Ringraziamo il Sig. Hajime Ichijo per la video-registrazione e consigli utili per l&#39;editing del video. Ringraziamo anche Drs.Yuji Tsunekawa e Kaichi Yoshizaki per gentile assistente per il video-registrazione. Questo lavoro è supportato da KAKENHI su B per giovani scienziati e di priorità Aree-Molecular Brain Science da MEXT del Giappone. Riconosciamo l&#39;appoggio di Global COE Program &quot;Centro di ricerca di base e traslazionale per la scienza del cervello globale&quot; da MEXT del Giappone e il Nucleo di Ricerca per la Scienza e la Tecnologia evolutiva (CREST) ​​da Science e Technology Corporation giapponese di scienza giapponese e Technology Agency (JST) .

1. Impostazione del sistema WEC <ol><li> Misto una membrana di 0,22 micron filtro per il tubo di silicone di ingresso all&#39;interno del sistema WEC a). </li><li> Aprire la valvola di una bombola di gas contenente O 2 (95%) e CO 2 (5%). Flusso della miscela di gas nel tamburo attraverso la bottiglia contenente acqua bolle autoclave. </li><li> Regolare il volume del flusso di miscela di gas a 50 cc. </li><li> Inserire il tubo in silicone da lasciare in una bottiglia d&#39;acqua e controllare il flusso di miscela di gas. </li><li> Ruotare il tamburo alla velocità di 20 giri / min. </li></ol> 2. Preparazione del terreno di coltura <ol><li> Rat-disgelo immediatamente centrifugati (IC) di siero a 37,0 ° C b). Aggiungi D-glucosio (2 mg / ml) nel siero scongelati in un autoclave becher da 100 ml. Terreno di coltura devono essere preparati a livello di cultura principale (ad esempio, con un cappuccio). </li><li> Aggiungi antibiotico-antimicotico (100X) liquidi al siero con 1: 400 di diluizione. </li><li> Vaporizzare isoflurano rimanenti (a causa di anestesia dei ratti durante la raccolta del sangue) dal siero per 20 minuti a temperatura ambiente (RT), c). </li><li> Sterilizzare il terreno di coltura utilizzando un filtro a membrana 0,45 micron. </li><li> Versare 3,0 ml del mezzo in ogni bottiglia cultura e sigillare la parte superiore di ogni bottiglia con un tappo in silicone, coperto con un foglio di alluminio (vedi rif. 14) d). </li><li> Preparare tre o quattro piastre di Petri contenenti disposizione e saline di Tyrode). </li></ol> 3. Anestesia del ratto e l&#39;isolamento dell &#39;utero <ol><li> Anestetizzare un tempo in gravidanza ratto profondamente con anestetici inalatori o parenterale. </li><li> Pulire la zona addominale del ratto anestetizzato incinta con il 70% di etanolo. </li><li> Raccogliete la pelle con una pinza e esteriorizzare la parete addominale per tagliare la pelle con grandi forbici f). </li><li> Raccogliete la parete addominale con un paio di pinze e fare incisioni di grandi dimensioni a forma di U longitudinale sulla parete addominale con le forbici di grandi dimensioni fino al livello toracico g). </li><li> Poggiare l&#39;intestino sul lato sinistro con un paio di pinze ed esporre un capo dell&#39;utero collegato l&#39;ovaio. </li><li> Pick up alla fine del utero con un paio di pinze e tagliare la posizione tra l&#39;utero e le ovaie con le forbici grandi. </li><li> Togliere l&#39;utero dal ratto in gravidanza, tagliando il grasso intorno dell&#39;utero fino alla fine altri dell&#39;utero. </li><li> Trasferimento nell&#39;utero di una piastra di Petri contenente soluzione salina Tyrode è. </li><li> Euthanize il ratto dalla somministrazione eccessiva di anestetico o dislocazione cervicale dopo aver rimosso l&#39;utero. </li></ol> 4. Rimozione di embrioni dall&#39;utero <ol><li> Sciacquare brevemente l&#39;utero in soluzione salina Tyrode e trasferimento al secondo piatto di Petri con un paio di belle pinze h). </li><li> Sotto un microscopio binoculare, prendere la parete uterina, con un paio di pinze sottili e tagliare la parete uterina al lato opposto al mesometrium di collegamento con i vasi sanguigni con le forbici oftalmica dritto. </li><li> Inserire la punta di forbici oftalmica direttamente nello spazio tra la parete uterina e decidua. Tagliare la parete uterina longitudinalmente lungo il lato antimesometrial. </li><li> Clump la decidua a lato mesometrial e conceptuses separato dall&#39;utero utilizzano due coppie di pinze bene i). </li><li> Trasferimento conceptuses al piatto terza Petri con una pipetta di vetro sterilizzati con un diametro adeguato. </li></ol> 5. Dissezione di embrioni di ratto <ol><li> Inserire una punta del microforceps nella decidua e fare una incisione trasversale sul decidua intorno al concepito con due coppie di pinze. </li><li> Inserire le punte della pinza nella decidua a lato placentare e fare due incisioni longitudinali sulle decidua verso l&#39;alto. </li><li> Rimuovere la decidua a lato placentare di ripping che con due coppie di pinze. Rimuovere il restante decidua con due coppie di pinze. </li><li> Pick up membrana Reichert, fare un taglio orizzontale su di esso, e separare la membrana dalla concepimento al anti-placentare lato. </li><li> Fai un piccolo foro sul sacco vitellino vicino alla testa di un embrione con le due coppie di pinze, e tagliare il sacco vitellino con un paio di forbici curve oftalmico. E &#39;importante