Name: establishment of an extracellular acidic ph culture system
Uploaded: 2017-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
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Ringraziamo i membri della divisione di scienza del genoma e laboratorio per sistemi di biologia e medicina, RCAST, The University of Tokyo. Ringraziamo in particolare Dr. H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSBM, RCAST, l'Università di Tokyo), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida e Dr. A. Kunisato (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) per utili discussioni e supporto. Quest'opera è stata in parte sostenuta da sovvenzione per scienziato (A) (26710005, T.O.), del giovane sovvenzione per la ricerca scientifica in settori innovativi (26116711 e 16 H 01567, T.O.) e sovvenzione per sfidare Ricerca esplorativa (16K 14605, T.O.) dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia del Giappone, la Fondazione di scienza di Takeda (T.O.), la Fondazione di Kobayashi della ricerca sul cancro (T.O.) e il progetto per la ricerca sul cancro e Evoluzione terapeutica (P-creare) e la ricerca pratica per la gestione innovativa cancro dal Giappone Agenzia per la ricerca medica e sviluppo, AMED (T.O.).

1. preparazione del terreno di coltura acida
<ol><li>
Preparazione del controllo (pH 7,4) e terreno di coltura di basso pH (pH 6,8)
	<ol>
<li>Sciogliere 4,75 g di polvere DMEM senza L-Glutammina in 500 mL di acqua.</li>
		<li>Preparare 0,33 M NaHCO3 soluzione in una bottiglia a tenuta di pressione. Attenzione: È importante utilizzare una bottiglia di tenuta pressione poiché NaHCO3 emette CO2 gas quando riscaldato e decomposizione termica.</li>
		<li>Autoclave il mezzo e soluzione. Consentire i buffer raffreddare a 25 ° C.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di 200 mM L-Glutammina, 5 mL di penicillina-streptomicina e 50 mL di siero fetale bovino a 500 mL di DMEM senza bicarbonato.</li>
		<li>Per mezzo di controllo (pH 7.4), aggiungere 2,4 mL di soluzione di 0,33 M NaHCO3 per 100 mL di DMEM senza bicarbonato. Per mezzo di basso pH (pH 6,8), aggiungere 0,6 mL di soluzione di 0,33 M NaHCO3 per 100 mL di DMEM senza bicarbonato.</li>
		<li>Controllare il pH medio dopo 24 h di incubazione a 37 ° C inferiore al 5% di CO2. Nota: La quantità di soluzione di NaHCO3 deve essere regolato a seconda del pH medio, che possa differire a seconda del contenuto di CO2 del incubatrice e pressione dell'aria. Idealmente, per la prima volta, è meglio misurare il pH medio con varie concentrazioni di bicarbonato per determinare la quantità appropriata di NaHCO3 soluzione per aggiungere a DMEM.<ol>
<li>Raccogliere il terreno di coltura immediatamente dopo aver tolto la piastra di coltura dell'incubatrice di CO2 e misurare il pH utilizzando un pH-metro. Mantenere la temperatura media a 37 ° C con un bagno d'acqua se necessario. Misurare il pH medio tre volte in modo indipendente. Nota: NaHCO3 soluzione deve essere conservata a 4 ° C e ogni mass media deve essere preparata. Prodotti disponibili in commercio che possono essere utilizzati in questo studio sono elencati in Tabella materiali.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione terreno di coltura acida indotta da lattato o indotta da HCl
	<ol>
<li>Aggiungere 100 mL di terreno di controllo (preparata al punto 1.1.5) 74 µ l di soluzione del lattato o 125 µ l di 1 M HCl.</li>
		<li>Controllare il pH medio dopo 24 h di incubazione a 37 ° C inferiore al 5% di CO2. Nota: La quantità di lattato o soluzione di HCl deve anche essere regolata secondo il pH medio, che possa differire a seconda del contenuto di CO2 nel incubatrice e pressione dell'aria. Idealmente, è meglio misurare il pH medio con seriale lattato o concentrazioni di HCl per determinare la quantità appropriata per la regolazione del pH desiderato del mezzo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. raccolta e trattamento di cellule
<ol><li>Iniziare a coltivare le cellule a 37 ° C, inferiore al 5% di CO2 almeno 1 settimana prima di eseguire esperimenti. Nota: Le linee cellulari utilizzate in questo studio sono elencate in Tabella materiali.</li>
	<li>Cellule di passaggio quando raggiungono confluency di 70-90%. Non permettono alle cellule di diventare confluenti. Modificare il mezzo ogni 2-3 giorni durante la coltivazione quotidiana.</li>
	<li>Lavare le cellule aggiungendo 5 mL di PBS. Aspirare il PBS e aggiungere enzima distaccante quali 1 mL di tripsina.</li>
	<li>Incubare a 37 ° C fino a quando le cellule vengono arrotondate e iniziano a staccare.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di terreno di coltura le cellule indipendenti e disattivare degli enzimi. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugare per 3 min a 300 x g. aspirare il supernatante e risospendere le cellule con terreno di coltura.</li>
	<li>Contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro e blu di Trypan.</li>
	<li>Seme 5,0 x 105 cellule/pozzetto di un piatto di 10 cm in 10 mL di terreno. Incubare le cellule per 24 h a 37 ° C inferiore al 5% di CO2.</li>
