Gli autori sono grati a H. Eisen, M. Gubbels, K. van Grinsven, E. Guillen, A. Drake, V. Mahajan, Q. Gao, e G. Yap per proficue discussioni e reagenti. Siamo grati a J. Dausman, R. Flannery, e J. Jackson per l&#39;assistenza con la gestione della colonia del mouse. Siamo grati a P. Wisniewski per FACSorting. EMF è stato sostenuto dal Programma di Scienze Umane Frontiere. RJ è stato sostenuto dal National Institute of concede Salute RO1-HD045022 e R37-CA084198. HLP è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institute of Health.

Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata in <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/328/5975/243">Kirak et al. Science 328 (5975), 243-248 (2010)</a> . 1. Isolamento di cellule del donatore Prima di T specifici o cellule B possono essere utilizzati come cellule del donatore di generare modelli di topo transnuclear, topi devono essere infettato da un agente patogeno di interesse o immunizzati con un antigene di interesse. Dal momento che abbiamo usato cellule CD8 + specifiche per Toxoplasma gondii, il seguente protocollo descrive la generazione e l&#39;isolamento di queste cellule e deve essere adattata in base agli interessi personali. <ol><li> Cisti derivata da un omogenato cervello di topo (circa 40) sono iniettati intra-peritoneally in BL / 6 x Balb / c F1 (B6CF1) topi, che consente l&#39;isolamento di entrambe le H-2 b e H-2 d limitato cellule T CD8 +. </li><li> Al culmine della risposta immunitaria, il topo infetto è eutanasia, la milza isolati e messi in un piatto contenente 6 ml di globuli rossi (RBC) tampone di lisi. </li><li> Utilizzando i lati smerigliato di due scivoli di copertura, la milza è attentamente terra e incubato nel buffer di lisi per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 14 ml di PBS, filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cellula (40 o 70 micron) in una provetta da 50 ml falco e centrifugare per 5 min a 300 gr. </li><li> Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 ml di PBS e trasferire in una provetta 1,5 ml Eppendorf. Centrifugare per 5 minuti a 300g e rimuovere il surnatante dopo. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 50 microlitri di PBS, aggiungere gli anticorpi fluorescente per identificare il tipo di cellula di interesse (ad es CD3, B220, CD8 e CD4), e fluorescente MHC-I tetramero (MHC-II tetramero di cellule T CD4) caricato con il peptide di interesse alla sospensione cellulare e incubare per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 1 ml di PBS, centrifugare per 5 min a 300 g, risospendere pellet in 3 ml di PBS e filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cellula (40 o 70 micron) in una provetta. </li><li> Eseguire FACSorting impostando le porte rigorosamente (Figura 1B). </li></ol> 2. Cellule somatiche Ci sono un paio di protocolli per il trasferimento nucleare di cellule somatiche. Quella descritta qui fa uso di ovociti arrestate in metafase-II e l&#39;inibizione della seconda divisione meiotica con citocalasina B. Pertanto le cellule del donatore sono necessari che sono in fase G0/G1. <ol><li> Preparazione degli ovociti <ol><li> Topi di sesso femminile di BDF1 sfondo vengono iniettati all&#39;interno peritoneally con 5IU PMS per il mouse 05:00-7:00. </li><li> Circa 47 ore più tardi, ogni mouse viene iniettato all&#39;interno peritoneally con HCG 5IU. </li><li> Preparare un piatto di cultura (KSOM-AA scende sotto olio) per gli ovociti, il giorno stesso l&#39;iniezione di HCG e metterli in un incubatore a 37 ° C, 5% di CO 2. Inoltre, preparare gli aghi necessari per SCNT (7μm per l&#39;enucleazione e 4 o 5 micron per il trasferimento nucleare di nuclei di linfociti), caricandoli con il mercurio. </li><li> Euthanize topi e isolare ovidotti circa 13h dopo HCG (circa 8:00). Raccogliere gli ovidotti in 1-2 gocce di HCZB. </li><li> Uno per uno spostare il ovidotti in una goccia contenente M2 w / ialuronidasi. Nick the ovidotto accuratamente con un pinza e spostare l&#39;ovocita-cumulo-complesso in calo. Dopo tutto ovocita-cumulo-complessi sono stati isolati, il piatto viene