Questo esame è stato sostenuto dal National Institutes of concede sanità, AI074420-02, Investigator Award Burroughs Wellcome, Hirschl Scientist Award della carriera per BKC e dal Centro NSF per Biofotonica Scienza e Tecnologia, accordo Cooperativa PHY012099, e un premio Salute UCD sistema di ricerca per TH UCD CTSC NCRR ULRR024146.

Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata in <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1743">Hübner et al Science 323:. 1743-1747 (2009)</a> . 1. Panoramica Cellula-cellula diffusione del virus HIV è stato originariamente descritto utilizzando cellule Jurkat infette da HIV, come cellule del donatore e CD4 + linfociti T primari come cellule accettore 1,2,3. In questi studi, il virus è stato individuato nelle cellule fissate con colorazione degli anticorpi. Per tracciare il trasferimento del virus da cellula a cellula in cellule vive, abbiamo sfruttare una ricombinante, clone molecolare infettivo dell&#39;HIV chiamato HIV Gag-iGFP 4. Essa svolge la proteina verde fluorescente (GFP) inserito internamente nella proteina Gag tra i domini MA e CA. Questo clone molecolare di HIV mantiene infettività senza la necessità di virus helper. Particelle virali fatto da questo clone stechiometricamente sono caricati con una proteina fluorescente verde, fornendo un forte segnale di fluorescenza per il monitoraggio di assemblaggio virale e il trasferimento tra le cellule. Quando utilizzato in combinazione con inerti cellula-tracking coloranti fluorescenti, le cellule destinatario può essere discriminato dalle cellule del donatore di input, e permettendo di visualizzare il trasferimento del virus da una cellula T infetto a una cellula T non infetti 5. Formazione di sinapsi virologici e il trasferimento del virus da una cellula all&#39;altra può essere osservata nelle cellule viventi mentre sono coltivate in un contenitore sigillato, gas-permeabili camera di imaging. (Giorno 1) 2. Preparazione di HIV Gag-iGFP transfettati cellule T Jurkat <ol><li> Preparare il CD4 umano + T linea cellulare Jurkat (ATCC, Manassas, VA) con cura mantenendo le cellule ad una concentrazione tra 2 x x 10 5 e 8 10 5 cellule / ml in Jurkat cultura dei media (RPMI 1640, 10% di siero fetale bovino, 100 unità / ml penicillina e 100 mg / ml streptomicina). La chiave del successo: la cultura delle cellule Jurkat a concentrazioni superiori a 8 x 10 5 cellule / ml si tradurrà in una riduzione di efficienza di trasfezione. Nota: La transfezione Gag di HIV-iGFP DNA provirale nelle cellule T, come descritto di seguito, i risultati nella produzione di una capaci di replicazione del virus dell&#39;immunodeficienza umana. Come tale, tutte le operazioni dovranno essere effettuate esclusivamente da personale addestrato in laboratorio certificato livello di biosicurezza 2 + o biosicurezza di livello 3 (BL2 + / BL3) camere colture di tessuti. Lavora con infettivo nelle strutture di imaging deve essere approvata dal vostro ufficio locale istituzionali biosicurezza. </li><li> Trasfezione le Jurkats con il plasmide virale, l&#39;HIV Gag-iGFP con il metodo nucleofection Amaxa (Lonza, Walkersville, MD). Pellet 5 x 10 6 cellule per centrifugazione per 10 min a 150 x g. Aspirare il surnatante e lavare le cellule in soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS). Centrifugare le cellule e risospendere il pellet a 97 ml di pre-riscaldato, V soluzione nucleofector contenente supplemento del produttore. Aggiungere tre ml di endotossina libero HIV Gag-iGFP plasmide (1 mg / mL) alla sospensione cellulare e mescolare delicatamente. Trasferire la sospensione cellulare ad una cuvetta e nucleofect utilizzando il programma S-18. Trasferire immediatamente le cellule a 3 ml di media cultura preriscaldata Jurkat senza antibiotici. </li><li> Per preparare cellule CD4 + obiettivo per sinapsi virologica, si ottengono cellule mononucleari del sangue periferico da buffy cappotti usando uno standard di Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Svezia) il protocollo. Cellule T CD4 + sono poi negativamente selezionati utilizzando un kit magnetico isolamento tallone (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Questi possono essere memorizzati in criogenicamente N2 liquido in aliquote di 5 x 10 6 cells/500 l di mezzi di congelamento (90% fetale bovino DMSO serum/10%). Scongelati CD4 + primaria cellule T sono coltivate in RPMI 10% FBS, integrata con 10 unità / ml di IL-2. </li></ol> (Giorno 2) 3. Recupero di cellule vive da Jurkats transfettati con l&#39;HIV Gag-iGFP e colorazione delle cellule bersaglio con tinture fluorescenti <ol><li> Consentire alle cellule Jurkat a riprendersi dalla transfezione durante la notte. Quindi rimuovere i detriti cellulari per centrifugazione su un gradiente di materiale Hypaque Ficoll densità. Dispensare 1,5 ml di Ficoll-Paque al fondo di un tubo da 15 ml. Delicatamente sovrapposizione questo materiale con il