Ringraziamo J. Sedgewick per l&#39;assistenza nella creazione del microscopio confocale a catturare immagini di grani d&#39;argento, sostenuto in parte dal NIH assegni di ricerca AI48484 (ATH), AI20048 (RA), e AI066314 (CJM), Centro Nazionale per la Ricerca Risorse sovvenzione. RR00169 (CNPRC, University of California, Davis).

Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata in <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1726">Li et al. Science 323, 1726-1729 (2009)</a> . Combinati in colorazione tetramero situ ed in situ di ibridazione (ISTH) procedure Procedure ISTH può essere diviso in 4 fasi: 1) colorazione IST di antigene-specifiche cellule CD8 + T nei tessuti, 2) ISH per rilevare infettati da virus-RNA + cellule; 3) confocale di immagini microscopiche delle TSI macchiati di cellule e virus-RNA + cellule; 4) analisi delle immagini, compresa la costruzione di montaggi di immagini e mappatura delle tetramero + e virus a RNA + cellule. 1. Colorazione della TSI antigene-specifiche cellule T CD8 + in sezioni di tessuto. <ol><li> Tagliare i tessuti freschi in 200 sezioni um di spessore utilizzando un vibratome o bisturi. </li><li> Freddo bagno vibratome con PBS sterile-H e freddo a 0-2 ° C. Impostare l&#39;angolo vibratome lama ad una piuttosto ripido 27 °. Quando possibile, mantenere i tessuti raffreddata in ghiaccio al fine di minimizzare la degradazione. Tessuto fresco è anche più facile la sezione con un vibratome quando è freddo. </li><li> Taglio del tessuto con le forbici o bisturi chirurgico in piccole largo circa 0,5 centimetri dello 0,25 pezzi cm di altezza. Mettete i pezzi di tessuto in una pesa barca o piccolo piatto e coprire con ~ 40 ° C fuso PBS 4% tamponata bassa temperatura di fusione agarosio. Assicurarsi che il tessuto è in contatto con il fondo del piatto. Spingere verso il basso i pezzi di tessuto che galleggino. Solidificare su ghiaccio. Questo richiede di solito 3-5 minuti. </li><li> Cappotto vibratome blocco di tessuto con la colla Loctite. Tagliare agarosio intorno al tessuto con un bisturi, e quindi utilizzando una pinza, trasferire accuratamente il tessuto fragile agarosio incorporato ad un blocco vibratome rivestito in colla. Non spostare il pezzo di tessuto una volta che è impostato sul blocco dei tessuti. Lasciare asciugare circa 10 minuti in ghiaccio. </li><li> Montare blocco di tessuto nel vibratome e tagliare il tessuto in 200um sezioni spesse con un morto a bassa velocità in avanti e ampiezza relativamente alta. Impostazioni di velocità e ampiezza varia con ogni vibratome. Se un vibratome non è disponibile, o il tessuto non è suscettibile di vibratome sezionare, tagliare i tessuti a strisce sottili utilizzando un bisturi. </li><li> Trasferire le sezioni con un pennello in una camera tessuto situato nel pozzetto di una 24-pozzetti di coltura contenente 1 ml di acqua refrigerata PBS-H. Mettere un massimo di quattro sezioni di tessuto in ciascuna camera dei tessuti. Etichettare il coperchio della piastra di coltura con informazioni sui campioni sperimentali e coperchio sicuro alla piastra con un elastico. </li><li> In alternativa, per i tessuti che non tagliano bene con vibratome, come intestino, può tagliare il più sottile possibile con strisce lama di bisturi o un rasoio. Mettere una sola sezione per bene per sezioni tagliate bisturi. </li><li> Procedere alla colorazione subito dopo finito il taglio dei tessuti. Tenere sezioni refrigerate a minimizzare il degrado in ogni momento fino fissi. Non lasciare asciugare sezioni. Mantenere sezioni in refrigerata PBS sterile-H. </li><li> Incubare le sezioni di tessuto per tutta la notte con 0,5 mg / ml tetrameri coniugato con FITC. Può includere il mouse o non coniglio anticorpi diretti a epitopi extracellulari in