Questo protocollo sarà utile per i ricercatori che vogliono sviluppare metodi per la produzione e la purificazione di AAV utilizzando il sistema di coltura cellulare baculovirus-insetto. La produzione di AAV utilizzando il sistema di coltura cellulare baculovirus-insetto è un metodo economico che è facile da scalare ed è compatibile con le attuali buone pratiche di fabbricazione. Alcune parti del protocollo saranno dimostrate da Alan Heizer, un assistente di ricerca del mio laboratorio.
Inizia scongelando una fiala di cellule Sf9 e seminale immediatamente in 15 millilitri di terreno di coltura cellulare di insetti. Coltiva cellule Sf9 in un incubatore shaker orbitale a 125 RPM e 28 gradi Celsius in palloni a fondo tondo con un cappuccio liberamente fissato per lo scambio d'aria. Propagare le cellule in un pallone da un litro contenente 200 millilitri di terreno per ottenere abbastanza celle per la produzione di cellule TIPS.
Aggiungere 50 millilitri di celle Sf9 a 2 volte 10 alle 6 celle di potenza per millilitro in due palloni. Infettare un pallone di cellule Sf9 con 0,5 millilitri di baculovirus-AAV2-GFP e l'altro pallone di cellule con 0,5 millilitri di baculovirus-AAV2-rep-cap. Tre giorni dopo, raccogli una piccola aliquota di cellule Sf9 infette da baculovirus, note anche come cellule TIPS.
Macchiare 2 volte 10 alla quinta potenza di cellule Sf9 non infette e infette da baculovirus con 0,5 microgrammi di anticorpo anti-baculovirus gp64 di topo contenente un colorante fluorescente in 100 microlitri di tampone bloccante per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo aver lavato le cellule con PBS per rimuovere l'anticorpo, sospendere nuovamente le cellule colorate in 300 microlitri di PBS contenenti 0,5 albumina sierica bovina. Analizzare l'espressione del baculovirus gp64 sulle cellule utilizzando la citometria a flusso.
Quando le cellule sono vitali dall'80 al 90%, con un aumento del diametro, raccogliere le cellule e crioconservare 1 volte 10 alle cellule di 7a potenza in un millilitro di terreno di coltura di insetti, soppiantato con il 10% di siero bovino fetale e il 10% di dimetilsolfossido in un contenitore a congelamento lento a 80 gradi Celsius negativi. Il giorno successivo, trasferire il tubo contenente le celle TIPS in un congelatore ad azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Coltiva e coltiva cellule Sf9 naïve a 2 volte 10 alla 6a cella di potenza per millilitro a 28 gradi Celsius in diversi palloni da due litri contenenti 400 millilitri di terreno di coltura cellulare di insetti in un incubatore shaker necessario per la produzione di virus adeno-associati o AAV.
Dopo tre o quattro giorni, la densità cellulare viene aumentata fino a 5-6 volte 10 alle 6 celle di potenza per millilitro. Per la produzione di AAV in palloni in un incubatore shaker orbitale, utilizzare una pipetta o una pompa peristaltica per seminare 400 millilitri di coltura Sf9 a 2 volte 10 alla 6a cella di potenza per millilitro in un pallone da due litri, in modo asettico. Impostare lo shaker orbitale a 125 RPM e 28 gradi Celsius.
Scongelare una fiala di ogni cellula TIPS baculovirus-AAV-GFP e baculovirus-AAV-rep-cap. Diluire le cellule con 20 millilitri di terreno di coltura degli insetti ed eseguire un conteggio di vitalità delle cellule usando il tripano blu. Inoculare entrambe le cellule TIPS con un rapporto compreso tra 1 e 10.000 rispetto alle cellule Sf9 naïve coltivate in un pallone shaker o in un bioreattore.
Il secondo giorno, raccogliere un millilitro di coltura Sf9 in modo asettico e colorare con il colorante blu tripano per analizzare il numero di cellule, la vitalità e la morfologia. Il terzo giorno, ripetere i passaggi eseguiti il secondo giorno e controllare lo stato dell'infezione da baculovirus dopo aver macchiato le cellule Sf9. Il quinto giorno, ripetere i passaggi eseguiti il secondo giorno, quindi raccogliere il terreno di coltura e le cellule quando la vitalità di Sf9 è diminuita a circa il 50% Raccogliere il surnatante e il pellet cellulare dopo la rotazione e conservarli a 80 gradi Celsius negativi.
