Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Steve Withers e Hong-Ming Chen per la fornitura di DNP-Cellobioside substrato.

Prima di iniziare questo protocollo, è necessario libreria metagenomica memorizzati in un formato 384 pozzetti. Nel nostro studio, abbiamo usato il pCC1 controllo vettoriale fosmid copia in combinazione con il fago T1-resistente TransforMax EPI300 T1-R E. coli come host biblioteca e conservati i nostri piatti a -80 ° C 11. 1. La replica dei piatti Biblioteca metagenomica <ol><li> Scongelare i piatti contenenti la libreria a 37 ° C per circa 20 minuti, o fino a quando tutti i pozzetti siano scongelati. </li><li> Utilizzare la funzione di luce UV di sterilizzazione della qPix2 di sterilizzare il robot per 15 minuti. </li><li> Preparare il brodo LB con cloramfenicolo ad una concentrazione finale di 12.5ug/mL e arabinosio a 100ug/mL in una bottiglia di reagente 500mL. Ogni piatto utilizzerà circa 20 mL, oltre a fare un ulteriore 50mL per consentire volume morto. </li><li> Impostare il qFill3 come istruzioni del produttore, con la bottiglia media associati al collettore attraverso il tubo sterile. Programma che per la quantità appropriata di media, e impostare per riempire un volume 45uL in ciascun pozzetto. </li><li> Spurgare l&#39;aria dal tubo e collettore utilizzando la funzione di eliminazione del robot è visibile fino a quando i media provenienti da ogni pin del collettore. </li><li> Riempire il numero desiderato di piastre con i media LB utilizzando il qFill3. Ogni piatto richiede circa 20 secondi per riempire. </li><li> Caricare le piastre biblioteca e le piastre fresca in apposite aree del robot qPix2. Riempire il bagno di pulizia con i reagenti appropriati, 2% Micro90 nella vasca da bagno posteriore, autoclave acqua distillata nella vasca centrale, l&#39;80% di etanolo nel bagno di fronte. </li><li> Utilizzare il programma &quot;replica&quot; del qPix2. Nel software, selezionare la testa, il numero ed i tipi di piatti di origine e di piastre di destinazione. Inoltre istituito la testa per pulire tra le repliche, di solito 6 cicli di ogni bagno è sufficiente. Capacità della macchina è di 10 piatti alla volta, e ci vogliono circa 15 minuti per replicare tutti con una testa di spillo 384 (o circa 50 minuti con una testa 96 pin). Nota: Vi è la possibilità di &quot;Stir Fonte&quot; o &quot;Stir di destinazione&quot;. Si raccomanda di non utilizzare tali opzioni problemi sono già verificati con il nostro robot li utilizzano. </li><li> Una volta che i piatti vengono replicati, crescono le piastre a 37 ° C per 24 ore in una scatola di umidità. Perché siamo inducendo un elevato numero di copie fosmid con aggiunta di arabinosio, i cloni tendono a crescere più lentamente rispetto ai non-indotta cloni. Restituire le piastre biblioteca a -80 ° C. Nota: L&#39;incubazione in una scatola di umidità garantisce l&#39;evaporazione dei mezzi di comunicazione non si verifica nei pozzi sul bordo delle piastre, mantenendo un ambiente uniforme per tutti i pozzetti. </li><li> Pulire il qFill3 robot prima purificazione con l&#39;acqua (~ 50 mL) e poi a 80% di etanolo (~ 50 mL). Smontare i componenti, e pulita e autoclave la bottiglia, coperchio e tubi avvolti in carta stagnola. </li></ol> 2. Misurare la crescita di E. coli cloni <ol><li> Rimuovere le piastre da 37 ° C incubatore. Togliere e mettere da parte le palpebre, e le piastre posto sulla piattaforma di carico rivista fornito con il RapidStak, fino ad un massimo di 25 piastre. Nota: La piastra sul fondo della pila sarà il primo ad essere letto. Assicurati di tenere traccia dell&#39;ordine delle piastre, in quanto il software non registra questo. </li><li> Rimuovere una rivista dal Stak rapida, assicurarsi che sia vuoto, e spingerlo