gradiente Jurkats transfettate in un volume di 5 ml di RPMI. Centrifugare le cellule a 400 xg per 20 minuti a temperatura ambiente con il freno. Rimuovere con attenzione le cellule da parte dei media / Ficoll interfaccia utilizzando una pipetta. Trasferirli in un nuovo tubo 15 ml. Diluire le cellule con RMPI ad un volume totale di 15 ml e centrifugare a 300 xg per 10 min. Risospendere il pellet in 3 ml di terreni di coltura Jurkat in ben 2 centimetri (6-pozzetti) e ritornare le cellule al tessuto culturale incubatore. </li><li> Per distinguere le cellule bersaglio dalle cellule del donatore nella cellula-cellula esperimenti di trasferimento abbiamo prelabel le cellule CD4 + bersaglio con coloranti fluorescenti. Primario delle cellule CD4 + T sono contrassegnati anche l&#39;zione prima dell&#39;uso. Abbiamo avuto ottimi cellule T successo etichettatura sia con CellTracker e coloranti CellTrace (Invitrogen, Carlsbad, CA). Mentre la concentrazione di colorante e tempi di incubazione devono essere ottimizzati a seconda del colorante particolare tipo di cellule, un protocollo di rappresentante segue. Pellet di 4 x 10 6 cellule CD4 + T primarie facendo girare a 400 xg per 10 min. Lavare le cellule con 5 ml di PBS e risospendere in 2 ml di PBS. Aggiungi CellTracker Orange (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) ad una concentrazione finale di 1,5 mM e incubare a 37 ° C per 20 min. Aggiungere 8 ml di media Jurkat completo e centrifugare a 400 xg per 10 min. Risospendere le cellule in 3 ml di mezzi di comunicazione completo integrato con 10 unità / ml di IL-2 e il luogo nel tessuto della cultura incubatore durante la notte. </li></ol> (Giorno 3) 4. Monitoraggio Cell-per-cell trasferimento di HIV Gag-iGFP dell&#39;immagine in tempo reale utilizzando cellule Noi abitualmente uso HIV Gag-iGFP cellule Jurkat trasfettate 48 ore dopo la trasfezione. Tuttavia, abbiamo utilizzato con successo le cellule già da 24 ore, e non più tardi di 72 ore dopo la trasfezione. <ol><li> Circa 48 ore dopo la trasfezione, HIV Gag-iGFP Jurkats esprimono sono contati, lavati con CO 2-media indipendenti (Invitrogen, Carlsbad, CA), e risospesi in vivo delle cellule e pubblicitario (CO 2 media indipendenti, il 10% siero fetale bovino, 100 U / ml penicillina e 100 mg / ml streptomicina, 10 unità / mL di IL-2) ad una concentrazione di 1-3 x 10 7 cellule / ml. </li><li> In modo simile, lavare e risospendere etichettato CD4 + primaria cellule T ad una concentrazione di 1-3 x 10 7 cellule / ml in live media di imaging cellulare. </li><li> Mix HIV Gag-iGFP transfettate Jurkats con CD4 + linfociti T primari con un rapporto 1:2 o 1:3 e caricare in una cultura tessuto trattato, gas permeabili, microchamber (Ibidi, Verona, WI). Per esempio, mix 20 ml di HIV-Gag iGFP Jurkats transfettate con 40 ml di etichettate CD4 + linfociti T primari. Carico di 50 ml di questa miscela in una camera Ibidi e sigillare la camera con spine. Fissare le spine avvolgendo la spina / interfaccia camera Ibidi con parafilm. </li></ol> 5. Considerazioni per le piattaforme di microscopia: disco rotante di imaging confocale Dopo aver caricato una camera di imaging Ibidi con le cellule, abbiamo immediatamente montare il dispositivo su un microscopio ottico invertito (iX71 Olympus, Center Valley, PA). La camera Ibidi dovrebbe essere trasferito al microscopio solo BL2 + personale qualificato laboratorio di indossare indumenti appropriati. Anche se vivo a celle di imaging utilizza comunemente camere di incubazione costosi da mantenere un ambiente stabile a 37 ° C, questo è stato realizzato utilizzando un calorifero semplice ed economico termostatica (ASI 400, Nevtek, Williamsville VA) insieme a una di tipo T punta della termocoppia montato accanto al il campione di feedback temperatura corretta. Abbiamo trovato con CO 2-media indipendenti ci permette di mantenere alta la vitalità delle cellule, evitando l&#39;uso di una camera di CO 2. Per attenuare gli piattaforma contro le fluttuazioni di temperatura nella stanza e per bloccare Sala luce di fondo, un grande velo nero è drappeggiato su tutto il microscopio / riscaldatore configurazione creando una sacca d&#39;aria isolante intorno al sistema. Questo riduce notevolmente variazione di temperatura e di temperatura associati legati deriva campione, ma necessita di pre-riscaldamento per 30 minuti prima del montaggio del campione. 