per non danneggiare i vasi sanguigni principali. </li><li> Sollevare il amnios presso il sito intorno alla testa di un embrione con le due coppie di una pinza sottile e delicatamente estrarre l&#39;embrione del sacco vitellino strappando l&#39;h amnios). Il corpo dell&#39;embrione deve essere tirato fuori il sacco vitellino per aumentare l&#39;apporto di ossigeno per l&#39;embrione nella fase midgestation. </li></ol> 6. Embrione intera cultura <ol><li> Verificare danni sulla placenta, sacco vitellino, e la condizione di battere il cuore e la circolazione sanguigna. </li><li> Essere consapevoli di non estende il cordone ombelicale, il trasferimentol&#39;embrione di una bottiglia di cultura con una pipetta di vetro sterilizzati. Riporto di soluzione salina Tyrode di bottiglie di cultura dovrebbe essere il meno possibile. </li><li> Rimuovere un non-foro spina silicio dalla tamburo dei rotatori. Collegare la bombola di cultura con una spina con un buco al tamburo dei rotatori del sistema WEC perpendicolarmente. Fare attenzione a non mettere vigore il tamburo in direzioni non adatti poiché il tamburo dei rotatori è un apparecchio molto fine. Le bottiglie contenenti l&#39;embrione sezionato vengono trasferiti alla cultura uno per uno, l&#39;apertura della porta d&#39;ingresso del incubatore dovrebbe essere ridotto al minimo per evitare la temperatura dell&#39;incubatore è diminuita j). </li><li> Dopo 10 ore di cultura, di aumentare il volume del flusso di miscela di gas fino a 75 cc e fino a 100 cc dopo 24 ore (Tabella 1). </li><li> Il terreno di coltura deve essere cambiato circa 24 ore con il trasferimento dell&#39;embrione in coltura in una bottiglia nuova cultura di media preparati al momento. Aumentare il volume del flusso massimo di 125 cc dopo 34 hr e un massimo di 150 cc, dopo 48 ore (Tabella 1) </li><li> Di tanto in tanto controllare lo stato degli embrioni coltivati ​​contando tasso di battito cardiaco (cioè, 120-150/min è ottimale) e osservando la circolazione sanguigna. Se necessario contare il numero di somiti per giudicare la crescita di embrioni in soluzione salina di Tyrode. Nello sviluppo normale, uno somite si aggiunge in due ore. </li><li> Quando WEC è finito, stop fornitura di miscela di gas e staccare il tubo di ingresso e la membrana del filtro al fine di evitare il riflusso nel tubo di aspirazione dalla bottiglia bubbling. </li></ol> 7. Note <ol class="lalpha"><li> La temperatura all&#39;interno del sistema WEC è costantemente mantenuto a 37,0-37,5 ° C. </li><li> 100% ratto IC siero viene solitamente usata nei nostri WEC di embrioni di ratto e nel topo, e conservati a -20 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> Acquistiamo ratto IC siero, che sono raccolti da ratti che sono anestetizzati con isoflurano. </li><li> Bottiglie usa e getta sono disponibili anche presso Ikemoto Rika. Bottiglie e tappi in silicone devono essere sterilizzati in autoclave. </li><li> Dissezione di embrioni deve essere eseguita a temperatura ambiente per il mantenimento degli embrioni a bassa o alta temperatura durante la dissezione influenzare lo sviluppo successivo in WEC. </li><li> Strumenti per la dissezione vengono sterilizzati con calore secco. </li><li> La pelle e la parete addominale dovrebbero essere tagliati separatamente per evitare contaminazioni di peli in un piatto il più possibile. Cambiamo un paio di forbici di grandi dimensioni e pinze con un nuovo paio di loro quando abbiamo tagliato la pelle e isolare l&#39;utero, rispettivamente. </li><li> Utilizzando pinze le cui punte vanno bene è molto importante per sezionare tessuti certamente. Noi manualmente affilare le punte delle pinze con una pietra e l&#39;olio della macchina. </li><li> Noi utilizziamo un lato della pinza come un coltello per evitare una pressione eccessiva agli embrioni. </li><li> Quando la temperatura all&#39;interno del sistema WEC diminuisce con l&#39;apertura della porta ripetutamente, continuiamo ad accendere la luce per mantenere la temperatura all&#39;interno del sistema. </li></ol> 8. Rappresentante risultati La figura 1 mostra le procedure di dissezione dell&#39;embrione ratto e gli embrioni di ratto in coltura. <img src="/files/ftp_upload/2170/2170fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Coltura degli embrioni intero dell&#39;embrione E12.5 ratto. (A) concepito sezionato dall&#39;utero del ratto in gravidanza. (B) Rimozione della decidua a lato placenta. (C) Rimozione di membrana di Reichert. (D) L&#39;apertura del sacco vitellino. (E) La coltura degli embrioni di ratto in bottiglia per 6 ore dopo l&#39;inizio del WEC. (F) L&#39;embrione di ratto in coltura per 42 ore. d, decidua, R; membrana di Reichert, p, placenta, ys, sacco vitellino, e, embrione. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 0 ore </td><td> 12 ore </td><td> 24 ore </td><td> 36 ore </td><td> 48 ore </td></tr><tr><td> E12.5 ratto embrione </td><td> 95% 50 cc </td><td> 95% 75 cc (10 hr) </td><td> 95% da 100 cc </td><td> 95% di 125 cc (34 ore) </td><td> 95% 150 cc </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Condizioni ottimali di ossigeno.

