Vorremmo ringraziare il Dott. Julie Gordon e il Dr. Nancy Manley per il loro consiglio utile con la tecnica cultura. Questo lavoro è stato sostenuto da Glaucoma Fondazione dei Bambini e Sharon-Stewart aniridia Research Trust.

Cultura embrione di topo: Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in stretta conformità con le linee guida del National Institutes of Salute seguente protocollo # A2010 07-119, che è stato esaminato e approvato dalla University of Georgia Institutional Animal Care ed uso commissione, che mantiene costante supervisione regolamentare. 1. Preparazione of Culture Media <ol><li> Preparare terreno di coltura utilizzando supporti e integratori di cellule staminali disponibili in commercio nei seguenti importi: KnockOut DMEM, KnockOut Serum Replacement (KSR) (10%), N-2 Supplementare (1x), albumina, da siero bovino (2%), penicillina ( 50 UI / ml), streptomicina (50 mg / ml) e Amfotericina B-(1,25 mg / ml). Il mezzo di coltura preparato è simile a quello precedentemente descritto 15 con le seguenti modifiche: aggiunta di antimicotici e utilizzando due volte la concentrazione di antibiotici (per dettagli di reagenti e attrezzature specifiche, vedere List dei Materiali). Nota: la concentrazione di antibiotici usati in precedenza (. Moore-Scott, et al 15) era sufficiente per le culture embrioni effettuate fino a 24 ore periodo di tempo. Tuttavia, quando la cultura era continuata oltre 24 ore, abbiamo sperimentato la contaminazione della cultura e questo è stato controllato con successo raddoppiando la concentrazione di antibiotico. </li><li> Conservare i componenti Media a 4 ° C oa -20 ° C secondo le raccomandazioni del produttore. KSR e N-2 Supplemento devono essere conservati in aliquote a -20 ° C per evitare ripetuti di congelamento e scongelamento. KnockOut DMEM una volta aperto deve essere utilizzato entro 30 giorni secondo la raccomandazione del costruttore. Prima dell&#39;uso, riscaldare le parti in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Preparare il supporto in condizioni sterili. Disinfettare la superficie di tutte le apparecchiature e le bottiglie contenenti i componenti multimediali con il 70% spruzzo di alcol prima di metterli nel cofano cultura. </li><li> I componenti media possono essere addizionate sia in un becher sterile o direttamente nel sistema di filtro (Corning). Primo aggiungere la polvere di albumina per il ko DMEM. Mescolare accuratamente scuotendo delicatamente fino a quando l&#39;albumina si scioglie completamente. Quindi aggiungere il N-2 Supplement, KSR e gli antibiotici e mescolare accuratamente con una pipetta. Poi filtrare sterilizzare i media usando un filtro dimensione dei pori 0,22 micron con aspirazione a vuoto. Erogare i media in 50 ml provette coniche e conservare a 4 ° C fino all&#39;uso. I media una volta preparati devono essere utilizzati entro 4-5 giorni per la cultura. </li></ol> 2. Preparazione delle attrezzature Cultura <ol><li> Sterilizzare le bottiglie di coltura di vetro e tappi di gomma. Avvolgere le bottiglie di coltura in un foglio di alluminio e mettere i tappi delle bottiglie di gomma in un bicchiere di acqua e sterilizzare in autoclave. </li><li> Sterilizzare la camera di coltura (Precision Incubator Unit) con il 70% spruzzo alcol e riscaldare a 37 ° C prima dell&#39;inizio della coltura. La camera di cultura escherzato con un disco di rotolamento al centro che tiene le bottiglie di coltura. Il flusso di gas nella camera è regolata da un manometro e la portata può essere regolata osservando