Una volta scongelato il pellet cellulare produttore di AAV, aggiungere il tampone di lisi cellulare e mescolare vigorosamente. Incubare il pellet ri-sospeso per 30 minuti a temperatura ambiente per rilasciare le particelle AAV. Dopo la centrifugazione, trasferire il lisato cellulare in un nuovo contenitore.
Mescolare il lisato cellulare e il surnatante di coltura cellulare dopo lo scongelamento. Aggiungere 20 unità per millilitro nucleasi e cloruro di magnesio 10 millimolare al lisato cellulare per digerire il DNA e l'RNA e incubare per due o quattro ore a 37 gradi Celsius. Filtrare il lisato attraverso un sistema di doppia filtrazione in polietersolfone da 0,8 micrometri e 0,2 micrometri utilizzando una pompa.
Conservare il lisato cellulare chiarificato a quattro gradi Celsius durante la notte o purificare immediatamente l'AAV. Montare una colonna di sefarosio AVB da 10 millilitri sulla macchina per cromatografia e inserire la tubazione nel campione AAV, nel tampone di lavaggio e nel tampone di eluizione. Inserire i tubi nelle fessure del collettore di frazioni della macchina per cromatografia per raccogliere le frazioni di soluzione passante della colonna, tampone di lavaggio e tampone di eluizione contenenti le particelle AAV.
Equilibrare la colonna AVB Sepharose con cinque volumi di colonne di PBS ad una portata di cinque millilitri al minuto. Caricare il lisato cellulare filtrato contenente particelle AAV sulla colonna di affinità AVB Sepharose utilizzando la macchina cromatografica dotata di una pompa campione. Eseguire il campione a una portata di tre millilitri al minuto.
Eseguire PBS attraverso la colonna a una portata di tre millilitri al minuto fino a quando la curva di assorbanza ultravioletta a 280 nanometri ritorna alla linea di base e diventa stabile. Eluire le particelle AAV dalla colonna AVB Sepharose con tampone di citrato di sodio 50 millimolari pH 3 ad una portata di tre millilitri al minuto. Diluire immediatamente il surnatante AAV con un quinto del volume di Tris HCl 8.0 da 500 millimolari per neutralizzare il tampone di eluizione acida contenente AAV.
Ciò impedisce la degradazione mediata dal pH che potrebbe verificarsi con il tampone di eluizione a pH 3,0 acido. Quindi diluire il surnatante AAV dieci volte con PBS, in modo che le particelle AAV siano in un tampone fisiologico. Conservare un millilitro di ciascun campione run-through della colonna, tampone di lavaggio e 100 microlitri del surnatante AAV eluito per valutare la presenza di AAV per infezione delle cellule bersaglio.
Impostare il sistema di filtrazione a flusso tangenziale, dotato di una cartuccia a membrana di polietersolfone con un taglio di peso molecolare di 100 kilodalton per concentrare l'AAV. Eseguire 200 millilitri di PBS per 10 minuti per bilanciare il modulo di filtrazione a flusso tangenziale. Caricare il campione AAV controllando il flusso della pompa fino a quando il campione non viene ridotto al volume desiderato.
Diafiltrare il retentato con 100 millilitri di PBS. Dopo aver concentrato il campione AAV al volume desiderato, raccogliere il campione AAV, filtrarlo attraverso un filtro polietersolfone da 0,2 micrometri e aliquotarlo. Quindi conservare il campione AAV a 80 gradi Celsius negativi.
La maggior parte delle cellule Sf9 è stata infettata dal baculovirus in tre o quattro giorni, a causa dei molteplici cicli di infezione, evidenziati dall'espressione della glicoproteina gp64 del baculovirus. La maggior parte delle cellule mostra anche un aumento del diametro. Le cellule mostrano un aumento del diametro, effetto citopatico, e circa la metà delle cellule muore in cinque giorni dopo l'infezione, che sono i segni del completamento della produzione di AAV.
Un picco di proteine è stato osservato durante l'eluizione con un tampone acido corrispondente alla frazione AAV. I campioni AAV purificati mostrano tre distinte proteine del capside: VP1, VP2 e VP3, dopo SDS-PAGE e colorazione dell'argento. Il passo più critico è la raccolta delle cellule TIPS prima della crioconservazione, quando la maggior parte delle cellule viene infettata dal baculovirus, con un numero minimo di morte cellulare.
Abbiamo descritto la produzione e la purificazione del vettore AAV del sierotipo 2 come modello qui. Tuttavia, il protocollo può essere applicato anche per altri sierotipi AAV.