	<li>Aspirare il terreno di coltura, lavare le cellule con 5 mL di PBS e aggiungere 10 mL di terreno di coltura acido preparato nella sezione 1. Incubare le cellule per 24 h a 37 ° C inferiore al 5% di CO2.</li>
</ol>3. RNA isolamento
<ol><li>Aspirare il terreno di coltura e lavare le cellule con 5 mL di PBS. Frantumare le cellule con l'aggiunta del reagente di estrazione di RNA (Vedi Tabelle materiali).</li>
	<li>Raschiare il piatto brevemente, quindi rimuovere il reagente di estrazione di RNA con una pipetta e depositare il RNA estrazione reagente/lysate delle cellule in una provetta da 1,5 mL. Lasciare a temperatura ambiente per 5 min.</li>
	<li>Aggiungere 250 cloroformio µ l e agitare la provetta per lasciare circa 15 s. a temperatura ambiente per 5 min e centrifugare a ≥ 8, 000 x g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere con cautela la fase acquosa utilizzando una pipetta. Lasciare dietro alcuni della fase acquosa. Posto in un'altra provetta da 1,5 mL.</li>
	<li>Aggiungere 550 µ l isopropanolo alla fase acquosa e mescolare delicatamente. Lasciare a temperatura ambiente per 5 min. Centrifugare a massima velocità (≥ 20, 000 x g) per 20 min a 4 ° C.</li>
	<li>Versare fuori l'isopropanolo e aggiungere 1 mL di etanolo al 75% in DEPC acqua trattata. Mescolare delicatamente. Centrifugare a 8.000 x g per 5 min.</li>
	<li>Pipettare fuori l'etanolo e lasciare che asciugare all'aria il pellet.</li>
	<li>Aggiungere che circa 15-25 µ l (a seconda del rendimento) di DEPC acqua trattata per la pallina del RNA. Mescolare accuratamente.</li>
	<li>Misurare la concentrazione di RNA isolato misurando l'assorbanza a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro.</li>
</ol>4. sintesi del cDNA
<ol><li>Combinare i seguenti componenti in un tubo di reazione di PCR: fino a 5 µ g RNA totale, 1 µ l Oligo dT (50 µM) o Primer Mix (60 µM), 1 µ l 10 mM dNTP e acqua priva di nucleasi per un volume totale di 14 µ l.</li>
	<li>Mescolare e centrifugare brevemente i componenti utilizzando una centrifuga da banco piccolo (~ 5 s). Denaturare il campione primer di RNA per 5 min a 65 ° C. Girare brevemente (~ 5 s) utilizzando un piccolo benchtop centrifugare e mettere il campione immediatamente in ghiaccio per almeno 1 min.</li>
	<li>Aggiungere i seguenti componenti: 4 µ l 5 x buffer della trascrizione inversa, 1 µ l della trascrittasi inversa (200 U / µ l), 1 µ l della RNAsi inibitore (40 U / µ l). Nota: Esempi di kit commercialmente disponibili sono mostrati in Tabella materiali
</li>
	<li>Richiudere la provetta, mescolare e poi Centrifugare brevemente il contenuto utilizzando una centrifuga da banco piccolo (~ 5 s). Incubare la miscela di reazione combinata a 50-55 ° C per 10 min.</li>
	<li>Inattivare la reazione incubando a 80 ° C per 10 min.</li>
</ol>5. misurazione dell'espressione genica acido-sensibli a reagire mediante PCR in tempo reale
<ol><li>Combinare i seguenti componenti in una piastra 384 pozzetti di reazione: 1 µ l modello cDNA, 0,75 µ l 10 X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine, 0,3 µM 50 µ l in avanti Primer, 0,3 µ l 50 µM reverse primer, 1 µ l Taq polimerasi, 2,5 µ l 10 x buffer della polimerasi di Taq, 2,5 µ l 20 mM dNTP, 16.65 µ l acqua. Nota: Esempio di kit commercialmente disponibili vengono visualizzati nella Tabella materiali. Nella tabella 1viene visualizzato un elenco degli iniettori. Una piastra a 96 pozzetti di reazione può essere utilizzata anche in questo passaggio. Altre sonde (ad es., sonda Taqman) possono anche essere utilizzate.</li>
	<li>Impostare l'esperimento e il seguente programma PCR su un sistema di PCR in tempo reale: 50 ° C per 2 min, 1 ciclo; 95 ° C per 10 min, 1 ciclo; 95 ° C per 15 s e 60 ° C per 1 min, 40 cicli; 95 ° C per 15 s, 1 ciclo; 60 ° C per 15 s, 1 ciclo; 95 ° C per 15 s, 1 ciclo.</li>
	<li>Posizionare la piastra nello strumento qPCR. Avviare il programma. Nota: Upregulation dei geni reattivo pH MSMO1, INSIG1e IDI1 può essere misurata dai livelli della proteina.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cancer+cell+metabolism.">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+metabolism:+Warburg+and+beyond.">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li><li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue:+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer.">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li><li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+pH:+a+perfect+storm+for+cancer+progression.">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li><li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis?.">Why do cancers have high aerobic glycolysis?.</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li><li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH.">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li><li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane.">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752 (2015).</li><li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation.">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers.">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).</li><li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression.">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li></ol>