in cima alla pila di piatti da leggere. Afferrarlo per la maniglia, e le piastre dovrebbero essere caricati nel magazzino. Caricare la rivista nel RapidStak. Nota: La rivista ha una piccola vite in un angolo che denota che i pozzi A1 angolo delle piastre dovrebbe andare. La rivista sarà solo montare in RapidStak in un unico orientamento. </li><li> Aprire il programma RE SkanIt sul computer collegato alle macchine. Selezionare &quot;New Session&quot; e un nome appropriato. Scegliere &quot;Corning a fondo piatto da 384 pozzetti&quot; come tipo di piatto. </li><li> In &quot;Layout Plate&quot;, selezionare il pulsante &quot;Wizard&quot;, e scegliere per aggiungere 384 incognite al tuo piatto. </li><li> Nell&#39;area &quot;Protocollo&quot;, selezionare l&#39;opzione &quot;Bene Loop&quot; opzione e immettere per 384 pozzetti. Un &quot;Beh Loop&quot; icona apparirà nella flow-albero sul lato sinistro dello schermo. Selezionare l&#39;icona e fare clic per aggiungere &quot;di misura fotometrica&quot;. Impostato per leggere a 600nm. </li><li> Salvare il protocollo con un nome univoco, e chiudere il programma SkanIt RE. </li><li> Sul computer, aprire il programma PolaraRS. </li><li> Nella pagina principale ci sarà tabella che elenca gli strumenti collegati al dispositivo RapidStak. Il VarioSkan dovrebbe essere sul lato sinistro di questa tabella. Sotto il titolo VarioSkan, ci saranno due link: &quot;RunSession&quot; e &quot;incubare&quot;. Fare clic sull&#39;opzione &quot;RunSession&quot;. </li><li> Una nuova finestra, la finestra del test, apparirà con un diagramma di flusso nel mezzo. Selezionare la voce &quot;RunSession&quot; (dovrebbe essere l&#39;unica voce presente). Sul lato destro dello schermo un menu a discesaapparirà. Trova il nome del RE SkanIt salvato eseguito in questo menu. Nota: Non sembra esserci nessun ordinamento razionale a questo menu. Non è in ordine alfabetico, o per data di aggiunta, o in relazione al punto in cui il computer il protocollo è salvato. Questo significa che si deve guardare attraverso tutti i protocolli prima di trovare il proprio, che è un dolore. </li><li> Dopo aver selezionato il protocollo, in alto a destra cliccare su &quot;Esegui questo test&quot;. </li><li> Viene visualizzata una finestra si aprirà, che chiede di indicare quale rivista da utilizzare come fonte, e che la rivista è vuoto. La casella in basso sullo schermo rispetto alla rivista anteriore. [Opzionale: Si chiede di inserire il numero di lastre caricate a determinare una stima per la quantità di tempo ci vorrà. Questa stima è normalmente lontano.] </li><li> Garantire sia la RapidStak e VarioSkan sono accesi, e premere il tasto &quot;OK&quot;. </li><li> Il RapidStak caricherà automaticamente il vostro piatti nel lettore di piastre, consentendo misurazioni in continuo di lastre. Per leggere 25 piastre è di circa 50 minuti. Nota: Si raccomanda di osservare il primo caricamento piastra nel VarioSkan per assicurare un corretto allineamento delle macchine. Se il RapidStak non carica il lettore di piastre correttamente, utilizzare la funzione &quot;Pause questo saggio&quot; pulsante nell&#39;angolo in alto a destra della finestra PolaraRS. </li><li> Una volta che il VarioSkan è finito di leggere tutti i piatti, rimuovere il caricatore pieno e posizionarlo sul pianale di carico rivista. Sollevare il rettangolo esterno della piattaforma, e la rivista dovrebbe scivolare via, lasciando i piatti in piedi in un mucchio in mezzo. Sostituire i coperchi alle piastre appropriato. </li></ol> 3. Aggiunta del saggio Mix per ogni piatto <ol><li> Preparare mix test utilizzando premade magazzino 10x mix di lisi (10% Triton X-100, 100mM RIS, 10mM EDTA) in 50 mM tampone acetato di potassio a pH 5,5. Preparare uno stock