6. Acquisizione dati, trasferimento e Image Processing Le immagini sono prese utilizzando un obiettivo 60x 1,42 olio NA immersione (UPlanApo N, Olympus), come l&#39;apertura ad alta numerica (NA) migliora notevolmente la risoluzione. Per creare immagini 3D confocale, la scansione viene eseguita da un&#39;unità disco rotante confocale (CSU-10, Yokagawa, Giappone) che utilizza contemporaneamente&gt; 800 punti confocale di aumentare notevolmente la velocità di scansione. Per completare la sua velocità, la CSU-10 è accoppiato con un elevata sensibilità elettroni moltiplicando charged-coupled device (EMCCD, ixon + 897, Tecnologie Andor, Irlanda) fotocamera per consentire veloci, di immagini a bassa luce che riduce sia photobleaching e fototossicità. La sorgente luminosa a fluorescenza è un multi-lunghezza d&#39;onda ARKR agli ioni di gas di laser (Innova 70C, Coherent, Santa Clara), dove la lunghezza d&#39;onda desiderata (488 nm) e la potenza del laser misurata a destra prima l&#39;obiettivo microscopio (&lt;1 mW) vengono selezionati da un acusto- filtro ottico sintonizzabile (AOTF), (Tecnologie Andor). Per ridurre ulteriormente photobleaching ed estendere il tempo totale di imaging, il AOTF rapidamente (microsecondi) si spegne il fascio laser ogni volta che la fotocamera è attiva (10-20 ms), mentre l&#39;immagine appena acquisita viene consegnato dal CCD (15-30 esposizione ms) al computer. La luce laser viene accoppiato al sistema utilizzando un disco rotante quad 405/488/568/647 banda specchio dicroico (Semrock, Rochester, NY). Emissione di fluorescenza viene filtrato con un filtro passa-banda 525/50 (Semrock) all&#39;interno di una ruota portafiltri (Ludl prodotti elettronici, Hawthorne, NY) montato bra la fotocamera EMCCD e l&#39;unità confocale disco rotante. Tutto l&#39;hardware e l&#39;acquisizione, tra cui un z-stadio (Mad Labs Città, Madison, WI), sono controllati dalla iQ Andor v1.8 software. Per massimizzare la velocità di acquisizione a circa 1,2-1,9 stack seconda immagine 3D, si taglia la zona di registrazione della fotocamera del EMCCD è scesi a immediate vicinanze della cellula-coppia. Inoltre, a scapito di qualche informazione in z, z-un grande passo tra 0,45-0,75 micron può essere usato per velocizzare l&#39;acquisizione. Imaging in queste condizioni può durare fino a 6 ore - con continuo segmenti 20-60 minuti - con photobleaching minima. Complessivamente, ogni segmento di dati occupa tipicamente 5-20 Gb di spazio, come decine di migliaia di immagini sono tratte. Per facilitare il trasporto e l&#39;analisi dei file di dati di grandi dimensioni, ogni set di acquisizione deve essere scomposto e esportati come 1 Gb segmenti di file immagine TIFF utilizzando il software v1.8 Andor iQ. Da qui, molti pacchetti software eccellenti sono disponibili per l&#39;analisi delle immagini, come ad esempio Metamorph, Volocity e ImageJ (si consiglia la sua variazione Figi). Quando due marcatori fluorescenti devono essere monitorati, abbiamo registrare simultaneamente entrambi senza rallentare l&#39;acquisizione utilizzando una &quot;modalità split screen.&quot; Entrambi i marcatori sono eccitati da due diverse linee laser ARKR in una sola volta (spesso 488 e 568 nm). Inseriti direttamente prima che la fotocamera EMCCD è un&#39;immagine splitter (OptoSplit II, Cairn, Kent, UK) che separa le due immagini diverse. Ogni immagine viene poi filtrata in modo indipendente con filtri a fluorescenza (Semrock) e proiettate fianco a fianco la fotocamera in una sola volta creando l&#39;effetto &quot;split-screen&quot;. Questo sarebbe poi richiedere il ritaglio manuale e l&#39;allineamento delle immagini più avanti in elaborazione delle immagini. 7. Considerazioni per la elaborazione delle immagini e analisi dei dati Noi di solito effettuare analisi di immagine con Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) su computer Macintosh (Apple, Inc). Disco rotante immagini di microscopia laser confocale vengono prima corretti per la loro intensità per correggere photobleaching, poi deconvolved con Volocity. Misure di intensità e il monitoraggio di puncta Gag è effettuata con il modulo Quantificazione Volocity. Per i set di immagini in cui il movimento relativo ad un pre-formata sinapsi deve essere calcolato, un algoritmo di tracciamento automatico è impiegata che segue il pulsante sinaptica durante l&#39;intera sequenza. Ispezione manuale di regioni di interesse definito dal software autotracking deve essere eseguito per confermare che il software è correttamente rintracciato l&#39;oggetto desiderato. Per gli oggetti in cui il contrasto con gli oggetti circostanti è troppo debole, il tracking manuale può essere eseguita su un fotogramma per fotogramma. Il pacchetto software Volocity permette l&#39;esportazione di posizione XYZ, volume e segnale integrato all&#39;interno gli oggetti desiderati. La distanza dalla sinapsi e la velocità dell&#39;oggetto monitorati sono calcolati normalizzando i movimenti al centro del bottone sinaptico. 8. Rappresentante Risultati Entro 10 a 15 minuti di miscelazione si dovrebbe essere in grado di visualizzare l&#39;HIV Gag-iGFP cellule Jurkat che esprimono aderenti al CD4 + linfociti T primari. Imaging questi coniugati, si possano valutare i movimenti di puncta Gag nelle cellule infette e nelle cellule bersaglio dopo synaspe. Si può osservare il movimento di Gag-iGFP puncta all&#39;interno delle cellule bersaglio poco dopo la sinapsi si formano.