L'autore Ayano Kondo è un dipendente della Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.

Qui, abbiamo descritto un sistema di coltura semplice pH acido e il suo processo di valutazione. La combinazione dei tre metodi di acidificazione medio, vale a dire, concentrazione ridotta di bicarbonato, aggiunta di lattato e aggiunta di HCl, ci ha permesso di indagare a fondo il meccanismo di pH-risposta e di confrontare la risposta cellulare ad altro tumore condizioni microambientali come ipossia o nutriente inedia.
La chiave di questo metodo consiste nel determinare le concentrazi...

Il microambiente tumorale svolge un ruolo critico nella progressione del tumore e cancro cellula metabolismo1,2,3. Le cellule tumorali sono spesso esposti a condizioni quali ipossia, privazione nutriente e acida pH extracellulare (pHe). Tuttavia, il ruolo di pHe in progressione del tumore non è stato chiarito come ampiamente come ipossia o nutriente inedia. Il pHe nel tessuto del tumore può diventare acido, raggiungendo circa pH 6,84,5. Il pH acido nasce dall'aerobica ed anaerobica glicolitica escrezione di protoni (H+) e lattato di proliferazione del cancro cellule5,6.
Studi recenti hanno rivelato che acida indotta da pHe istone deacetilazione, ossidazione degli acidi grassi ed esocitosi dei lisosomi acidi per adattamento al severo ambiente acido7,8,9,10. Tuttavia, i meccanismi attraverso i quali l'acidificazione extracellulare influenza cancro comportamento e l'identità della chiave regolatori nel microambiente tumorale pH acido completamente non sono stati determinati. Inoltre, parecchi rapporti descritti vari media di pH acido, utilizzando poco chiare concentrazioni di bicarbonato, Tris, tubi e HEPES buffer o lattato e HCl, ma ci sono pochi rapporti per dimostrare la stabilità del rettificata media né completa confronto di diversi distinti acide cultura media7,8,9,10
Per delucidare i regolatori chiave ed i cambiamenti metabolici in cellule tumorali nel contesto dell'acidificazione extracellulare, abbiamo stabilito un modello semplice in vitro della coltura per mantenere un pHe acide ed ha esaminato il ruolo di pHe in cancro cellule11. Utilizzando questo metodo, abbiamo mantenuto un terreno di coltura acida con un pHe di 6.8 a 37 ° C inferiore al 5% CO2, usando le concentrazioni ridotte di bicarbonato nel terreno di coltura. pH 7.4 è stato utilizzato come normale e medio di controllo. Il pH medio era sostenuto per almeno 24 h e gradualmente diminuito di 72 h durante la coltura di cellule di cancro del pancreas PANC-1 e AsPC-1. Perché avanzata glicolisi accelera l'escrezione di non solo protoni, ma anche del lattato7,8,9, abbiamo anche stabilito un metodo di coltura che imita acidosi indotta da lattato di aggiunta del lattato, invece di ridurre il concentrazione di bicarbonato. Inoltre, indotta da HCl acido pHe nel medio permette di escludere la possibilità che risposte cellulari a pH acido di coltura non sono dovuti a una ridotta concentrazione di bicarbonato. Inoltre, utilizzando vari mezzi di comunicazione con un pH di 6.4 a 7.4 con concentrazione di bicarbonato differenti, possiamo valutare l'entità degli effetti di pHe su risposte cellulari.