la fuoriuscita di bolle d&#39;aria attraverso l&#39;acqua in un tubo di vetro alla fine. Questo rotolamento apparecchio di coltura bottiglia è una versione modificata dell&#39;apparecchiatura originale introdotte dalla New Cockroft e 17. </li><li> Collegare una bombola di gas contenente una miscela di gas di 95% O 2/5% di CO 2 alla camera di coltura e regolare il flusso di gas a &quot;una bolla d&#39;aria al secondo&quot; che fornisce una portata di 50 cc / min e assicura un adeguato apporto di ossigeno per gli embrioni di cultura. </li></ol> 3. Mouse Embryo Raccolta e preparazione per la Cultura <ol><li> Per ottenere wild type embrioni di topo, abbiamo utilizzato topi di C57BL/6J e CD-1 (Charles River Laboratories) ceppi background genetico. </li><li> Controllare i topi femmina per tappi vaginali ogni giorno mattina. Il mezzogiorno del giorno di trovare the spina vaginale dovrebbe essere considerato come E0.5 DPC (giorni dopo il coito). </li><li> Raccogliere embrioni di topo a E10.5 DPC dai eutanasia topi in gravidanza seguenti protocolli standard. I topi sono stati sacrificati mediante un dispositivo di inalazione di CO 2, come specificato dalla American Veterinary Medical Association (AVMA) Linee guida per l&#39;eutanasia degli animali (2013). Per assicurare morte, dislocazione cervicale è stata eseguita dopo esposizione a CO 2. </li><li> Spray etanolo al 70% sulla superficie addominale ventrale per evitare incollaggio di capelli addominale agli strumenti. Quindi aprire la cavità addominale ventrale utilizzando un tagliente-smussato forbici operativi e un paio di 4-3/4 in microdissecting pinze per individuare l&#39;utero. Utilizzando una pinza 4 in microdissecting sollevare l&#39;intero utero e separarlo dal corpo tagliando con una leggera forbici operativi al corpo uterino e alle punte delle corna uterine. </li><li> Sciacquare rapidamente l&#39;intero utero in 1x PBS riscaldato a 37 ° Cper rimuovere qualsiasi incollaggio sangue verso l&#39;utero e collocare immediatamente in DMEM riscaldato a 37 ° C in una piastra di Petri. Sterilizzare gli strumenti del 70% di etanolo spray prima ulteriore utilizzo. Nota: preriscaldamento soluzioni compresa la PBS, DMEM e mezzo di coltura e mantenendole a 37 ° C durante l&#39;intera procedura è consigliata. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, l&#39;utero deve essere segmentalmente sezionato con una leggera forbice operativi. Ciò si traduce in piccole aperture ai lati dell&#39;utero segmentato attraverso la quale una coppia di modificati (estremità smussate) pinzette microdissecting può essere inserito delicatamente per allargare l&#39;apertura. Ciò permette l&#39;esposizione del decidua placentare, che può poi essere rimosso strappando delicatamente con una pinzetta microdissecting per esporre il sacco vitellino parietale (PYS) con membrana della Reichert. Utilizzando un bordo della pinzetta perforare delicatamente la membrana del Reichert insieme ai PYS e separare da the sottostante viscerale sacco vitellino (VYS) strato per esporre gli embrioni con VYS intatti. Il cono ectoplacental ei derivati ​​trophoectoderm possono essere rimossi sia con la decidua placentare o con membrana di Reichert. Si deve prestare attenzione per evitare la rottura del VYS come gli embrioni pop immediatamente. </li><li> Gli embrioni con VYS intatti dovrebbero essere trasferiti in una piastra Petri contenente il terreno di coltura riscaldata a 37 ° C con una pipetta di plastica trasferimento. Nota: Trasferimento a mezzo di coltura subito