questa incubazione, ad esempio, gli anticorpi anti-CD8, diluito 1:200 in blocco soluzione. Usare 1 ml di soluzione per ogni bene per questo e per tutte le incubazioni successive ed eseguire questo e tutte le successive incubazioni a 4 ° C con piastre su una piattaforma oscillante. Tenere camere di tessuto contenente diversi campioni sperimentali separati da almeno un pozzo vuoto per evitare la contaminazione incrociata di soluzioni nei passaggi successivi. </li><li> Dopo l&#39;incubazione primaria, lavare sezioni con PBS freddo-H due volte (2X) per 20 minuti ciascuno. A tale scopo, trasferendo le camere tessuto a un altro di 24 e piastra di coltura contenente refrigerata PBS-H. Fare attenzione a non sgocciolare il contenuto da un campione sperimentale in un altro, quando ci si sposta camere di tessuto. Per tutte le incubazioni e lavaggi successivi allo stesso modo il trasferimento alle camere dei tessuti di un piatto pulito contenente la soluzione appropriata. Monitor sezioni in camere di tessuto durante la procedura per assicurarsi che le sezioni non rimanere bloccato ai lati delle camere di tessuto. </li><li> Sezioni fissare con PBS fresco tamponata al 4% paraformaldeide per 2 ore a temperatura ambiente. Lavare con PBS freddo-H 2X 5 minuti ciascuno. </li><li> Incubare con coniglio anti-FITC anticorpi, ad esempio Biodesign1: 10.000, nel bloccare soluzione per 1-3 giorni. Per il co-etichettatura, possono includere non coniglio anticorpi diretti a epitopi intracellulare in questa incubazione pure. Per questa opzione, espongono epitopi se necessario, e permeano e bloccare le cellule prima della seconda incubazione. </li><li> Se gli anticorpi con la regia di epitopi intracellulari che richiedono il recupero dell&#39;antigene dalla fissazione di formaldeide, espongono epitopi facendo bollire 3 volte in Urea 0.01M, 10 secondi ogni volta, in un forno a microonde. Attendere 2 minuti tra ogni riscaldamento. State molto attenti come soluzione bollente può forzare le sezioni fuori dei pozzetti. In questo caso, utilizzare un pennelloper spingere sezioni dai lati della camera di tessuto o dal coperchio della piastra posteriore nella parte inferiore della camera di tessuto appropriati. Se gli anticorpi non richiedono il recupero dell&#39;antigene omettere questo passo. </li><li> Se si utilizza anticorpi diretti a epitopi intracellulare, prima della seconda incubazione, permeabolize e bloccare le cellule nelle sezioni di tessuto con PBS-H contenente 0,3% Triton X-100, e 2% di siero normale di capra per un&#39;ora. Quindi eseguire incubazioni anticorpi rimanenti in PBS-H contenente 0,3% Triton X-100 e 2% siero di capra normale. </li><li> Dopo la seconda incubazione, lavare sezioni in PBS-H per 20 minuti a diverse ore. Ripetete due volte per un totale di tre lavaggi. Eseguire una incubazione finale con appropriati anticorpi fluorescente. Per esempio, capra anti-coniglio-Cy3 e capra anti-topo-Alexa 488 diluito 1:1000 nel bloccare ogni soluzione. Incubare per 1-3 giorni. Tenere sezioni protette dalla luce, avvolgendo le piastre in carta stagnola in questa incubazione e, successivamente, come la luce fluorofori spegne. </li><li> Lavare le sezioni in PBS-H per 20 minuti a diverse ore. Ripetete due volte per un totale di tre lavaggi. </li><li> Per TSI combinato con ISH post-fix sezioni di post-fix in paraformaldeide 4% per 1 ora a tetrameri sicuro e gli anticorpi a posto, quindi risciacquare sezioni con PBS-H di nuovo e montare. </li><li> Utilizzare un pennello per trasferire sezioni ad un vetrino da microscopio. Cappotto ogni sezione con glicerolo / gelatina contenenti 4mg/ml n-propil gallato o altri supporti di montaggio che contiene un conservante fluoroforo e coprire con un coprioggetto. Conservare i vetrini a luce