incubata a 37 ° C. </li><li> Dopo 2-5 minuti (il tempo esatto dipende dal lotto di ialuronidasi) raccogliere gli ovociti, lavare in HCZB e la piastra li in KSOM-AA gocce. </li></ol></li><li> Enucleazione degli ovociti <ol><li> Utilizzare il coperchio di una capsula di Petri per preparare il piatto SCNT. Impostare il microscopio e il micromanipolatore. </li><li> Lavare l&#39;ago enucleazione (7 micron) in PVP prima di iniziare con l&#39;enucleazione. </li><li> Per enucleazione, posto un gruppo di ovociti (10-30) in una goccia di HZCB con citocalasina B (5 mg / mL). Durante l&#39;incubazione (min. 5 min) line-up degli ovociti orizzontalmente. </li><li> Prendete un ovocita e posto di fronte a l&#39;ago in mano. Fissare l&#39;ovocita per l&#39;ago tenendo mediante l&#39;applicazione di un vuoto. Utilizzando l&#39;ago enucleazione, girare l&#39;ovocita fino a quando il cromosoma-fuso-complessi (CSC, spesso chiamato il &quot;nucleo&quot;) è in posizione ore 3. </li><li> Utilizzando piezo-pulse penetrare la zona pellucida con attenzione senza danneggiare l&#39;ovocita. Luogo l&#39;apertura dell&#39;ago adiacente alla metafase II mandrino e applicare il vuoto. Il &quot;nucleo&quot; dovrebbe lentamente entrare nella ago, e la membrana dovrebbe sigillare una volta che è completamente rimosso. </li><li> Trasferire il ovociti enucleati indietro nel KSOM-AA gocce, e lavarli più volte. Ripetere l&#39;indirizzo enucleazione passi con un nuovo gruppo di ovociti. Continuare fino a quando tutte le uova sono enucleato o fino a circa 11:00. </li></ol></li><li> Trasferimento nucleare <ol><li> Per il trasferimento nucleare, cambio l&#39;ago enucleazione (7 micron) con un ago di trasferimento nucleare (4 o 5 micron) e lavarlo con PVP. </li><li> Luogo le cellule di interesse (ad esempio cellule T CD8 +) in una caduta con PVP, mescolare bene e incubare per un minimo di 10 min. </li><li> Posizionare un gruppo di ovociti enucleato (10-30) in una goccia di HCZB con citocalasina B (2,5 mg / ml). Durante l&#39;incubazione (min. 5 min) line-up degli ovociti in posizione orizzontale utilizzando l&#39;ago di trasferimento nucleare. </li><li> Prendete una cellula donatrice dal PVP-cell sospensione e aspirare in-e-out fino a quando la membrana esterna ha abbattuto (frammenti della membrana e citoplasma dovrebbe essere visibile). Se necessario, un piezo-impulso può essere applicata. Una volta che un nucleo è stato isolato, sposta un po &#39;fino a l&#39;ago, e continuano a raccogliere i nuclei fino ad avere 10-30. </li><li> Sposta la goccia contenente gli ovociti enucleati allineati. Fissare un ovocita per l&#39;ago tenendo applicando vuoto. Posizionare l&#39;ago trasferimento nucleare (i nuclei dovrebbe essere lontano dalla apertura) adiacente alla zona pellucida e applicare piezo impulsi fino a quando l&#39;ago è passato attraverso la zona pellucida. Muovere con cautela un nucleo alla punta dell&#39;ago, spingere l&#39;ago nel citoplasma dell&#39;ovocita fino a quando la punta dell&#39;ago è 2 / 3 all&#39;interno. Applicare una piccola pressione negativa, in modo che un po &#39;della membrana dell&#39;ovocita è l&#39;ago. </li><li> Il passo successivo è molto critica, poiché è l&#39;unica volta in cui l&#39;ovocita è in realtà &quot;aperta&quot;. Applicare un singolo impulso di piezo, spingere il nucleo fuori l&#39;ago, applicando una pressione positiva, con attenzione tirare indietro l&#39;ago in modo che la punta è circa 1 / 3 nell&#39;ovocita, e quindi applicare una pressione negativa e continuare a tirare indietro l&#39;ago sigillare l&#39;ovocita. Ripetere questo passaggio con ogni ovocita. </li><li> Dopo tutti gli ovociti di un gruppo hanno ricevuto un nucleo, vengono lavate e coltivate in KSOM-AA media. Ripetete questa procedura con tutti gli ovociti. </li><li> Dopo l&#39;ultimo gruppo è stata culture in KSOM-AA per un minimo di 30 minuti, il SCNT-embrioni vengono trasferiti in gocce di Ca-multimediale gratuito attivazione contenente SrCl2. </li><li> Dopo 6 ore di attivazione, la quantità di pseudo-pronuclei (PPN)-positivi SCNT-embrioni è determinata. Gli embrioni vengono poi