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium&amp;ldquo;Nissui&amp;rdquo; 2</td><td>Nissui</td><td>05919</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>10438</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized)</td><td>Nacalai</td><td>09367-34</td><td></td></tr><tr><td>0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red</td><td>Nacalai</td><td>32778-05</td><td></td></tr><tr><td>0.5%-Trypan Blue Stain Solution</td><td>Nacalai</td><td>29853-34</td><td></td></tr><tr><td>Lactic acid solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252476</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV First-Strand Synthesis System</td><td>Thermo Fisher</td><td>18091</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368702&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell lines&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>AsPC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr><tr><td>KMS-6</td><td>JCRB Cell Bank</td><td>JCRB0432</td><td></td></tr><tr><td>TIG</td><td>JCRB Cell Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRC9</td><td>ATCC</td><td>CCL-212</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>ATCC</td><td>CRL-1730</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of an extracellular acidic ph culture system

Condizioni del microambiente tumorale, quali ipossia o nutriente inedia, giocano un ruolo critico nella progressione del cancro e malignità. Tuttavia, il ruolo di pH acido extracellulare in aggressività del tumore e del suo meccanismo sottostante non è stato ampiamente studiato rispetto alle condizioni ipossiche o nutriente inedia. Inoltre, un metodo di cultura ben definita per imitare il microambiente tumorale extracellulare acido completamente non è stato segnalato.
Qui presentiamo un metodo di coltura semplice in vitro per mantenere acida pH extracellulare utilizzando ridotto bicarbonato e aumento del lattato o HCl concentrazioni nel terreno di coltura. Il pH medio era sostenuto per almeno 24 h e gradualmente diminuito da 72 h dopo coltura di cellule di cancro del pancreas PANC-1 e AsPC-1. Tre condizioni distinte media acide in questo studio altamente sovraregolati geni pH-sensible a reagire come MSMO1, INSIG1e IDI1 rispetto ad ipossia o nutriente inedia. Il upregulation di questi geni può essere utilizzato come un indicatore di pH acido. Queste semplici tecniche sono benefiche per delucidare i meccanismi di fondo di malignità del tumore sotto microambiente tumorale acide. Di conseguenza, il nostro sistema di cultura acida pH extracellulare consente l'individuazione di risposte cellulari pH acido non solo nelle cellule tumorali, ma anche nelle cellule primarie, come le cellule tubolari renali, nei confronti di altri acidi disordini compreso, chetoacidosi diabetica, acidosi lattica, acidosi tubulare renale e acidosi respiratoria.

Per determinare la concentrazione di bicarbonato appropriato, abbiamo preparato DMEM al gamma di 0 - 8 mM NaHCO3 (concentrazione finale nel terreno di coltura) e riuscì a preparare terreni di coltura con pH che vanno da 6.4-7,4 (Figura 1). Abbiamo preparato DMEM con 8mm NaHCO3 (pH 7.4) come un mezzo di controllo e 2 mM NaHCO3 (pH 6,8) come un mezzo con pH acido secondo un precedente rapporto, affermando che il pH extracellula...

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Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Il microambiente tumorale acide gioca ruoli critici nella progressione del tumore. Per valutare gli effetti del pH extracellulare acido sul cancro cellule in vitro, abbiamo istituito sistemi di semplice cultura acida.