dopo la separazione dall&#39;utero aiuta per un migliore sviluppo dell&#39;embrione nella cultura. </li><li> Una piccola apertura dovrebbe essere effettuato nel sacco vitellino con un paio di pinzette microdissecting evitando principali vasi sanguigni. Un forte pinzetta può essere usato per fare l&#39;apertura forando delicatamente in una zona adiacente alla regione della testa. In alternativa, due paia di pinzette smussate possono essere utilizzati per tenere il sacco vitellino e delicatamente strappare a fare una piccola apertura.Poi allargare leggermente l&#39;apertura espandendo con la pinzetta a una dimensione appena sufficiente per adattarsi alla testa embrionale. La membrana amniotica che è strettamente avvolgendo l&#39;embrione dovrebbe essere tenuto delicatamente via dal corpo e strappata usando un paio di pinzette. La testa embrionale e poi dell&#39;intera embrione dovrebbero essere esteriorizzato delicatamente dal sacco vitellino mantenendo l&#39;integrità del sistema vascolare embrionale con quello del sacco vitellino 15. Nota: Eventuali danni alla vascolarizzazione sacco vitellino potenzialmente in grado di influenzare lo sviluppo dell&#39;embrione in coltura. Tali embrioni con vasi danneggiati non devono essere utilizzati per la coltura e possono essere utilizzati per mettere in scena gli embrioni che può essere successivamente scartati. </li><li> Criteri di stadiazione embrionali: esaminare gli embrioni sotto il microscopio da dissezione e di gruppo in base a criteri morfologici, tra cui corpo e la dimensione della testa, degli arti e la morfologia degli occhi e stage contando il numero di somite (s) per almeno due embrioni di ogni gruppo. &lt;strong&gt; Nota: Solitamente embrioni ottenuti dalle stesse differenze lettiera mostra di sviluppo in utero e si differenziano per le dimensioni del corpo, caratteristiche morfologiche e il numero di somiti. Tuttavia, abbiamo scoperto che gli embrioni raggruppati per i nostri criteri morfologici solitamente esposte numero somite simile (± 1). Per questo motivo, non è necessario contare somiti per ogni embrione come questo sarebbe ritardare il tempo per avviare la coltura. Nota: non utilizzare gli embrioni che sono stati utilizzati per contare i somiti per la cultura. Contare le somiti dopo aver avviato la coltura per altri embrioni per evitare il ritardo nell&#39;iniziare la cultura. Gli embrioni che sono stati ritardati alla cultura dopo la separazione dall&#39;utero di solito mostrano scarso sviluppo. </li><li> Trasferire gli embrioni immediatamente ad una piastra di Petri con coltura fresco medio riscaldato a 37 ° C e portarlo alla cappa cultura in cui gli embrioni devono ancora essere trasferiti ad una piastra di Petri sterile con culture supporti prima di metterle in bottiglie di coltura con terreno per iniziare la cultura. Nota: I trasferimenti multipli media per gli embrioni prima cultura aiuta a prevenire la contaminazione come le diverse fasi di prelievo e dissezione sono state eseguite sotto un microscopio da dissezione che non è stato installato nella cappa coltura. Nota: Quando la dimensione della cucciolata è di grandi dimensioni (&gt; 12 embrioni), processo la metà degli embrioni e avvia la cultura o metterli in un piatto con terreno di coltura e collocarlo in un incubatore CO 2 a 37 ° C. Quando gli embrioni sono stati lasciati fuori per periodi più lunghi (&gt; 35-40 min) abbiamo osservato il battito cardiaco a rallentare e questo influenzerà il successivo sviluppo nella cultura. </li></ol> 4. Coltura di