lavate e coltivate in KSOM-AA gocce per altri 3,5 giorni fino a quando hanno raggiunto lo stadio di blastocisti. </li><li> Farmaci o sostanze chimiche di scelta (come la tricostatina A) può essere aggiunto alla attivazione e terreni di coltura. </li></ol></li></ol> 3.Derivation delle cellule staminali embrionali Il SCNT-blastocisti può essere utilizzato sia per trasferirli in pseudo-femmine gravide (noto anche come clonazione diretta o one-step) o per ottenere cellule staminali embrionali (noto anche come clonazione indiretti o due fasi). Dal momento che è molto più efficiente per generare cellule staminali embrionali, scegliamo la procedura in due fasi. Nel caso in cui lo scienziato è interessato nella clonazione diretta, la blastocisti possono essere trasferiti direttamente in pseudo-femmine gravide, come descritto nella sezione 5. Ci sono molti protocolli descrivono la derivazione di cellule staminali embrionali. Quello qui descritto è una tecnica standard, che utilizza le cellule di alimentazione, e siero fetale di vitello. <ol><li> Il secondo giorno dopo il trasferimento nucleare, preparare un piatto 96-U-e per la derivazione delle cellule ES. </li><li> Aggiungere 100 ul gelatina in ciascun pozzetto di una piastra 96-U-bene, incubare per un minimo di 10 minuti, e rimuoverlo in seguito. </li><li> Cellule alimentatore disgelo e risospendere in un volume a seconda del mezzo ESD, ad esempio, le cellule di alimentazione pari a una superficie di 25 cm 2 sono risospesi in 10 ml di mezzo di scariche elettrostatiche e 200 ml di sospensione cellulare viene aggiunto in ciascuno dei gelatina-trattati bene. </li><li> Mettere la piastra in un incubatore e la cultura a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Dopo 3,5 giorni, gli embrioni dovrebbero essere allo stadio di blastocisti. </li><li> Preparare un piatto sterile batterica da placcatura poche gocce di medie ES cellulare e thyrode acido. </li><li> La blastocisti sono prima trasferite dal KSOM-AA scende in gocce contenenti normale media delle cellule ES e lavato due volte. </li><li> Cura il trasferimento di un gruppo di blastocisti (blastocisti 5-10) in una goccia di thyrode acide e tenere lì fino alla zona pellucida si è dissolto. </li><li> Le blastocisti sono poi trasferiti in una goccia di media ES, lavato due volte, e poi messo nell&#39;alimentatore rivestite 96-U-pozzetti (una blastocisti in un pozzo). </li><li> Gli embrioni vengono poi coltivate per 5-7 giorni in incubatrice a 37 ° C, 5% di CO 2 senza disturbarli. Questo dà il tempo ad un embrionettach allo strato alimentatore, e di formare una conseguenza. </li><li> Preparare 24 pozzetti, con circuiti elettrici placcatura in media ESD in ciascun pozzetto, ad esempio, risospendere un equivalente di 50 cm 2 alimentatore in 12 ml di mezzo di scariche elettrostatiche, e aggiungere 500 microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto. </li><li> Rimuovere con attenzione il supporto ESD dalla piastra 96-U-bene con gli embrioni, lavare ogni pozzetto due volte con 250 microlitri Hepes (o PBS), aggiungere 50 microlitri tripsina e incubare per circa 5 minuti a 37 ° C. </li><li> Pipetta su e giù più volte, fino a quando escrescenza si è sfasciata in una cella singola sospensione, trasferimento in un 24-pozzetti ed incubare a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Se la derivazione ESC ha avuto successo, colonie CES dovrebbe essere visibile dopo 7-10 giorni. </li></ol> 4.Blastocyst iniezione L&#39;iniezione di blastocisti è una tecnica di routine per generare qualsiasi tipo di modello di topo transgenico. E &#39;importante ricordare che l&#39;iniezione di blastocisti e il successivo trasferimento in pseudo-donne incinta ha bisogno di essere cronometrati bene. <ol><li> Primo topi femmina con PMS e HCG, come descritto nella sezione 2.1. Dopo l&#39;iniezione di HCG mettere topi femmina insieme a topi maschi (una femmina ed un topo maschio per gabbia). </li><li> Il giorno seguente, controllare le femmine per spine. Questo viene conteggiato come 0.5dpc (giorni post coito). </li><li> Embrioni fecondati vengono poi isolate dal