contenitore scivolo protetta a -20 °. Sciacquare piastre di coltura dei tessuti e rimuovere le etichette sui coperchi con l&#39;alcol. Possibile riutilizzare piatti. </li><li> Analizzare sezioni di tessuto colorato con un microscopio confocale. Poi può procedere ISH. </li></ol> 2. Rileva infettati da virus-RNA + cellule ibridazione in situ. Questo nel protocollo ibridazione in situ è stato modificato dalla nostra protocolli precedentemente pubblicato con il 4,5 come segue: <ol><li> Re-cut 5-8-micron di spessore-sectionss di spessore in situ sezioni colorate tetramero. <ol><li> 200-micron di spessore-sezioni sono riscaldate a 70 ° C per 5 minuti per staccare la sezione dalla diapositiva. </li><li> La sezione è poi incorporato in ottobre in ghiaccio secco. </li><li> 8-micron sezioni sono tagliate con un criostato dalle sezioni di spessore e aderito alle diapositive silanizzata. </li><li> Le diapositive possono essere conservati a -80 ° C in una scatola sigillata per la successiva ibridazione in situ. </li></ol></li><li> Ibridazione in situ <ol><li> Reidratare le sezioni di tessuto immergendo i vetrini per 3 minuti ciascuna nel 90% di etanolo e DEPC-acqua trattata. </li><li> Permeabilize sezioni di tessuto con il riscaldamento in tampone citrato 10mM (pH 6,0) a 98 ° C a bagnomaria per 15 minuti. </li><li> Sezioni di tessuto fresco a temperatura ambiente per 20-30 min. </li><li> Lavare due volte in DEPC trattati con acqua per 3 minuti. </li><li> Acetilato sezione di tessuto immergendo scivola di 0,25% anidride acetica a 0,1 M TEA (trietanolammina, pH8.0) per 10 min. </li><li> Trasferimento diapositive in 0,1 TEA M (pH8.0) per 5 min. </li><li> Ibridare sezioni a 35 S-etichettati virus-specifici (come l&#39;HIV-1, SIV) sonda antisenso o senso (controllo negativo per l&#39;HIV-1, SIV), o 35 S-etichettati riboprobes LCMV (pooled senso e antisenso). </li><li> Lavare due volte con sezioni 2xSSC per 5 minuti dopo ibridazione overnight a 42 ° C. </li><li> Lavare le sezioni in STE (0,5 M di NaCl, 1mM EDTA, 20 mM Tris-HCL, pH 7,5) per 5 min. </li><li> Digest sezioni con RNasi A e T1 in STE a 37 ° C per 30 minuti </li><li> Lavare le sezioni in 2x SSC più 50% formammide per 5 min. </li><li> Lavare le sezioni in 1x SSC 10 min. </li><li> Lavare le sezioni in SSC 0,5 x 15 min. </li><li> Disidratare sezioni in 70, 80 e 100% di etanolo contenenti 0,3 M di acetato di ammonio, ogni 5 minuti. </li><li> Sezioni cappotto con emulsione nucleare pista </li><li> A secco in una stanza buia per 1 ora. </li><li> Esporre sezioni a 4 ° C per 11 giorni (SIV) e 3 giorni (LCMV). </li><li> Sviluppare le sezioni in D19 (Kodak, Cat # 146 4593) per 3 minuti, lavare in dH2O 30 secondi, fissare a Rapid Fixer (Kodak, Cat # 146 4106) per 4 minuti, lavare in dH2O 5 min x 3 volte. </li><li> Disidratare nel 70%, 80% ed etanolo assoluto, a 5 minuti ciascuno. </li><li> Diapositive montare in fluorescenti medio Permount compatibili. </li></ol></li></ol> 3. Acquisire immagini al microscopio confocale. <ol><li> Catturare immagini ISTH con un Bio-Rad microscopio confocale MRC 1000, o qualsiasi altro microscopio confocale con Epi2-Blue dispositivo di riflessione. </li><li> Usa Epi1-605 per il tetramero fluorocromo rosso, Epi2 DF32-522 per il verde CD8 fluorocromo, e la Epi2-Blue riflessione per grani d&#39;argento (segnale ISH nel radioautographs sviluppato) a 20x (per i SIV) o 60x (per LCMV) </li><li> Sequenzialmente raccogliere Z-serial immagini a intervalli di 1-micron nei tre canali di ogni campo. </li><li> Acquisire immagini da ogni sezione da sinistra adestra e dall&#39;alto verso il basso, e il nome ogni immagine in base alla sua riga e di colonna in un file di Excel. </li><li> Catturare ogni immagine con una sovrapposizione ~ 20% con le sue immagini vicine