embrioni di topo <ol><li> Aprire le bottiglie di coltura in autoclave nel cofano cultura e correttamente li etichetta. Trasferire 3 ml di terreno di coltura riscaldata a 37 ° C per ciascuna di tegli bottiglie e poi gli embrioni di topo devono essere trasferite delicatamente le bottiglie di coltura utilizzando sterili pipette di plastica. Le bottiglie di coltura devono poi essere tappate con i tappi di bottiglia in gomma che aiutano a tenere le bottiglie di coltura per il disco di laminazione nell&#39;apparato cultura. Nota: Le bottiglie di coltura con i media possono essere preparati e immessi sul disco rotolamento dell&#39;apparato cultura prima eutanasia topi. Questo riduce il tempo di trasferimento di embrioni in bottiglie di coltura. Nota: embrioni di topo possono essere coltivate singolarmente o come co-colture con due o tre embrioni nella stessa bottiglia cultura. </li><li> Le bottiglie di coltura devono essere effettuate asetticamente all&#39;apparecchio coltura a 37 ° C e strettamente agganciarli ai fori sul disco rotolamento con i tappi di gomma. Accendere il disco laminazione a ruotare ad una velocità costante di 35 giri al minuto (rpm), che consente il libero galleggiamento del embryos nei media e aiuta anche in cambio gas libero dal tessuto embrionale. Il gas dal cilindro collegato alla camera di coltura fluisce attraverso il disco di rotolamento e tappi di gomma nelle bottiglie di coltura. </li><li> Cultura gli embrioni per 16-40 ore e controllare regolarmente per il deflusso dei gas e la temperatura camera di coltura. Nota: la manipolazione degli embrioni Mouse in cultura: Lasciate che gli embrioni vengono adattate alle condizioni di coltura per almeno 30 min. Poi embrioni che eseguono male e mostra il battito cardiaco debole possono essere scartati e le restanti embrioni possono essere utilizzati per ulteriori studi di manipolazione. Manipolazioni Embrione come l&#39;elettroporazione 5,9,16, microiniezioni 18, perlina impianto 16, il trattamento farmacologico e le altre procedure possono essere eseguite in questo momento. Abbiamo eseguito con successo l&#39;impianto di affi-gel agarosio perle trattati con determinate molecole di segnalazione per studiare il loro ruolo nello sviluppo dell&#39;occhio presto. Gli embrioni dopomanipolazioni possono essere restituiti indietro in un mezzo fresco e proseguite nella cultura. </li><li> Sostituire i terreni di coltura totalmente con mezzi freschi a intervalli specifici dopo 9-10 ore e 18-19 ore di cultura in cui la cultura è stata continuata per 40 ore. Nota: Culture sostituzione supporto non può essere richiesta se la cultura viene fermato da 16-18 ore. </li><li> Misure di successo nella cultura: la sopravvivenza embrionali in coltura deve essere determinato dal battito cardiaco visibile e la circolazione del sangue nel corpo durante la crescita embrionale nella cultura dovrebbe essere valutata da aumento di dimensioni del corpo, il numero somite e sviluppo morfologico della testa, degli arti, cuore e gli occhi. </li><li> In utero sviluppato embrioni a E11.0 DPC (~ 40-41 s) e E12.0 DPC (~ 49-50 s) dovrebbe essere utilizzato come controllo per il confronto embrioni coltivati ​​per 16-18 ore e 38-40 ore, rispettivamente. </li><li> Lo sviluppo embrionale in diversi momenti durante la cultura e per a tappe utero può essere Captrato sotto dissezione microscopio. Software di imaging spot è stato utilizzato per catturare le immagini e successivamente elaborati utilizzando il software di elaborazione delle immagini. </li></ol>