ovidotto, come descritto nella sezione 2.1, e colto in KSOM-AA per ulteriori 3 giorni. </li><li> Preparare le cellule ES, al momento della iniezione blastocisti (3.5dpc). </li><li> Rimuovere medio a partire da cellule ES, lavare due volte con Hepes (o PBS), aggiungere tripsina e incubare per 5 minuti a 37 ° C. </li><li> Risospendere le cellule trypsinized con media ES, piatto in un piatto, e incubare per 45-60 minuti a 37 ° C, 5% di CO 2 per ridurre la quantità di cellule di alimentazione (alimentatore cellule aderiscono più velocemente rispetto alle cellule ES). </li><li> Trasferire la sospensione cellulare attraverso un colino cellula (40 o 70 micron) in una provetta e centrifugare per 5 min a 1000rpm. </li><li> Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di media ES e memorizzare su ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Preparare il coperchio di un piatto sterile batterica da gocce placcatura contenente PVP e HCZB. </li><li> Preparare un 15 ago micron caricando con il mercurio, collocandolo in posizione e il lavaggio con PVP. </li><li> Posizionare un gruppo di blastocisti (10-30 blastocisti) in una goccia con HCZB, e aggiungere 5-50 microlitri della sospensione di cellule ES (dipende dalla concentrazione) in un&#39;altra goccia di HCZB. </li><li> Raccogliere le cellule ES (50-100 cellule) con l&#39;ago di iniezione. </li><li> Sposta la goccia con le blastocisti. Allineare la blastocisti in orizzontale, e fissare una con l&#39;ago tenendo applicando vuoto. </li><li> Utilizzando l&#39;ago di iniezione girare la blastocisti fino a quando la massa cellulare interna (ICM) è nella posizione ore 9. </li><li> Posizionare l&#39;ago di iniezione a ore 3, assicurarsi che non ci sono cellule staminali sulla punta dell&#39;ago, e applicare piezo-impulso che l&#39;ago dell&#39;iniezione penetra attraverso la zona pellucida e la trophectoderm nel blastocele. </li><li> Rilasciare un paio di cellule ES (5-15 cellule), in modo che le cellule ES bastone per l&#39;ICM. Continuare fino a quando tutti blastocisti di un gruppo sono state iniettate cellule ES. </li><li> Dopo un gruppo di blastocisti è finito, lavarli due volte in KSOM-AA e tenerli in una goccia con KSOM-AA fino a quando tutti blastocisti vengono iniettati. </li></ol> 5. Embryo Transfer Il trasferimento di embrioni in pseudo-femmine gravide rappresenta una procedura chirurgica, che deve essere effettuata con molta attenzione e secondo le linee guida di istituto del ricercatore. <ol><li> Anestetizzare topi riceventi femminile, la barba quadrante inferiore destro, e da disinfettare. </li><li> Utilizzando le forbici aperte sulla pelle, e separare il peritoneo dalla pelle. </li><li> Individuare l&#39;ovaio attraverso il peritoneo (macchia rossa), e aprire il peritoneo in prossimità dell&#39;ovaio. </li><li> Utilizzando una pinza, con attenzione afferrare il ovidotto e tirare fuori l&#39;utero. </li><li> Prendete un gruppo di circa 10 blastocisti con un capillare collegato ad una pipetta a bocca. </li><li> Fissare l&#39;utero con una pinza, pugno nel suo complesso in piccolo con un piccolo ago, e inserire il capillare con le blastocisti nel lume dell&#39;utero. </li><li> Con attenzione rilascio degli embrioni in utero, e rimuovere il capillare. </li><li> Spingere l&#39;utero indietro nella cavità addominale. </li><li> Individuare i margini del peritoneo e chiudere con un paio di punti. </li><li> Chiudere la pelle del mouse con un paio di graffette. </li><li> Per dolore post-operatorio, somministrare 5 mg Carprofen per mg di peso corporeo. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Nucleare di cellule somatichetrasferimento di pre-definite cellule T in B6CF1 sfondo. Numeri assoluti e relativi di embrioni generati da cellule CD8 + T e le cellule staminali embrionali derivate da blastocisti SCNT. <img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Analisi del flusso rappresentante citometria di topi chimerici con SCNT iniettato cellule staminali embrionali. Cancello e numero (cento per totali cellule T CD8 +) indica la presenza di specifiche cellule CD8 + T nei topi chimerici.