al fine di evitare lacune nella immagine ricostruita montaggio. </li></ol> 4. Analisi di immagine: ricostruzione dell&#39;immagine montaggio, il calcolo e l&#39;analisi delle cellule baricentro spaziale. <ol><li> Progetto Z-serial immagini in una sola immagine per ogni canale con l&#39;assistente confocale (versione 4.02.). </li><li> Unisce automaticamente l&#39;immagine proiettata da tre canali in un&#39;unica immagine RGB, utilizzando una procedura d&#39;azione Photoshop 7.0. </li><li> Generare un&#39;immagine montaggio cucendo immagini fuse insieme a strati in Photoshop 7.0. </li><li> Associato grani d&#39;argento individuale e tetramero macchia con le cellule, e assegnare le coordinate X, Y dei centri (centroidi) dell&#39;RNA SIV + e cellule tetramero +, usando MetaMorph (versione 7.1.3.) O Photoshop (disponibile presso l&#39;autore) </li><li> Esportare i dati in file Excel centroide come numeri numerico per ogni cella. E: T rapporti sono determinati dai file Excel dal numero totale di tetramero + e + RNA virale delle cellule nella sezione. </li></ol> Relazioni spaziali tra il rosso e il blu tetramero + SIV RNA + cellule vengono catturati da copiare e incollare le loro trame rispettive dai file Excel in un documento Photoshop. Dopo essere diminuita l&#39;opacità di uno strato di allineare e scala le griglie in modo che essi coincidono, colore-selezionare e copiare e incollare in un nuovo livello le posizioni dei blu RNA + celle e quindi scartare lo strato utilizzato per allineare le griglie, le posizioni del tetramero + + e l&#39;RNA virale delle cellule sarà rivelato a immagine appiattita. 5. Note aggiuntive Se il taglio dei tessuti infettive: Lavoro in un laboratorio BSL2.5. Prendere precauzioni speciali con lame di rasoio. Mettere il rasoio nella lama vibratome montare con una pinza. Se non è possibile mettere la lama con una pinza, poi metterla in prima di aggiungere tessuto al bagno, e non sostituiscono la lama. Quando si taglia finito, rimuovere la lama con una pinza. Lama a spruzzo con il 70% EtOH o DMQ prima della rimozione. Come sempre, gettare in un contenitore lame taglienti. Cambiare i guanti esterni o risciacquare con disinfettante dopo ogni contatto con i tessuti o PBS contaminati nel serbatoio. Al termine, se si lavora con materiale infettivo, aggiungere disinfettante DMQ al PBS nel serbatoio e lasciate riposare un paio di minuti prima di rimuovere. Smaltire decontaminati PBS giù per lo scarico. Risciacquare il serbatoio con acqua per eliminare il sale e disinfettante. Pulire gli utensili di lavoro e con DMQ. Lavare gli utensili con acqua. Fare tetrameri da biotinilato monomeri MHC: Biotinilato ottenere molecole MHC di classe I, come HLA-A * 0201 / B 2 m / molecole peptidiche prodotte sia con Gag (SLYNTVATL), Pol (ILKEPVHGV), o irrilevanti MART peptide (ELAGIGILTV) peptidi da Beckman Coulter. Biotinilato HLA-A * 0301 / B 2 m / molecole peptidiche prodotte sia con Gag (KIRLRPGGK) o Nef (QVPLRPMTYK) presso l&#39;impianto di tetramero NIAID. Tetrameri sono generati con l&#39;aggiunta di 6 aliquote di marcato con FITC ExtraAvidin (Sigma) biotinilato Mamu A * 01 / B 2 m / monomeri di peptide nel corso di 8 ore per un rapporto finale molare di 4.5:1. La logica alla base aggiungendo la Extravidin sta lentamente che durante i primi punti di tempo c&#39;è una sovrabbondanza di monomero che assicura che tutti i Extravidin aggiunto riceve tutti e quattro i siti legati biotina. Più tardi nella reazione, questo processo è meno efficiente perché c&#39;è meno monomero a sinistra e più di una possibilità che ExtrAvidin non avranno tutti e 4 i siti legati. Se aggiunti tutti i ExtrAvidin subito la reazione sarebbe stata meno efficienti e più molecole Extravidin avrebbe solo 2 o 3 monomeri collegato.