<ol>
	<li>New, D. A. T., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intoroduction.+In+mammalian+postimplantation+embryos.">Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos.</a> In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , 1-14 (1990).</li><li>Cockroft, D. L., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+culture+of+post+implantation+embryos.">Dissection and culture of post implantation embryos.</a> In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , 15-40 (1990).</li><li>Morris-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postimplantation+mammalian+embryos.">Postimplantation mammalian embryos.</a> Essential Developmental Biology A Practical Approach. , 55-66 (1993).</li><li>Fujinaga, M., Tuan, R. S., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+rodent+embryos+during+the+early+postimplantation+period.">In vitro culture of rodent embryos during the early postimplantation period.</a> Developmental Biology Protocols. , 53-76 (2000).</li><li>Eto, K., Takakubo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+development+of+rat+embryos+in+culture+during+the+period+of+craniofacial+morphogenesis.">Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis.</a> J. Craniofac. Genet. Dev. Biol. 5, 351-355 (1985).</li><li>New, D. A., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rotating+bottle+culture+method+with+continuous+replacement+of+the+gas+phase.">A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase.</a> Experientia. 35, 138-140 (1979).</li><li>Osumi-Yamashita, N., Ninomiya, Y., Eto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+craniofacial+embryology+in+vitro.">Mammalian craniofacial embryology in vitro.</a> Int. J. Dev. Biol. 41, 187-194 (1997).</li><li>Inoue, T., Nakamura, S., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+of+the+mouse+prosencephalic+neural+plate.">Fate mapping of the mouse prosencephalic neural plate.</a> Dev. Biol. 219, 373-383 (2000).</li><li>Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6-dependent+boundary+defines+alignment+of+migrating+olfactory+cortex+neurons+via+the+repulsive+activity+of+ephrin+A5.">Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5.</a> Development. 133, 1335-1345 (2006).</li><li>Inoue, Y. U., Asami, J., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+labeling+of+mouse+rhombomeres+by+Cadherin-6::EGFP-BAC+transgenesis+underscores+the+role+of+cadherins+in+hindbrain+compartmentalization.">Genetic labeling of mouse rhombomeres by Cadherin-6::EGFP-BAC transgenesis underscores the role of cadherins in hindbrain compartmentalization.</a> Neurosci. Res. 63, 2-9 (2009).</li><li>Calegari, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inhibition+of+cyclin-dependent+kinases+that+lengthens,+but+does+not+arrest,+neuroepithelial+cell+cycle+induces+premature+neurogenesis.">An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis.</a> J. Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li><li>Arai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Fabp7,+a+downstream+gene+of+Pax6,+in+the+maintenance+of+neuroepithelial+cells+during+early+embryonic+development+of+the+rat+cortex.">Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex.</a> J. Neurosci. 25, 9752-9761 (2005).</li><li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 485-497 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ci sono due passaggi critici nel WEC roditori per il successo. In primo luogo, la procedura di dissezione dovrebbe essere accurato per non danneggiare gli embrioni, soprattutto vasi sanguigni. In secondo luogo, la procedura dovrebbe essere il più rapidamente possibile, perché l&#39;ossigeno e nutrienti non sono più forniti attraverso la placenta dopo l&#39;isolamento dall&#39;utero. Questo è fondamentale per i vecchi embrioni. Nel caso del WEC ratto dopo E12.5, dovremmo trasferire embrioni sezionati in bottiglie di ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Tipo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commento </td></tr><tr><td colspan="5"> Impostazione WEC </td></tr><tr><td> WEC sistema (10-0310) </td><td> Strumento </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-0310 </td><td> Un altro piccolo modello è inoltre disponibile. </td></tr><tr><td> Tappo in silicone senza foro </td><td> Strumento </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-08 </td><td></td></tr><tr><td> Miscela di gas cilindro </td><td> Strumento </td><td> Nikko Sanso </td><td> - </td><td> Contenente 95% di ossigeno e di anidride carbonica del 5%. Ordine personalizzato. </td></tr><tr><td> Regolatore del gas </td><td> Strumento </td><td> Ono Seisakusho </td><td> WR-11 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 micron filtro Millex GS </td><td> Strumento </td><td> Millipore </td><td> SLGS033SS </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Anestesia e isolamento dell&#39;utero </td></tr><tr><td> Forbici di grandi dimensioni </td><td> Strumento </td><td> Napox </td><td> B-7H </td><td></td></tr><tr><td> Forcipe </td><td> Strumento </td><td> Napox </td><td> A-3-2 </td><td></td></tr><tr><td> Piatto disposizione Petri (90 mm x 15 mm) </td><td> Strumento </td><td> Iwaki </td><td> SH90-15 </td><td> Profonda di tipo piatto è la migliore per la dissezione. </td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> Reagente </td><td> Abbott </td><td> B506 </td><td> Per l&#39;anestesia </td></tr><tr><td> Di sodio pentobarbital </td><td> Reagente </td><td> Schering-Plough Animal Health </td><td> - </td><td> Per l&#39;anestesia </td></tr><tr><td> Tyrode della salina </td><td> Reagente </td><td> - </td><td> - </td><td> Secondo il protocollo di rif. 2. Salva a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Cronometrato in gravidanza ratto Sprague-Dawley </td><td> Animale </td><td> Fiumi Charles Laboratori Giappone </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Preparazione del terreno di coltura </td></tr><tr><td> Cultura bottiglia di vetro </td><td> Strumento </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-05 </td><td></td></tr><tr><td> Smaltimento cultura bottiglia </td><td> Strumento </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-06 </td><td></td></tr><tr><td> Tappo in silicone con foro </td><td> Strumento </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Foglio di alluminio </td><td> Strumento </td><td> Ogni azienda </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> Sacchetto in autoclave </td><td> Strumento </td><td> Hogy </td><td> HM-26 </td><td> Per le bottiglie di cultura </td></tr><tr><td> Sacchetto in autoclave </td><td> Strumento </td><td> Hogy </td><td> HM-14A </td><td> Per i tappi di silicone </td></tr><tr><td> 0,45 micron filtro Millex HA </td><td> Strumento </td><td> Millipore </td><td> SLHA033SS </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml tubo conico </td><td> Strumento </td><td> Becton Dickinson </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> Bicchiere da 100 ml </td><td> Strumento </td><td> Iwaki </td><td> TE-32 </td><td></td></tr><tr><td> Rat IC siero </td><td> Reagente </td><td> Fiumi Charles Laboratori Giappone </td><td> - </td><td> Si riferiscono a: Sig. Kunihiko Morisaki, TEL: +81- (0) 45-474-9336; FAX: +81- (0) 45-474-9340 </td></tr><tr><td> D (+)-glucosio </td><td> Reagente </td><td> Wako </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotico-antimyotic liquido </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Dissezione di embrioni </td></tr><tr><td> Forbici oftalmica dritto </td><td> Strumento </td><td> Napox </td><td> MB50-7 </td><td> Per il taglio della parete uterina </td></tr><tr><td> Forbici curve oftalmica </td><td> Strumento </td><td> Napox </td><td> MB54-2 </td><td> Per il taglio del sacco vitellino </td></tr><tr><td> Pinza # 5 </td&gt; <td> Strumento </td><td> Vigore </td><td> T6715 </td><td></td></tr><tr><td> Pinza # 5F </td><td> Strumento </td><td> Regine </td><td> T6819 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetta di vetro </td><td> Strumento </td><td> - </td><td> - </td><td> Fatti a mano utilizzando pipetta Pasteur. </td></tr><tr><td> Sacchetto in autoclave </td><td> Strumento </td><td> Hogy </td><td> HM-4 </td><td> Per pipette in vetro </td></tr><tr><td> Microscopio binoculare </td><td> Strumento </td><td> Leica </td><td> Mz7s </td><td></td></tr><tr><td> Luce </td><td> Strumento </td><td> Leica </td><td> CLS 150XD </td><td></td></tr><tr><td> Olio di pietra </td><td> Strumento </td><td> Uchida Yoko </td><td> 833-2000 </td><td> Per l&#39;affilatura di forcipe </td></tr><tr><td> Olio per macchine </td><td> Strumento </td><td> Uchida Yoko </td><td> 835-0000 </td><td> Per l&#39;affilatura di forcipe </td></tr></tbody></table>