di fino a 75mg/mL DNP-cellobioside substrato in DMSO, assicurandosi che il substrato è completamente sciolto. Aggiungi DNP-cellobioside soluzione madre di mescolare test ad una concentrazione finale di 0.1mg/mL. Ogni piatto utilizzerà circa 20 mL di soluzione, oltre a fare un ulteriore 50mL per consentire volume morto. Nota: DNP-Cellobioside non è facilmente solubile in acqua, in modo da sciogliere in DMSO aumenta la solubilità. La presenza di DMSO nella soluzione di saggio finale non ha effetti osservabili. </li><li> Impostare il qFill3 come istruzioni del produttore, con la bottiglia media associati al collettore attraverso il tubo sterile. Programma che per la quantità appropriata di media, e impostare per riempire un volume 45uL in ciascun pozzetto. </li><li> Spurgare l&#39;aria dal tubo e collettore utilizzando la funzione di eliminazione del robot è visibile fino a quando i media provenienti da ogni pin del collettore. </li><li> Aggiungi mix di test a ogni piatto con il qFill3. Ogni piatto richiede circa 20 secondi per riempire. </li><li> Una volta mix saggio è aggiunto, incubare le piastre a 37 ° C in una scatola di umidità per 12-16 ore. Nota: Over-incubazione delle piastre quando l&#39;impasto saggio è aggiunto provoca l&#39;evaporazione nei pozzetti esterni della piastra, ottenendo valori di assorbanza superiore a quello visto per i pozzi all&#39;interno. Questo può essere compensato da incubando le piastre in una camera umida. </li></ol> 4. Assorbanza lettura dei cloni dosato <ol><li> Rimuovere le piastre da 37 ° C incubatore. Togliere e mettere da parte le palpebre, e le piastre posto sulla piattaforma di carico rivista fornito con il RapidStak, fino ad un massimo di 25 piastre. Nota: La piastra sul fondo della pila sarà il primo ad essere letto. Assicurati di tenere traccia dell&#39;ordine delle piastre, in quanto il software non registra questo. </li><li> Rimuovere una rivista dal Stak rapida, assicurarsi che sia vuoto, e spingerlo in cima alla pila di piatti da leggere. Afferrarlo per la maniglia, e le piastre dovrebbero essere caricati nel magazzino. Caricare la rivista nel RapidStak. Nota: La rivista ha una piccola vite in un angolo che denota che i pozzi A1 angolo delle piastre dovrebbe andare. La rivista sarà solo montare in RapidStak in un unico orientamento. </li><li> Aprire il programma RE SkanIt sul computer collegato alle macchine. Selezionare &quot;New Session&quot; e un nome appropriato. Scegliere &quot;Corning a fondo piatto da 384 pozzetti&quot; come tipo di piatto. </li><li> In &quot;Layout Plate&quot;, selezionare il pulsante &quot;Wizard&quot;, e scegliere per aggiungere 384 incognite al tuo piatto. </li><li> Nell&#39;area &quot;Protocollo&quot;, selezionare l&#39;opzione &quot;Bene Loop&quot; opzione e immettere per 384 pozzetti. Un &quot;Beh Loop&quot; icona apparirà nella flow-albero sul lato sinistro dello schermo. Selezionare l&#39;icona e fare clic per aggiungere &quot;di misura fotometrica&quot;. Impostarlo per leggere a 400nm. </li><li> Salvare il protocollo con un nome univoco, e chiudere il programma SkanIt RE. </li><li> Sul computer, aprire il programma PolaraRS. </li><li> Nella pagina principale ci sarà tabella che elenca gli strumenti collegati al dispositivo RapidStak. Il VarioSkan dovrebbe essere sul lato sinistro di questa tabella. Sotto il titolo VarioSkan, ci saranno due link: &quot;RunSession&quot; e &quot;Incubate &quot;. Fare clic su&quot; &quot;opzione RunSession. </li><li> Una nuova finestra, la finestra del test, apparirà con un diagramma di flusso nel mezzo. Selezionare la voce &quot;RunSession&quot; (dovrebbe essere l&#39;unica voce presente). Sul lato destro dello schermo un menu a discesa appare. Trova il nome del RE SkanIt salvato eseguito