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	<li>Altman, J. D., Moss, P. A. H., Goulder, P. J. R., Barouch, D. H., McHeyzer-Williams, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li><li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues.">Cutting Edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> Journal of Immunology. 165, 617-61 (2000).</li><li>Qingsheng, L. i., Skinner, P. J., Ha, S. -. J., Duan, L., Mattila, T., Hage, A., White, C., Barber, D. L., O'mara, L., Southern, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcome+in+early+viral+infection.">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcome in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2008).</li><li>Haase, T., Haase, K., Zupancic, M., Sedgewick, G., Faust, R. A., Melroe, H., Cavert, W., Gebhard, K., Staskus, K., Zhang, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perelson+Quantitative+Image+Analysis+of+HIV-1+Infection+in+Lymphoid+Tissue.">Perelson Quantitative Image Analysis of HIV-1 Infection in Lymphoid Tissue.</a> Science. 274, 985-989 (1996).</li><li>Li, Q., Duan, L., Estes, J. D., Ma, Z. M., Rourke, T., Wang, Y., Reilly, C., Carlis, J., Miller, C. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+SIV+replication+in+resting+memory+CD4+T+cells+depletes+gut+lamina+propria+CD4+T+cells.">Peak SIV replication in resting memory CD4 T cells depletes gut lamina propria CD4 T cells.</a> Nature. 434, 1148-1152 (2005).</li><li>Li, Q. i. n. g. s. h. e. n. g., Estes, J. a. c. o. b. D., Schlievert, P. a. t. r. i. c. k. M., Duan, L. i. j. i. e., Brosnahan, A. m. a. n. d. a. J., Southern, P. e. t. e. r. J., Reilly, C. a. v. a. n. S., Peterson, M. a. r. n. i. e. L., Schultz-Darken, N. a. n. c. y., Brunner, K. e. v. i. n. G., Nephew, K. a. r. l. a. R., Pambuccian, S. t. e. f. a. n., Lifson, J. e. f. f. r. e. y. D., &amp;amp, J. o. h. n. V. C. a. r. l. i. s., Haase, A. s. h. l. e. y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycerol+monolaurate+prevents+mucosal+SIV+transmission.">Glycerol monolaurate prevents mucosal SIV transmission.</a> Nature. , (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dal virus a RNA è usata come marcatore per le cellule infettate dal virus in questo rapporto, tutti i reagenti prima di ibridazione dovrebbe essere RNAase libero. La procedura di ibridazione in situ qui descritta è stata modificata per preservare il segnale fluorescente dalla colorazione tetramero in situ. Poiché il segnale radioautographic da virus infetti le cellule rilevato da ibridazione in situ è ​​ad una profondità di circa un diametro di cellule, le sezioni spessa utilizzata per la colorazione tetramero in situ devono essere ritagliato in 5-8-micron di spessore sezioni. Questa nuova tecnica di combinare in tetrameri situ e di ibridazione in situ (ISTH) qui descritto consente la visualizzazione simultanea, mappatura e analisi del rapporto spaziale del virus-specifiche cellule CD8 + T e cellule infettate da virus bersaglio. Questo metodo può essere applicato per la valutazione delle cellule CD8 + vaccino a base T e in altri non-virus patogeno e le interazioni ospite. Il metodo di analisi delle immagini qui descritto può anche essere adattato per studiare le relazioni spaziali di due popolazioni di cellule che interagiscono in situ, ad esempio, abbiamo recentemente utilizzato la procedura centroide mappatura nello studio del virus HIV-1 la trasmissione sessuale nel modello dei primati non umani di immunodeficienza delle scimmie infezione da virus di macachi rhesus 6