the method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system

Intera coltura degli embrioni (WEC), la tecnica è stata sviluppata nel 1950 da New e dei suoi colleghi, e applicato per la biologia dello sviluppo 1. Anche se lo sviluppo e la crescita di embrioni di mammifero sono criticamente dipendente dal funzionamento della placenta, WEC tecnica ci permette di topo cultura e di embrioni di ratto condizione di ex-vivo durante i periodi limitati corrispondenti a fasi midgestation durante il giorno embrionale (E) 6,5 E12.5 nel mouse o E8.5-E14.5 nel ratto 2, 3, 4. In WEC, possiamo direttamente target desiderato aree di embrioni con fini di vetro capillari, perché gli embrioni possono essere manipolati al microscopio. Pertanto, WEC roditore è una tecnica molto utile quando si vogliono studiare i processi di sviluppo dinamico di postimplanted embrioni di mammifero. Fino ad oggi, diversi tipi di sistemi sono stati sviluppati WEC 1. Tra questi, il rotore di tipo sistema di coltura bottiglia è più popolare e adatto a lungo termine cultura di embrioni a midgestation, cioè dopo la E9.5 e E11.5 nel topo e ratto, rispettivamente 1. In questo protocollo video, dimostriamo il nostro procedure standard del WEC ratto dopo E12.5 utilizzando un modello raffinato del sistema originale dei rotatori, che è stato progettato per nuovi e di Cockroft 5, 6, e introdurre le varie applicazioni della tecnica WEC per gli studi di sviluppo dei mammiferi biologia.