<ol>
	<li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V(D)J+recombination.">V(D)J recombination.</a> Immunol. Rev. 200, 5-5 (2004).</li><li>Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+TCR+expression+in+transgenic+mice+constructed+using+cDNA-based+alpha-+and+beta-chain+genes+under+the+control+of+heterologous+regulatory+elements.">Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements.</a> Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).</li><li>Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vigor,+fetal+overgrowth,+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation.">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 6209-6209 (2001).</li><li>Kishigami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+improvement+of+mouse+cloning+technique+by+treatment+with+trichostatin+A+after+somatic+nuclear+transfer.">Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 340, 183-183 (2006).</li><li>Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cloning+with+nucleus+donor+cells+of+different+age+and+type.">Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type.</a> Mol Reprod Dev. 58, 376-376 (2001).</li></ol>

Abbiamo dimostrato qui che SCNT può essere utilizzato per generare topi transnuclear dalle cellule T con pre-definiti specificità. Anche se non qui, la tecnica dovrebbe anche essere utilizzabile per generare topi transnuclear da cellule B pre-definita specificità. Una cosa importante da considerare è il ceppo e il sesso di topo, che è stato infettato o immunizzate e per isolare le cellule T o B di interesse. Dato che le cellule T e B hanno un rendimento molto basso riprogrammazione in generale, si consiglia di utilizzare ibridi F1 di aplotipo desiderato. Poiché la cellula donatrice determina anche il sesso, si consiglia di utilizzare T o linfociti B di topi maschi. Questo significa che solo i topi maschi chimerici trasmetterebbe le BCR o TCR attraverso la linea germinale, con i topi maschi è stato più facile e veloce per riprodursi. Nel loro insieme, pensiamo che riprogrammazione epigenetica tramite SCNT rappresenta un potente strumento per generare un nuovo tipo di modelli di mouse, che sarà di grande vantaggio per il campo immunologico.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Red Blood Cell lysis Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>R7757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>REF 352340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pregnant Mare Serum (PMS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>367222</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human Chorionic Gonadotropin (HCG)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>230734</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4272</td>
<td>Type IV-S</td>
</tr>
<tr>
<td>KSOM-AA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MR-106-D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HCZB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MR-173-D</td>
<td>Customized medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Ca-free medium for activation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MR-174-D</td>
<td>Customized medium</td>
</tr>
<tr>
<td>SrCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>255521</td>
<td>100mM = 10x</td>
</tr>
<tr>
<td>AlbuMAX I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11020-021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PVP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biotech</td>
<td>102787</td>
<td>Make 10% solution using HCZB, and add 0.1% AlbuMAX I</td>
</tr>
<tr>
<td>Cytochalasin B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C6762</td>
<td>500&mu;g/ml = 100x</td>
</tr>
<tr>
<td>Trichostatin A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8552</td>
<td>5mM = 1000x</td>
</tr>
<tr>
<td>Mineral Oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M5310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Holding needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Humagen</td>
<td>MPH-SM-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Injection and transfer needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Humagen</td>
<td>4-15, 7-15, 15-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouth pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Instruments</td>
<td>14088-10</td>
<td>or something similar</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Instruments</td>
<td>11251-10</td>
<td>or something similar</td>
</tr>
<tr>
<td>Wound Clip Applicator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>427630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wound Clips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>427630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>K871H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D6429</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30071.03</td>
<td>15%</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-602E</td>
<td>100x</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>101806</td>
<td>200mM = 100x</td>
</tr>
<tr>
<td>Non-essential Aminoacids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11140050</td>
<td>100x</td>
</tr>
<tr>
<td>&beta;-Mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>21985-023</td>
<td>5&mu;l in 500ml</td>
</tr>
<tr>
<td>LIF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>ESG1106</td>
<td>1000x</td>
</tr>
<tr>
<td>MEK inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cell Signaling</td>
<td>9900L</td>
<td>For ES derivation only, add to ES medium (final concentration 50&mu;M)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