Soluzioni e reagenti: <ul><li> PBS-H tampone fosfato salino contenente eparina (100ug/ml o 18.7U/ml) per inibire RNasi </li><li> RPMI terreni di coltura dei tessuti contenenti eparina (100ug/ml o 18.7U/ml) per inibire RNasi </li><li> Bassa temperatura di fusione del 4% in PBS agarosio </li><li> PBS con 2% di siero normale di capra (o siero di specie in cui sono state effettuate le fluoroforo anticorpi coniugati). </li><li> PBS con 2% di siero normale di capra e lo 0,3% Triton X-100 </li><li> MHC di classe I tetrameri coniugati con FITC </li><li> Gli anticorpi anti-FITC, ad esempio Biodesign coniglio anti-FITC </li><li> Fluoroforo coniugato anti-IgG di coniglio che è stato molto trasversale assorbiti da altre specie IgG per l&#39;uso con etichettatura multipli, ad esempio, di capra anti-coniglio-Cy3 </li><li> Fluoroforo coniugato IgG anti-topo che è stato molto trasversale assorbiti da altre specie IgG per l&#39;uso con l&#39;etichettatura più </li><li> PBS fresco tamponata al 4% paraformaldeide </li><li> 0.01M Urea </li><li> Glicerolo / gelatina contenenti 4mg/ml n-propil gallato </li></ul> Attrezzature speciali <ul><li> Vibratome </li><li> Bisturi </li><li> Lamette da barba </li><li> Forbici chirurgiche </li><li> Loctite Adesivi Set rapida istantanea (prodotto # 46551) </li><li> Forcipe </li><li> # 2 pennelli pelo di cammello. Possibile tagliare con la lama di rasoio per lo spessore desiderato </li><li> 24-oltre a fondo piatto di coltura tissutale piastre ad esempio Falcon catalogo # 353226 </li><li> Tessuto camere </li><li> Stagnola </li><li> Cartone scivolo cartella ad esempio Fisher catalogo 12-587-10 </li><li> Microscopio confocale </li></ul> Reagenti IST di riferimento rapido PBS-H (tampone fosfato salino con eparina) <ul><li> 450 ml di PBS 1X </li><li> 50 ml di PBS 1X + eparina 10X </li></ul> 1x PBS + eparina 10X <ul><li> 500 ml di PBS 1X </li><li> 500 mg di eparina in polvere (che si trova sullo scaffale a secco depositi chimici) </li></ul> PBS-H / 2% NGS (siero normale di capra) <ul><li> 49 ml PBS-H in tubo Falcon </li><li> NGS 1 ml (si trova in 1 ml in aliquote -20 congelatore) </li></ul> PBS-H / 2% NGS / 0,3% Triton X-100 <ul><li> 49 ml PBS-H / 0,3% Triton X-100 in tubo Falcon </li><li> NGS 1 ml (si trova in 1 ml in aliquote -20 congelatore) </li></ul> PBS-H / 0,3% Triton X-100 <ul><li> 500 ml PBS-H </li><li> 1,5 ml di Triton X-100 (questo è un liquido denso trovato sugli scaffali di stoccaggio a secco chimici) </li></ul> 4% agarosio LMP <ul><li> 2 g di polvere di agarosio LMP </li><li> 50 ml di PBS </li><li> Agitare fino a miste, forno a microonde fino a quando si dissolve in polvere. </li></ul> GG-NPG (glicerolo gelatina con n-propil Galate <ul><li> Inserire una bottiglia di glicerolo gelatina in bagno a 50 gradi l&#39;acqua per sciogliere </li><li> Aggiungere 0,06 g di propile Galate (che si trova sullo scaffale Terris), agitare bene </li><li> Tenete a bagno d&#39;acqua, agitando di tanto in tanto fino alla dissoluzione. </li><li> Aliquota in 1 ml provette (tubi marrone) </li></ul> 4% paraformaldeide <ul><li> 4 g in polvere paraformaldeide (che si trova sugli scaffali di stoccaggio a secco chimici) </li><li> Mettere circa 10 ml di PBS-H in un cilindro graduato, aggiungere polvere di pf </li><li> Aggiungete un po &#39;d&#39;acqua fino a volume raggiunge circa 70 ml </li><li> Aggiungere un contagocce di NaOH. </li><li> Mescolare fino a completa dissoluzione (di solito circa 20-30 minuti) </li><li> Aggiungi HCl fino a pH tra 7-8. </li><li> Portare il volume a 100 ml con acqua. </li></ul> Urea 0,01 M <ul><li> 0,3 g di urea (che si trova sugli scaffali di stoccaggio a secco chimici) </li><li> 500 ml di acqua </li></ul>