in questo menu. </li><li> Dopo aver selezionato il protocollo, in alto a destra cliccare su &quot;Esegui questo test&quot;. </li><li> Viene visualizzata una finestra si aprirà, che chiede di indicare quale rivista da utilizzare come fonte, e che la rivista è vuoto. La casella in basso sullo schermo rispetto alla rivista anteriore. [Opzionale: Si chiede di inserire il numero di lastre caricate a determinare una stima per la quantità di tempo ci vorrà. Questa stima è normalmente lontano.] </li><li> Garantire sia la RapidStak e VarioSkan sono accesi, e premere &quot;OK&quot; </li><li> Il RapidStak caricherà automaticamente il vostro piatti nel lettore di piastre, consentendo misurazioni in continuo di lastre. Nota: Si raccomanda di osservare il primo caricamento piastra nel VarioSkan per assicurare un corretto allineamento delle macchine. Se il RapidStak non carica il lettore di piastre correttamente, utilizzare la funzione &quot;Pause questo saggio&quot; pulsante nell&#39;angolo in alto a destra della finestra PolaraRS. </li><li> Una volta che il VarioSkan è finito di leggere tutti i piatti, rimuovere il caricatore pieno e posizionarlo sul pianale di carico rivista. Sollevare il rettangolo esterno della piattaforma, e la rivista dovrebbe scivolare via, lasciando i piatti in piedi in un mucchio in mezzo. Le lastre possono essere smaltiti in base alle proprie procedure di laboratorio. </li><li> Per esportare le letture di assorbanza, di software open RE SkanIt, e scegliere &quot;Apri un file esistente&quot;. </li><li> Selezionare la directory dove avete salvato la sessione, ha colpito il simbolo &quot;+&quot; per espandere l&#39;elenco e sotto la voce titolo verrà opzioni etichettato come &quot;contenitore 1&quot; a &quot;Container N&quot; a seconda del numero di piatti. Selezionare la prima piastra da analizzare. </li><li> Nella barra dei menu nella parte superiore della pagina, selezionare &quot;Elaborazione Dati&gt; Rapporto / Export&quot; </li><li> Scegliere le opzioni desiderate per l&#39;esportazione. Nota: Io di solito selezionare &quot;Layout piastra&quot; e &quot;fotometrici&quot; dati per l&#39;esportazione. </li><li> Fare clic su &quot;Visualizza rapporto&quot; e poi &quot;File&gt; Salva&quot;. Scegliere la directory desiderata. Il formato di output è un foglio di calcolo Microsoft Excel </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Un esempio di valori di assorbanza da una singola 384 pozzetti contenenti un clone positivo è mostrato nella Figura 2. Cloni positivi mostrano un marcato aumento di assorbanza più di quelli che non esprimono l&#39;attività cellulasi. Differenze nel tempo di analisi, l&#39;ubicazione e sulla piastra, o concentrazione DNP (può essere introdotto filtrando un-dissolto DNP) potrebbero influenzare le letture assolute. Letture dell&#39;assorbanza relativa, come la differenza di assorbanza al di sopra della media piastra o media colonna, sono un metodo più affidabile per identificare cloni cellulasi positivo. A seguito di identificazione di cloni positivi dalle piastre biblioteca, si consiglia di replicare tutti i cloni positivi in ​​una nuova piastra per lo screening secondario. Questo elimina gli effetti derivanti dalla posizione bene o variazione targa e consente una maggiore confronto diretto tra i cloni positivi. <img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Diagramma di flusso del test high-throughput per una libreria metagenomica clonato in E. coli e conservati a -80 ° C. <img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Letture di assorbanza da una piastra da 384 pozzetti contenenti un clone positivo. Cellulasi cloni positivi possono essere identificati mediante assorbimento significativamente aumentato nel corso cloni negativo.