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Noi non abbiamo interessi finanziari concorrenti.

Embrioni metà della gestazione topo fase sono state coltivate in un mezzo di coltura privo di siero in un&#39;atmosfera di 95% O 2/5% di CO 2 in un apparecchio di coltura bottiglia rotolamento a 37 ° C. Sviluppo embrionale ex utero è criticamente dipendente da molteplici fattori ad ogni passo durante la procedura dal momento in cui il utero è isolato dai topi sacrificati al completamento della coltura (Figura 1). Il fattore più importante che influenza lo sviluppo è ...

In vitro metodi colturali che utilizzano embrioni integrali sono adatti a studiare meccanismi di segnalazione coinvolti nella organogenesi embrionale che sono altrimenti di difficile accesso in utero. Embrioni integrali forniscono l&#39;integrità dei tessuti e un sostegno adeguato per le interazioni dei tessuti che sono cruciali per la tempestiva presenza di meccanismi di segnalazione essenziali per i diversi processi cellulari durante l&#39;organogenesi. Mentre intere culture embrione di fornire una piattaforma per una pletora di applicazioni come gli studi di trapianto, manipolazioni genetiche e biologiche, studi tallone di impianto, gli studi tossicologici, ecc., Sistemi di coltura di embrioni attualmente utilizzati sono prevalentemente a carico del siero per la corretta crescita e il mantenimento degli embrioni nella cultura 1-9. Il siero è stato utilizzato come uno dei principali componenti che vanno dal 10-100% dei terreni di coltura 6-8, 10, 11., Tuttavia, la composizione del siero non è ben definito e può differire da un animale all&#39;altro e ogni volta il siero viene raccolto. Mentre la preparazione del laboratorio di siero molto tempo e comporta procedure rigorose, siero procurato esibisce in commercio una notevole variabilità tra i diversi lotti e aumenta i costi sperimentali. In aggiunta a questi, il siero può contenere incognite, quali fattori di crescita, ormoni o altre proteine, che possono potenzialmente influenzare l&#39;esito di alcuni esperimenti, in particolare quelli che riguardano lo studio di molecole di segnalazione importanti nelle interazioni tissutali. Studi hanno dimostrato che l&#39;aggiunta di siero di cultura può potenzialmente alterare i livelli intracellulari di alcune molecole di segnalazione come adenosina monofosfato ciclico (cAMP) e proteine ​​coinvolte nella segnalazione mitogenico e phosphoinositide 3 (PI 3)-chinasi vie di segnalazione 12-14. Contrariamente a questi, un sistema esente da siero fornisce i vantaggi di ambiente antigene libero,astinenza da enzimi biologicamente attivi che possono alterare i processi cellulari e permette la coerenza tra esperimenti. Nel presente studio, abbiamo utilizzato un mezzo di coltura privo di siero preparato da integratori multimediali cellule staminali disponibili in commercio per cultura stadio intermedio di gravidanza embrioni interi in un&#39;atmosfera di 95% O 2/5% di CO 2 in un apparecchio di coltura bottiglia laminazione a 37 ° C 15,16. Embrioni di topo in coltura per 16 a 40 ore in queste condizioni definite esposti progressione in sviluppo morfologico delle strutture corporee e diversi embrionali quali il cuore, arti, cervello e occhi indicando adeguati livelli di proliferazione cellulare, la migrazione, la differenziazione e interazioni tissutali. Analisi molecolare dello sviluppo embrionale nella cultura di uno dei sistemi di organi complessi come l&#39;occhio rivelato lo sviluppo oculare essere coerente con quello osservato nel tessuto oculare in embryos sviluppo in utero (Kalaskar e Lauderdale, in preparazione). Così dimostriamo che gli embrioni di topo coltivate in fase metà della gestazione, mostrano una progressiva crescita e sviluppo morfologico paragonabile a quella osservata negli embrioni di sviluppo in utero.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<tbody>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10829-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Stock: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418-50G</td>
			<td>Stock: 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic - Antimycotic Solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-004-Cl</td>
			<td>Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 &#181;g/ml; Amphotericin (250&#181;g/ml)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;&#160;</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Incubator Unit</td>
			<td>B.T.C. Engineering Milton Cambridge England</td>
			<td>Id.No. 840-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottles for Rotating Unit</td>
			<td>B.T.C. Engineering</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Rubber Cork</td>
			<td>B.T.C. Engineering</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2/5% CO2 Cylinder</td>
			<td>AirGas Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi SV6 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Water Jacketed Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>Model: 3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Hood</td>
			<td>Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2</td>
			<td>Model: Nu-425-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IsoTemp205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Balance</td>
			<td>Mettler Toledo&#160;</td>
			<td>AG285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube &#8211; 50ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Operating Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Sharp-Blunt Scissors&#160;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps &#8211; 4&#8221;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps - Hudson (cWALD) &#8211; 4-3/4&#8221;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (5/45)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (5)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5060</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (55)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5063</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Tray</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RT-1401S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Tray Lid</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RT-1401L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>087571Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-60mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-35mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0875711YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-aid Pipetter</td>
			<td>Drummond Scientific Co.</td>
			<td>D57849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette-10ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serological Pipette-25ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette - 7.7ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>202-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system

