번 세척합니다.
PBS로 샘플을 2회 세척한 후 각 커버 슬립에 1차 항체 용액을 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 1차 항체 용액을 두드리고 TBST로 3회 세척합니다. 그런 다음 각 커버 슬립에 2차 항체 용액을 추가하고 실온에서 20분 동안 배양합니다.
그 후 TBST로 5회, SSC 완충액으로 2회, 0.01x SSC 완충액으로 2회 세척합니다. 마지막으로, 균질하지 않은 배양으로 인한 아티팩트를 방지하기 위해 다른 웰 또는 커버 슬립 영역에서 이미지를 획득하고 모든 채널을 동일한 이름 패턴으로 저장합니다.