transnuclear mice with pre-defined t cell receptor specificities against toxoplasma gondii obtained via scnt

Linfociti, come le cellule T, sottoposti genetica V (D) J ricombinazione, per generare un recettore con una certa specificità 1. Topi transgenici per un riarrangiati antigene-specifici recettori delle cellule T (TCR) è stato uno strumento indispensabile per studiare lo sviluppo delle cellule T e la funzione. Tuttavia, TCR quali di solito sono isolate dalle cellule T rilevante dopo un lungo periodo la cultura spesso a seguito di stimolazione antigenica ripetuta, che seleziona inevitabilmente per le cellule T con alta affinità. Casuale integrazione genomica del TCR α e β-chain e di espressione da non endogena promotori possono portare a variazioni nel livello di espressione e cinetica. Riprogrammazione epigenetica tramite trasferimento nucleare di cellule somatiche fornisce uno strumento per generare cellule staminali embrionali e topi da qualsiasi cellula di interesse. Di conseguenza, quando SCNT è applicato alle cellule T di specificità noto, questi genetica V (D) J riarrangiamenti sono trasferite al SCNT-cellule embrionali staminali (ESC) e dei topi che ne derivano, mentre segnali epigenetici vengono azzerati. Abbiamo dimostrato che le cellule T con pre-definiti specificità contro Toxoplasma gondii può essere usato per generare modelli di topo che esprimono il TCR specifico dal loro loci endogene, senza modificazione genetica introdotta sperimentalmente. La relativa facilità e la velocità con cui tali modelli possono essere ottenuti transnuclear promettente per la costruzione di modelli di altre malattie.

Watch this Scientific Journal Video about Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT at JoVE.com

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Dimostriamo qui che riprogrammazione epigenetica tramite trasferimento nucleare di cellule somatiche (SCNT) può essere utilizzato come uno strumento per generare modelli di topo con pre-definito recettore delle cellule T (TCR) specificità. Questi topi transnuclear esprimono il corrispondente TCR dal loro luogo endogena sotto il controllo del promotore endogeno.

I topi con Transnuclear predefiniti Specificità cellule T contro il recettore Toxoplasma gondii Ottenuto Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

transnuclear-mice-with-pre-defined-t-cell-receptor-specificities

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

14.0K Views.  Whitehead Institute for Biomedical Research. Dimostriamo qui che riprogrammazione epigenetica tramite trasferimento nucleare di cellule somatiche (SCNT) può essere utilizzato come uno strumento per generare modelli di topo con pre-definito recettore delle cellule T (TCR) specificità. Questi topi transnuclear esprimono il corrispondente TCR dal loro luogo endogena sotto il controllo del promotore endogeno.