<ol>
	<li>Blanco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+level+of+coreceptor-independent+HIV+transfer+induced+by+contacts+between+primary+CD4+T+cells.">High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells.</a> J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).</li><li>Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+human+immunodeficiency+virus+replication+in+mobile+lymphocytes.">Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes.</a> J Virol. 81, 1000-1012 (2007).</li><li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced,+actin-dependent+synapse.">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J Exp Med. 199, 283-293 (2004).</li><li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent,+fluorescently+tagged+HIV-1.">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> J Virol. 81, 12596-12607 (2007).</li><li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+video+microscopy+of+HIV+transfer+across+T+cell+virological+synapses.">Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses.</a> Science. 323, 1743-1747 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Descriviamo qui un metodo semplice per visualizzare il trasferimento del virus da cellula-cellula. Una recente ricerca del nostro laboratorio e altri &#39;suggerisce che ciò potrebbe essere la modalità prevalente di diffusione dell&#39;HIV tra le cellule T. Il metodo qui descritto utilizza una forma ricombinante del virus HIV, chiamato HIV Gag-iGFP che veicola una geneticamente codificato tag proteina fluorescente verde nel centro della proteina strutturale, Gag. A causa degli elevati livelli di GFP prodotto in ogni particella del virus, questo clone capaci di replicazione dell&#39;HIV consente ai ricercatori di tracciare le particelle del virus individuali in tempo reale. Questo virus dovrebbe essere particolarmente utile negli studi riguardanti il ​​trasferimento di montaggio e cellula-cellula del virus HIV. Il trasferimento del virus HIV da cellula-cellula di trasferimento è altamente efficiente. Nel corso di una tre ore di co-cultura, di routine vedere virus trasferiti al 20-30% di cellule primarie T come valutato mediante citometria di flusso. Efficienze simili sono qualitativamente visto durante l&#39;imaging cellulare dal vivo. Virale infetta le cellule T iniziare formando sinapsi con le cellule non infette primarie T quasi immediatamente dopo l&#39;inizio della co-coltura. Interessante, non tutte le cellule primarie T sono in grado di interagire con infezione da HIV cellule Jurkat nonostante le interazioni forzata con pinzette laser (osservazioni non pubblicate, GM). Gag di HIV-iGFP sarà senza dubbio utile per determinare sottoinsiemi di cellule T che sono più suscettibili di cellula-cellula trasferimento, sia in vitro che in vivo.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Jurkat T Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leukocyte buffy coats from whole blood</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New York Blood Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nucleofector System and Solution V</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EndoFree Maxi Prep Kits</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HIV Gag-iGFP plasmid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chen Laboratory</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ficoll-Paque</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Celltracker/CellTrace Dyes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CO2-Independent Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ibidi</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Olympus IX-71 Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlanApo N 1.42NA 60X oil objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Innova 70C ArKr ion gas laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coherent </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CSU-10 Nipkow-type spinning disk confocal unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yokogawa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beamsplitter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>525/50 bandpass filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>iXon+ 897 electron-multiplied charged coupled devise camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Andor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ASI 400 Thermostatic Heater</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nevtek</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualizing cell-to-cell transfer of hiv using fluorescent clones of hiv and live confocal microscopy