Istituzione di un pH extracellulare acido sistema cultura

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

establishment-of-an-extracellular-acidic-ph-culture-system

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Education

JoVE Core

JoVE Journal

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Biology

Unit 1

Fluid, Electrolyte, and Acid-Base Balance

SCIENTISTS IN ACTION

14.6K Views.  Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Il microambiente tumorale acide gioca ruoli critici nella progressione del tumore. Per valutare gli effetti del pH extracellulare acido sul cancro cellule in vitro, abbiamo istituito sistemi di semplice cultura acida.

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Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

Valutare la fattibilità di un consorzio batterico sintetico sull'interfaccia ospite-microbo In Vitro Gut

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Ricerca

Biochimica

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) hydration, mucus viscosity and activity of antimicrobial peptides, key parameters involved in innate defense of the lungs. This is of primary relevance in the field of chronic respiratory diseases such as cystic fibrosis (CF) where these parameters are dysregulated. While different groups have studied ASL pH both in vivo and in vitro, their methods report a relatively wide range of ASL pH values and even contradictory findings regarding any pH differences between non-CF and CF cells. Furthermore, their protocols do not always provide enough details in order to ensure reproducibility, most are low throughput and require expensive equipment or specialized knowledge to implement, making them difficult to establish in most labs. Here we describe a semi-automated fluorescent plate reader assay that enables the real-time measurement of ASL pH under thin film conditions that more closely resemble the in vivo situation. This technique allows for stable measurements for many hours from multiple airway cultures simultaneously and, importantly, dynamic changes in ASL pH in response to agonists and inhibitors can be monitored. To achieve this, the ASL of fully differentiated primary human airway epithelial cells (hAECs) are stained overnight with a pH-sensitive dye in order to allow for the reabsorption of the excess fluid to ensure thin film conditions. After fluorescence is monitored in the presence or absence of agonists, pH calibration is performed in situ to correct for volume and dye concentration. The method described provides the required controls to make stable and reproducible ASL pH measurements, which ultimately could be used as a drug discovery platform for personalized medicine, as well as adapted to other epithelial tissues and experimental conditions, such as inflammatory and/or host-pathogen models.

We present a protocol to make dynamic measurements of the airway surface liquid pH under thin film conditions using a plate-reader.

Misurazione fluorescente semi-automatizzata in tempo reale del pH liquido superficiale delle vie respiratorie delle cellule epiteliali delle vie respiratorie umane primarie

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

In vitro Monitoring of Extracellular pH in Real-Time

Early accumulation of neutrophils (PMN) is a hallmark of acute intestinal inflammation. This acute inflammation is either resolved or progresses to chronic inflammation. Without efficient PMN clearance at sites of infiltration, PMN can accumulate and contribute to chronic inflammatory conditions, including the intestinal diseases ulcerative colitis (UC) and Crohn's Disease (CD). The pH in the distal colon in individuals with active UC can range between a pH of 5 and 6, whereas healthy individuals maintain colonic pH in the range of 6.8-7.4. Extracellular pH has been shown to influence both intestinal epithelial cells and the infiltrating immune cells. More specifically, extracellular acidosis significantly impacts PMN. At pH below 6.5, there are increases in the production of H2O2, inhibition of apoptosis, and increases in the functional lifespan of PMN. Given the significant presence of PMN and extracellular acidification at sites of inflammation, we developed a novel model that allows for the monitoring of extracellular pH during PMN transepithelial migration in real time. Here, we describe this model and how it can be utilized to measure both the apical and basal pH during PMN trafficking. This model can be utilized to monitor extracellular pH under a wide range of conditions; including, hypoxia, PMN transepithelial migration, and for extended periods of time.

In vitro Monitoring of Extracellular pH in Real-Time

This article represents a useful in vitro assay to measure changes in extracellular pH during neutrophil (PMN) transepithelial migration (TEM)

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<meta charset="utf8"></head><body>Analisi cronoamperometrica dell'EET in Lactiplantibacillus plantarum con DHNA

Characterizing Mediated Extracellular Electron Transfer in Lactic Acid Bacteria with a Three-Electrode, Two-Chamber Bioelectrochemical System