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The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Tutta la tecnica di coltura degli embrioni del mouse ci permette di cultura e di embrioni di ratto<em&gt; Ex vivo</emCondizione&gt; durante i periodi limitati corrispondenti a fasi midgestation. In questo protocollo video, abbiamo dimostrato le nostre procedure standard di coltura degli embrioni di ratto dopo tutto E12.5 con il rotore di tipo sistema cultura bottiglia.

Il metodo di coltura degli embrioni roditori intero utilizzando il Rotator tipo di sistema cultura Bottiglia

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

the-method-rodent-whole-embryo-culture-using-rotator-type-bottle

Research

JoVE Journal

Biology

23.6K Views.  Tohoku University Graduate School of Medicine. Tutta la tecnica di coltura degli embrioni del mouse ci permette di cultura e di embrioni di ratto Ex vivo durante i periodi limitati corrispondenti a fasi midgestation. In questo protocollo video, abbiamo dimostrato le nostre procedure standard di coltura degli embrioni di ratto dopo tutto E12.5 con il rotore di tipo sistema cultura bottiglia.

Video: The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

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The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

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Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Un Ex-ovo Sistema di embrioni di pollo Cultura Adatto per applicazioni di imaging e Microchirurgia

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metodo di Cultura per il mouse embrionale del cuore

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Embrionali di topo di sviluppo in un embrione di tutta la cultura di sistema privo di siero

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

Il Metodo Culture Slice per seguire lo sviluppo dei germi dente Espianto Cultura

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Preparazione di Rat Siero Adatto per mammiferi tutta la cultura Embrione

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Istituzione di un pH extracellulare acido sistema cultura

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular matrix. The ability of CSCs to participate in the development of endothelium constitutes an important characteristic that directly contributes to the general understanding of the mechanisms of tumorigenesis and tumor metastasis. The purpose of this work is to establish a reproducible methodology to investigate the tumor-initiation capability of ovarian cancer stem cells (OCSCs). Herein, we examined the neovascularization mechanism between endothelial cells and OCSCs along with the morphological changes of endothelial cells using the in vitro co-culture model NICO-1. This protocol allows visualization of the neovascularization step surrounding the OCSCs in a time course manner. The technique can provide insight regarding the angiogenetic properties of OCSCs in tumor metastasis.

Ovarian cancer stem cells (OCSC) are responsible for cancer initiation, recurrence, therapeutic resistance, and metastasis. The OCSC vascular niche is considered to promote self-renewal of OCSCs, leading to chemoresistance. This protocol provides the basis for establishing a reproducible OCSC vascular niche model in vitro.

Valutazione delle proprietà angiogenetiche delle cellule staminali del cancro ovarico utilizzando il sistema di co-coltura tridimensionale, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera frugiperda (Sf9) cells with Sf9 cells infected with baculovirus (BV)-AAV2-GFP (or therapeutic gene) and BV-AAV2-rep-cap in serum-free suspension culture. Cells are cultured in a flask in an orbital shaker or Wave bioreactor. To release the AAV particles, producer cells are lysed in buffer containing detergent, which is subsequently clarified by low-speed centrifugation and filtration. AAV particles are purified from the cell lysate using AVB Sepharose column chromatography, which binds AAV particles. Bound particles are washed with PBS to remove contaminants and eluted from the resin using sodium citrate buffer at pH 3.0. The acidic eluate is neutralized with alkaline Tris-HCl buffer (pH 8.0), diluted with phosphate-buffered saline (PBS), and further concentrated with tangential flow filtration (TFF). The protocol describes small-scale pre-clinical vector production compatible with scale-up to large-scale clinical-grade AAV manufacturing for human gene therapy applications.

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

In this protocol, AAV2 vector is produced by co-culturing Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells with baculovirus (BV)-AAV2-green fluorescent protein (GFP) or therapeutic gene and BV-AAV2-rep-cap infected Sf9 cells in suspension culture. AAV particles are released from the cells using detergent, clarified, purified by affinity column chromatography, and concentrated by tangential flow filtration.

Sviluppo del processo per la produzione e la purificazione del vettore adeno-associato al virus (AAV)2 utilizzando il sistema di coltura cellulare baculovirus-insetto