Video: Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with causing food- and water-borne disease outbreaks. The definitive host is the feline species where sexual replication occurs resulting in the development of the highly infectious and environmentally resistant oocyst. Infection occurs via ingestion of tissue cysts from contaminated meat or oocysts from soil or water. Infection is typically asymptomatic in healthy individuals, but results in a life-long latent infection that can reactivate causing toxoplasmic encephalitis and death if the individual becomes immunocompromised. Meat contaminated with T. gondii cysts have been the primary source of infection in Europe and the United States, but recent changes in animal management and husbandry practices and improved food handling and processing procedures have significantly reduced the prevalence of T. gondii cysts in meat1, 2. Nonetheless, seroprevalence in humans remains relatively high suggesting that exposure from oocyst contaminated soil or water is likely. Indeed, waterborne outbreaks of toxoplasmosis have been reported worldwide supporting the theory exposure to the environmental oocyst form poses a significant health risk3-5. To date, research on understanding the prevalence of T. gondii oocysts in the water and environment are limited due to the lack of tools to detect oocysts in the environment 5, 6. This is primarily due to the lack of efficient purification protocols for obtaining large numbers of highly purified T gondii oocysts from infected cats for research purposes. This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation7.

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation

Ottenere altamente purificato Toxoplasma gondii Oocisti da un gradiente discontinuo di cloruro di cesio

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Toxoplasma gondii parete formazione di cisti in attivo dal midollo osseo macrofagi e condizioni Bradyzoite

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Uno screening genetico per isolare Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

La manipolazione genetica in<em&gt; Δku80</em&gt; Ceppi per analisi genomica funzionale di<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&amp;#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Forward Genetica schermi usando macrofagi per identificare<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; geni importanti per la Resistenza di IFN-γ-Dependent cellulare Immunità autonoma

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Trasduzione retrovirale di cellule progenitrici del midollo osseo per generare cellule T del recettore Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Lo sviluppo di cellule staminali derivate antigene-specifiche cellule T regolatorie contro autoimmunità

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

Identificazione dei mediatori del T-cell Receptor segnalazione tramite lo Screening di librerie chimiche inibitore

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational methods, such as next generation sequencing (NGS), yield enormous sets of data on the antibody repertoire at the sequence level, functional data is required to identify which sequences are relevant for a particular antigen or set of antigens. Here, we describe a method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from a human blood donor. This method utilizes an initial enrichment of mature B cells and requires a combination of phenotypic cell markers and fluorescently-labeled protein to isolate IgG memory B cells via flow cytometry. The heavy and light chain variable regions are then cloned and re-screened. Although limited to the memory B cell compartment, this method takes advantage of flow cytometry to interrogate millions of B cells and returns paired heavy and light chain sequences from a single cell in a format ready for expression and confirmation of specificity. Antibodies recovered with this method can be considered for therapeutic potential, but can also link specificity and function with bioinformatic approaches to assess the B cell repertoire within individuals.

The BSelex method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from human peripheral blood mononuclear cells combines flow cytometry with single cell PCR and cloning.

Metodo di screening a singola cellula per la selezione e il recupero di anticorpi con specifiche desiderate da popolazioni di cellule di memoria umana b arricchite

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...

Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of liver cancer. This is a major concern, especially in developing countries. Failure of the immune system to mount an effective response against HBV leads to chronic infection. Although HBV vaccine is present and novel antiviral medicines are being created, eradication of virus-reservoir cells remains a major health topic. Described here is a method for the generation of viral antigen (Ag) -specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) (i.e., iPSC-CTLs), which have the ability to suppress HBV replication. HBV replication is efficiently induced in mice through hydrodynamic injection of an HBV expression plasmid, pAAV/HBV1.2, into the liver. Then, HBV surface Ag-specific mouse iPSC-CTLs are adoptively transferred, which greatly suppresses HBV replication in the liver and blood as well as prevents HBV surface Ag expression in hepatocytes. This method demonstrates HBV replication in mice after hydrodynamic injection and that stem cell-derived viral Ag-specific CTLs can suppress HBV replication. This protocol provides a useful method for HBV immunotherapy.

Presented here is a protocol for the effective suppression of hepatitis B virus (HBV) replication in mice by utilizing adoptive cell transfer (ACT) of stem cell-derived viral antigen (Ag)-specific T lymphocytes. This procedure may be adapted for potential ACT-based immunotherapy of HBV infection.

Le cellule staminali derivate dall'ag virale specifico t linfociti sopprimeno la replica HBV nei topi

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of ...