Many bacteria perform extracellular electron transfer (EET), whereby electrons are transferred from the cell to an extracellular terminal electron acceptor. This electron acceptor can be an electrode and electrons can be delivered indirectly via a redox-active mediator molecule. Here, we present a protocol to study mediated EET in Lactiplantibacillus plantarum, a probiotic lactic acid bacterium widely used in the food industry, using a bioelectrochemical system. We detail how to assemble a three-electrode, two-chambered bioelectrochemical system and provide guidance on characterizing EET in the presence of a soluble mediator using chronoamperometry and cyclic voltammetry techniques. We use representative data from 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA)-mediated EET experiments with L. plantarum to demonstrate data analysis and interpretation. The techniques described in this protocol can open new opportunities for electro-fermentation and bioelectrocatalysis. Recent applications of this electrochemical technique with L. plantarum demonstrated an acceleration of metabolic flux towards producing fermentation end-products, which are critical flavor components in food fermentation. As such, this system has the potential to be further developed to alter flavors in food production or produce valuable chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>Caratterizzazione del trasferimento di elettroni extracellulari mediato nei batteri dell'acido lattico con un sistema bioelettrochimico a tre elettrodi e due camer

Here we present a protocol for characterizing mediated extracellular electron transfer (EET) in lactic acid bacteria using a three-electrode, two-chamber bioelectrochemical system. We illustrate this method with Lactiplantibacillus plantarum and the redox mediator 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid and provide a thorough description of the electrochemical techniques used to evaluate mediated EET.

Caratterizzazione del trasferimento di elettroni extracellulari mediato nei batteri dell'acido lattico con un sistema bioelettrochimico a tre elettrodi e due camere

Many bacteria perform extracellular electron transfer (EET), whereby electrons are transferred from the cell to an extracellular terminal electron ...

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its complex nature, and its diverse association with mammalian components. The goal of this protocol is to culture the gut microbiota in vitro, which allows for the study of the gut microbiota dynamics, without having to consider the contribution of the mammalian milieu. Using in vitro culturing technology, the physiological conditions of the gastro intestinal tract are simulated, including parameters such as pH, temperature, anaerobiosis, and transit time. The intestinal surface of the colon is simulated by adding mucin-coated carriers, creating a mucosal phase, and adding further dimension. The gut microbiota is introduced by inoculating with the human fecal material. Upon inoculation with this complex mixture of bacteria, specific microbes are enriched in the different longitudinal (ascending, transverse and descending colons) and transversal (luminal and mucosal) environments of the in vitro model. It is crucial to allow the system to reach a steady state, in which the community and the metabolites produced remain stable. The experimental results in this manuscript demonstrate how the inoculated gut microbiota community develops into a stable community over time. Once steady state is achieved, the system can be used to analyze bacterial interactions and community functions or to test the effects of any additives on the gut microbiota, such as food, food components, or pharmaceuticals.

Here, we present a protocol for culturing the gut microbiota of the colon in vitro, using a series of bioreactors that simulate the physiological conditions of the gastro intestinal tract.

L'applicazione di avanzate In Vitro coltura tecnologia per studiare il Microbiota dell'intestino umano

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

Bioingegneria

Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled environment. Despite vast differences in the physiology between mammals and fish, primary cell culture protocols from fish are often based on mammalian culture conditions, often with only minor modifications. The environmental differences affect not only body temperature, but also blood serum parameters such as osmolality, pH, and pH buffer capacity. As cell culture media and similar working solutions are meant to mimic characteristics of the extracellular fluid and/or blood serum to which a cell is adapted, it is crucial that these parameters are adjusted specifically to the animal in question.
The current protocol describes optimized primary culture conditions for medaka (Oryzias latipes). The protocol provides detailed steps on how to isolate and maintain healthy dissociated pituitary cells for more than one week and includes the following steps: 1. the adjustment of the osmolality to the values found in medaka blood plasma, 2. the adjustment of the incubation temperature to normal medaka temperature (here in the aquarium facility), and 3. the adjustment of the pH and bicarbonate buffer to values comparable to other fish species living at similar temperatures. The results presented using the described protocol promote physiologically meaningful results for medaka and can be used as a reference guide by scientists making primary cell cultures from other non-mammalian species.

Here we describe a protocol to prepare and maintain primary pituitary cell cultures from medaka (Oryzias latipes). The optimized conditions in this protocol take important parameters such as temperature, osmolality, and pH into consideration by mimicking the physiological conditions of the fish, thereby enabling physiologically more meaningful results.