Fondendo la proteina fluorescente verde a loro proteine ​​preferiti, i biologi hanno ora la possibilità di studiare viventi complessi processi cellulari utilizzando la microscopia a fluorescenza video. Per seguire i movimenti della proteina del virus di immunodeficienza umana nucleo durante cellula-cellula trasmissione del virus dell&#39;immunodeficienza umana, abbiamo GFP-tagged la proteina Gag nel contesto di un clone molecolare infettivo dell&#39;HIV, chiamato HIV Gag-iGFP. Studiamo questo clone virale usando la microscopia confocale video. Nel seguente esperimento visualizzate, abbiamo trasfettare un essere umano linea di cellule T con l&#39;HIV Gag-iGFP, e usiamo fluorescente + CD4 non infetti le cellule T di servire come cellule bersaglio per il virus. Utilizzando le etichette diverse fluorescenti si può facilmente seguire la produzione virale e il trasporto attraverso le strutture intracellulari chiamati sinapsi virologica. Semplice gas permeabili camere di imaging ci permettono di osservare dal vivo le sinapsi con microscopia confocale da minuti a giorni. Questi approcci possono essere usati per tracciare proteine ​​virali che si muovono in da una cellula all&#39;altra.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy at JoVE.com

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Questo esperimento viene visualizzata una guida per l&#39;utilizzo fluorescente un clone molecolare di HIV per vivere esperimenti di imaging confocale.

Visualizzazione Cell-per-cell trasferimento del virus HIV usando cloni fluorescenti di HIV e Live Microscopia confocale

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

visualizing-cell-to-cell-transfer-hiv-using-fluorescent-clones-hiv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.4K Views.  Mount Sinai School of Medicine. Questo esperimento viene visualizzata una guida per l'utilizzo fluorescente un clone molecolare di HIV per vivere esperimenti di imaging confocale.

Video: Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, the LTR is also responsive to cellular activation states and to the local chromatin activity where the integration has occurred. This can result in high HIV-independent activity, and has restricted the usefulness of LTR-based reporter to mark HIV positive cells 1,2,3. Here, we constructed an expression lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, numerous HIV DNA sequences that include the Rev-response element and HIV splicing sites 4,5,6. The vector was incorporated into a lentiviral reporter virus, permitting highly specific detection of replicating HIV in living cell populations. The activity of the vector was measured by expression of the green fluorescence protein (GFP). The application of this vector as reported here offers a novel alternative approach to existing methods, such as in situ PCR or HIV antigen staining, to identify HIV-positive cells. The vector can also express therapeutic genes for basic or clinical experimentation to target HIV-positive cells.

We have developed a lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, the Rev-response element (RRE) that can regulate reporter gene expression in an HIV-1 Tat- and Rev-dependent fashion. The vector permits the specific detection of replicating HIV in living cells via the expression of GFP.

