Dopo aver eseguito l'acquisizione del punto PLA per localizzare l'interazione proteica, aprire le immagini da diverse condizioni per regolare i parametri per l'analisi in ImageJ. Determinare e specificare questi parametri insieme ai dati nel programma macro. Per rimuovere lo sfondo, fare clic su Elabora e Sottrai sfondo.
Utilizzare la funzione di anteprima per testare diversi raggi della sfera di rotolamento. Per la rimozione del rumore, fare clic su Elabora, Disturbo e Smacchia. Quindi fare clic su Elabora e leviga nel menu del nucleo per applicare la funzione di levigatura e migliorare il riempimento.
Ora, fai clic su Immagine, quindi su Digita e seleziona 8 bit per convertire in un'immagine a 8 bit. Successivamente, regola la soglia andando su Immagine, Regola e, infine, Soglia. Regola la soglia per visualizzare tutti i nuclei o i punti nell'immagine, evitando la sovrasaturazione e il collasso delle strutture.
Inoltre, annota i valori e prova in immagini diverse. Per convertire in una maschera, fare clic su Elabora, Binario e Converti in maschera. Per il nucleo, fare clic su Elabora, Binario e Riempi fori, quindi su Processo, Binario e Spartiacque.
Per i punti PLA, fare clic su Processo, Binario e Bacino idrografico. Per contare i nuclei, misurare l'area o la lunghezza dei diversi nuclei per stimare la dimensione media. Utilizzare un valore approssimativo per analizzare le particelle facendo clic su Analizza e Analizza particelle.
Imposta la dimensione su 15 all'infinito e controlla le opzioni. Mostra maschera, visualizza risultati, cancella risultati, aggiungi a manager ed escludi sui bordi. Per contare i punti PLA, misurane l'area o il raggio per stimarne la dimensione media.
Per ogni ROI nel ROI Manager, fare clic su Analizza e analizza particelle. Imposta la dimensione su 0,02 a 3. Controlla le opzioni, mostra maschera, visualizza i risultati, cancella i risultati, riepiloga ed escludi sui bordi.
Salva i risultati mostrando il numero di punti per nucleo in ogni nucleo presente nell'immagine. L'interazione Nek4 Ku70 è aumentata nel nucleo dopo un danno al DNA dopo 20 minuti, un'ora e tre ore di trattamento con etoposide rispetto alle cellule di controllo e alle cellule trattate con DMSO. Il trattamento con etoposide ha aumentato significativamente l'interazione Nek5 topoisomerasi 2-beta rispetto al controllo DMSO.
La colorazione con Gamma-H2AX è aumentata dopo 20 minuti di trattamento con etoposide ed è rimasta elevata fino a tre ore, indicando una risposta sostenuta al danno del DNA.