Preparazione di una cultura di cellula primaria di alta qualità da cadaveri di pesci

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

Neuroscienze

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Vacuolar and cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in overall pH homeostasis. We describe protocols for ratiometric measurement of pH in vivo using pH-sensitive fluorophores localized to the vacuole or cytosol. Vacuolar pH is measured using BCECF, which localizes to the vacuole in yeast when introduced into cells in its acetoxymethyl ester form. Cytosolic pH is measured with a pH-sensitive GFP expressed under control of a yeast promoter, yeast pHluorin. Methods for measurement of fluorescence ratios in yeast cell suspensions in a fluorimeter are described. Through these protocols, single time point measurements of pH under different conditions or in different yeast mutants have been compared and changes in pH over time have been monitored. These methods have also been adapted to a fluorescence plate reader format for high-throughput experiments. Advantages of ratiometric pH measurements over other approaches currently in use, potential experimental problems and solutions, and prospects for future use of these techniques are also described.

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Vacuolar and cytosolic pH can be measured in live yeast (S. cerevisiae) cells using ratiometric fluorescent dyes localized to specific cellular compartments. We describe procedures for measuring vacuolar pH with BCECF-AM, which localizes to the vacuole in yeast, and cytosolic pH with a cytosolic ratiometric pH-sensitive GFP (yeast pHluorin).

Misurazione di pH vacuolare e di Cytosolic<em&gt; In Vivo</em&gt; In Lievito Cell Sospensioni

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Biologia

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial for homeostatic control of physiological processes that include: protein, DNA and RNA synthesis, vesicular trafficking, cell growth and cell division. Alterations in cellular pH homeostasis can lead to detrimental functional changes and promote progression of various diseases2. Various methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of pH in the cytoplasm and in organelles. Here, we describe in detail a rapid and accurate method for the simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH by using confocal microscopy on living cells3. This goal is achieved with the use of two pH-sensing ratiometric dyes that possess selective cellular compartment partitioning. For instance, SNARF-1 is compartmentalized inside the cytoplasm whereas HPTS is compartmentalized inside endosomal/lysosomal organelles. Although HPTS is commonly used as a cytoplasmic pH indicator, this dye can specifically label vesicles along the endosomal-lysosomal pathway after being taken up by pinocytosis3,4. Using these pH-sensing probes, it is possible to simultaneously measure pH within the endocytic and cytoplasmic compartments. The optimal excitation wavelength of HPTS varies depending on the pH while for SNARF-1, it is the optimal emission wavelength that varies. Following loading with SNARF-1 and HPTS, cells are cultured in different pH-calibrated solutions to construct a pH standard curve for each probe. Cell imaging by confocal microscopy allows elimination of artifacts and background noise. Because of the spectral properties of HPTS, this probe is better suited for measurement of the mildly acidic endosomal compartment or to demonstrate alkalinization of the endosomal/lysosomal organelles. This method simplifies data analysis, improves accuracy of pH measurements and can be used to address fundamental questions related to pH modulation during cell responses to external challenges.

Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells.

La misurazione simultanea di pH in endocitosi e citosoliche scomparti nelle cellule viventi usando Microscopia confocale

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

Istituzione di un pH extracellulare acido sistema cultura

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Valutare la fattibilità di un consorzio batterico sintetico sull'interfaccia ospite-microbo In Vitro Gut

Misurazione fluorescente semi-automatizzata in tempo reale del pH liquido superficiale delle vie respiratorie delle cellule epiteliali delle vie respiratorie umane primarie

In vitro Monitoring of Extracellular pH in Real-Time

Caratterizzazione del trasferimento di elettroni extracellulari mediato nei batteri dell'acido lattico con un sistema bioelettrochimico a tre elettrodi e due camere

Caratterizzazione del trasferimento di elettroni extracellulari mediato nei batteri dell'acido lattico con un sistema bioelettrochimico a tre elettrodi e due camere

Caratterizzazione del trasferimento di elettroni extracellulari mediato nei batteri dell'acido lattico con un sistema bioelettrochimico a tre elettrodi e due camere

L'applicazione di avanzate In Vitro coltura tecnologia per studiare il Microbiota dell'intestino umano

Preparazione di una cultura di cellula primaria di alta qualità da cadaveri di pesci

Misurazione di pH vacuolare e di Cytosolic

La misurazione simultanea di pH in endocitosi e citosoliche scomparti nelle cellule viventi usando Microscopia confocale