Marcatura specifica di HIV-1 Cellule positive con un Rev-dipendente Vector lentivirali Esprimendo la proteina fluorescente verde

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferenza genotipica del virus HIV-1 Tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Amplificazione e quantificazione di HIV-1 RNA in soggetti affetti da HIV con una carica virale inferiore il limite di rilevamento da parte di Standard saggi clinici

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein complexes and assemblies. In fact, single particle electron microscopy1 and two-dimensional (2D) electron crystallography2 have become relatively routine methodologies and a large number of structures have been solved using these methods. At the same time, image processing and three-dimensional (3D) reconstruction of helical objects has rapidly developed, especially, the iterative helical real-space reconstruction (IHRSR) method3, which uses single particle analysis tools in conjunction with helical symmetry. Many biological entities function in filamentous or helical forms, including actin filaments4, microtubules5, amyloid fibers6, tobacco mosaic viruses7, and bacteria flagella8, and, because a 3D density map of a helical entity can be attained from a single projection image, compared to the many images required for 3D reconstruction of a non-helical object, with the IHRSR method, structural analysis of such flexible and disordered helical assemblies is now attainable.
In this video article, we provide detailed protocols for obtaining a 3D density map of a helical protein assembly (HIV-1 capsid9 is our example), including protocols for cryo-EM specimen preparation, low dose data collection by cryo-EM, indexing of helical diffraction patterns, and image processing and 3D reconstruction using IHRSR. Compared to other techniques, cryo-EM offers optimal specimen preservation under near native conditions. Samples are embedded in a thin layer of vitreous ice, by rapid freezing, and imaged in electron microscopes at liquid nitrogen temperature, under low dose conditions to minimize the radiation damage. Sample images are obtained under near native conditions at the expense of low signal and low contrast in the recorded micrographs. Fortunately, the process of helical reconstruction has largely been automated, with the exception of indexing the helical diffraction pattern. Here, we describe an approach to index helical structure and determine helical symmetries (helical parameters) from digitized micrographs, an essential step for 3D helical reconstruction. Briefly, we obtain an initial 3D density map by applying the IHRSR method. This initial map is then iteratively refined by introducing constraints for the alignment parameters of each segment, thus controlling their degrees of freedom. Further improvement is achieved by correcting for the contrast transfer function (CTF) of the electron microscope (amplitude and phase correction) and by optimizing the helical symmetry of the assembly.

This article describes a method to obtain a three-dimensional (3D) structure of helically assembled molecules using cryo-electron microscopy. In this protocol, we use HIV-1 capsid assemblies to illustrate the detailed 3D reconstruction procedure for achieving a density map by the iterative helical real-space reconstruction method.

Struttura del virus HIV-1 Assemblee Capsidico da Cryo-microscopia elettronica e iterativo ricostruzione elicoidale reale spazio

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

In uncoating vitro di HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dell&#39;integrasi

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Valutazione conformazionale di HIV-1 trimeric busta glicoproteine ​​Utilizzando una base di Cell-ELISA Saggio

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolamento di esosomi dal plasma di HIV-1 individui positivi

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

Migrazione phagosome e velocità misurata in Live primarie macrofagi umani infettati con HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Misurazione<em&gt; In Vitro</em&gt; Integrazione di attività del virus HIV-1 preintegrazione Complessi

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Visualizzazione Cell-per-cell trasferimento del virus HIV usando cloni fluorescenti di HIV e Live Microscopia confocale

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Marcatura specifica di HIV-1 Cellule positive con un Rev-dipendente Vector lentivirali Esprimendo la proteina fluorescente verde

Inferenza genotipica del virus HIV-1 Tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del V3

Amplificazione e quantificazione di HIV-1 RNA in soggetti affetti da HIV con una carica virale inferiore il limite di rilevamento da parte di Standard saggi clinici

Struttura del virus HIV-1 Assemblee Capsidico da Cryo-microscopia elettronica e iterativo ricostruzione elicoidale reale spazio

In uncoating vitro di HIV-1 Cores

Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dell'integrasi

Valutazione conformazionale di HIV-1 trimeric busta glicoproteine Utilizzando una base di Cell-ELISA Saggio

Isolamento di esosomi dal plasma di HIV-1 individui positivi

Migrazione phagosome e velocità misurata in Live primarie macrofagi umani infettati con HIV-1

Misurazione

Visualizzazione Cell-per-cell trasferimento del virus HIV usando cloni fluorescenti di HIV e Live Microscopia confocale

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Struttura del virus HIV-1 Assemblee Capsidico da Cryo-microscopia elettronica e iterativo ricostruzione elicoidale reale spazio

In uncoating vitro di HIV-1 Cores

Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dell'integrasi

Valutazione conformazionale di HIV-1 trimeric busta glicoproteine ​​Utilizzando una base di Cell-ELISA Saggio

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Migrazione phagosome e velocità misurata in Live primarie macrofagi umani infettati con HIV-1

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