a technique to simultaneously visualize virus-specific cd8+ t cells and virus-infected cells in situ

I numeri e le posizioni dei virus-specifiche cellule T CD8 + rispetto al numero e le posizioni dei loro obiettivi di cellule infette è pensato per essere critico nel determinare gli esiti che vanno dalla distanza di infezioni croniche persistenti. Descriviamo qui un metodo per valutare le relazioni spaziali e quantitative tra immunitarie effettrici (E) del virus-specifiche cellule T CD8 + e target infetti (T), che combina in situ tetramero (IST) colorazione per rilevare virus-specifiche cellule T CD8 + e in situ ibridazione (ISH) per rilevare virus-RNA + cellule nei tessuti dove la battaglia tra le difese immunitarie e l&#39;infezione ha luogo. La combinazione di colorazione TSI e ISH, abbreviato ISTH, consente la visualizzazione e la mappatura dei luoghi di cellule immunitarie effettrici e gli obiettivi, determinazione e facile di E: T ratio. Questi parametri, a loro volta possono poi essere utilizzati per determinare le relazioni tra prossimità spaziale, e la tempistica e l&#39;ampiezza della risposta immunitaria in grado di predire gli esiti di infezione precoce.

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A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

Una tecnica che combina in colorazione tetramero situ e di ibridazione in situ (ISTH) consente la visualizzazione, la mappatura e l&#39;analisi della vicinanza spaziale del virus-specifiche cellule T CD8 + ai loro infettati da virus obiettivi, e la determinazione delle relazioni quantitative tra questi effettori immuni e gli obiettivi ai risultati infezione.

Una tecnica di visualizzare contemporaneamente Virus specifiche cellule CD8 + T e cellule infettate da virus In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

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Video: A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

Regulatory T cells: Therapeutic Potential for Treating Transplant Rejection and Type I Diabetes

Cellule T regolatorie: potenziale terapeutico per terapia antirigetto nei trapianti e diabete di tipo I

Ricerca

Biologia

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

Homing delle cellule ematopoietiche del midollo osseo

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

In situ Frazionamento subcellulare di cellule di mammifero aderenti e non aderenti

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Isolamento di cellule endoteliali valvolare

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Clonogenica saggio: cellule aderenti

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated precursors. Researchers have employed various methods of lineage labeling, such as DiI labeling1 and pressure injection of traceable enzymes2 to ascertain cell fate at later stages of development in model systems. The first fate maps in zebrafish (Danio rerio) were assembled by iontophoretic injection of fluorescent dyes, such as rhodamine dextran, into single cells in discrete regions of the embryo and tracing the labeled cell's fate over time3-5. While effective, these methods are technically demanding and require specialized equipment not commonly found in zebrafish labs. Recently, photoconvertable fluorescent proteins, such as Eos and Kaede, which irreversibly switch from green to red fluorescence when exposed to ultraviolet light, are seeing increased use in zebrafish6-8. The optical clarity of the zebrafish embryo and the relative ease of transgenesis have made these particularily attractive tools for lineage labeling and to observe the migration of cells in vivo7. Despite their utility, these proteins have some disadvantages compared to dye-mediated lineage labeling methods. The most crucial is the difficulty we have found in obtaining high 3-D resolution during photoconversion of these proteins. In this light, perhaps the best combination of resolution and ease of use for lineage labeling in zebrafish makes use of caged fluorescein dextran, a fluorescent dye that is bound to a quenching group that masks its fluorescence9. The dye can then be "uncaged" (released from the quenching group) within a specific cell using UV light from a laser or mercury lamp, allowing visualization of its fluorescence or immunodetection. Unlike iontophoretic methods, caged fluorescein can be injected with standard injection apparatuses and uncaged with an epifluorescence microscope equipped with a pinhole10. In addition, antibodies against fluorescein detect only the uncaged form, and the epitope survives fixation well11. Finally, caged fluorescein can be activated with very high 3-D resolution, especially if two-photon microscopy is employed 12,13. This protocol describes a method of lineage labeling by caged fluorescein and laser uncaging. Subsequenctly, uncaged fluorescein is detected simultaneously with other epitopes such as GFP by labeling with antibodies.

This protocol delineates a way to label and trace the fate of small groups of cells zebrafish embryos using UV-uncaging of caged fluorescein, followed by whole mount immunolabeling to amplify the signal from the uncaged fluorescein.

Etichettatura stirpe di cellule Zebrafish con laser Uncagable Fluoresceina Destrano

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induzione e Analisi dei epiteliale a Mesenchymal Transizione

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Un&#39;interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine ​​in protrusioni cellulari dinamiche

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

In Situ Immunofluorescenti colorazione di autofagia nelle cellule staminali muscolari

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...