Embrioni metà della gestazione del mouse fase sono state coltivate utilizzando un mezzo di coltura privo di siero preparato da disponibili in commercio integratori multimediali cellule staminali in un sistema di coltura bottiglia di laminazione ossigenato. Embrioni di topo a E10.5 sono stati attentamente isolati dal dell&#39;utero con intatta sacco vitellino e, in un processo che coinvolge manovra chirurgica precisione gli embrioni sono stati gentilmente esteriorizzato dal sacco vitellino, pur mantenendo la continuità vascolare dell&#39;embrione con il sacco vitellino. Rispetto agli embrioni preparati con intatta sacco vitellino o con il sacco vitellino rimosso, questi embrioni esposti tasso di sopravvivenza superiore e progressione evolutiva quando coltivate in condizioni simili. Abbiamo dimostrato che questi embrioni di topo, quando coltivate in un mezzo definito in un&#39;atmosfera di 95% O 2/5% di CO 2 in un apparecchio di coltura bottiglia rotolamento a 37 ° C per 16-40 ore, mostrano crescita e sviluppo morfologico paragonabile a gli embrioni in via di sviluppo in utero. Crediamo thè il metodo sarà utile per gli investigatori che hanno bisogno di utilizzare tutta la cultura dell&#39;embrione per studiare le interazioni di segnalazione importanti nell&#39;organogenesi embrionale.

Sviluppo di embrioni di topo ex utero dipende da molteplici fattori a partire dal momento in cui l&#39;utero è isolato dal corpo al tempo gli embrioni sono coltivate. Come illustrato nella Figura 1, la procedura prevede una serie di operazioni, in particolare, la separazione di utero gravido dal corpo (Figura 1A), l&#39;isolamento degli embrioni con intatta sacco vitellino (Figura 1B), esteriorizzazione degli embrioni dal sacco vitellino ( Figura 1C)</...

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Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Il siero utilizzato nelle culture embrione contiene componenti sconosciuti che possono influenzare l&#39;esito degli esperimenti soprattutto in studi che coinvolgono le interazioni di segnalazione. Qui abbiamo utilizzato un sistema di coltura ossigenato senza siero e dimostrare che embrioni di topo metà della gestazione in coltura per 16-40 ore esibiscono sviluppo morfologico paragonabile agli embrioni in via di sviluppo in utero.

Embrionali di topo di sviluppo in un embrione di tutta la cultura di sistema privo di siero

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

mouse-embryonic-development-serum-free-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Biology

25.6K Views.  University of Georgia.  Il siero utilizzato nelle culture embrione contiene componenti sconosciuti che possono influenzare l'esito degli esperimenti soprattutto in studi che coinvolgono le interazioni di segnalazione. Qui abbiamo utilizzato un sistema di coltura ossigenato senza siero e dimostrare che embrioni di topo metà della gestazione in coltura per 16-40 ore esibiscono sviluppo morfologico paragonabile agli embrioni in via di sviluppo in utero. 

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Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

Cultura e manutenzione di cellule staminali embrionali umane

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

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Biologia

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of the lung endoderm with its surrounding mesenchyme and mesothelium. Lung mesenchyme has been shown to be the source of inductive signals for lung branching morphogenesis. Epithelial-mesenchymal-mesothelial interactions are also critical to embryonic lung morphogenesis. Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system (in the absence of maternal influence and blood flow). More importantly this technique can be readily done in a serumless, chemically defined culture media. Gain and loss of function can be achieved using expressed proteins, recombinant viral vectors and/or analysis of transgenic mouse strains, antisense RNA, as well as RNA interference gene knockdown.

Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system.

Embrionali di topo Cultura Lung, un sistema per valutare i meccanismi molecolari della Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Un Ex-ovo Sistema di embrioni di pollo Cultura Adatto per applicazioni di imaging e Microchirurgia

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

Il metodo di coltura degli embrioni roditori intero utilizzando il Rotator tipo di sistema cultura Bottiglia

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

Chiuso Sistema Cultura protocollo cellulare con imbarcazioni HyperStack con la tecnologia dei materiali gas permeabili

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Con tutto il supporto per l&#39;analisi immunoistochimica vasi embrionali pelle degli arti: un sistema modello per studiare morfogenesi vascolare diramazione in embrione

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Un sistema per<em&gt; Ex vivo</emColtura&gt; del pancreas embrionale

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metodo di Cultura per il mouse embrionale del cuore

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultura sistema per studiare lo sviluppo della tiroide

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Mouse fetale Whole Intestino Sistema Cultura per<em&gt; Ex Vivo</em&gt; La manipolazione delle vie di segnalazione e tridimensionale Imaging in diretta di Sviluppo del villo