<ol>
	<li>Rubin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+of+cellulosic+biofuels.">Genomics of cellulosic biofuels.</a> Nature. 454, 841-845 (2008).</li><li>Voget, S., Steele, H. L., Streit, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+metagenome+derived+halotolerant+cellulase.">Characterization of a metagenome derived halotolerant cellulase.</a> J. Biotechnol. 126, 26-36 (2006).</li><li>Duan, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+partial+characterization+of+novel+genes+encoding+acidic+cellulases+from+metagenomes+of+buffalo+rumens.">Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens.</a> J. Appl. Microbiol. 107, 245-256 (2009).</li><li>Zhang, Y. H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outlook+for+cellulase+improvement:+Screening+and+selection+strategies.">Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies.</a> Biotech. Advances. 24, 452-481 (2006).</li><li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen.">Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl. And Environ. Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li><li>Sharrock, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+assay+methods:+a+review.">Cellulase assay methods: a review.</a> J. Biochem and Biophys Methods. 17, 81-106 (1988).</li><li>Kasana, R. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cellulases+and+xylanases:+A+detailed+kinetic+study+of+the+exo-beta-1,4-glycanase+from+Cellulomonas+fimi.">Mechanisms of cellulases and xylanases: A detailed kinetic study of the exo-beta-1,4-glycanase from Cellulomonas fimi.</a> Biochemistry. 33, 6363-6370 (1994).</li><li>Martinez, A., Bradley, A. S., Waldbauer, J. R., Summons, R. E., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteorhodopsin+photosystem+gene+expression+enables+photophosphorylation+in+a+heterologous+host.">Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host.</a> PNAS. 104, 5590-5595 (2007).</li><li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sacchirification+of+complex+cellulosic+substrates+by+the+cellulase+system+from+Clostridium+thermocellum.">Sacchirification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from Clostridium thermocellum.</a> Appl Environ Microbiology. 43, 1125-1132 (1982).</li><li>Stutzenberger, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+Production+by+Thermomonospora+curvata+isolated+from+municipal+solid+waste+compost.">Cellulase Production by Thermomonospora curvata isolated from municipal solid waste compost.</a> Appl Environ Microbiol. 22, 147-152 (1971).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Uno schermo ad alto rendimento per la rapida individuazione di attività cellulosolitici da una grande libreria genomica metagenomica di DNA espressa in E. coli è descritto in questo protocollo. Questo metodo è un miglioramento rispetto al CMC / Congo saggio Rosso comunemente utilizzati in letteratura. Si tratta di una soluzione basata, e consente di one-pot di screening chimico a 384 pozzetti, con il risultato finale come le letture di assorbanza da un lettore di piastre consentendo analisi quantitativa. L&#...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>qPix2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>With 384-pin gridding head</td>
</tr>
<tr>
<td>qFill3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>With 384-well manifold</td>
</tr>
<tr>
<td>Varioskan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RapidStak</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Connected to Varioskan</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro90 Detergent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cole-Parmer</td>
<td>18100-00</td>
<td>Diluted to 2% in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Major Lab Supplier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diluted to 80% in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C0378</td>
<td>12.5mg/mL in ethanol</td>
</tr>
<tr>
<td>LB broth, Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP1426-2</td>
<td>25g/L, autoclaved</td>
</tr>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>384-well flat bottom plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3680</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-(+)-Arabinose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3256</td>
<td>100mg/mL in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Potassium Acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>P171</td>
<td>50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T3253</td>
<td>In TE buffer solution, 100mM</td>
</tr>
<tr>
<td>EDTA disodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E5134</td>
<td>In TE buffer solution, 10mM</td>
</tr>
<tr>
<td>2,4-dinitrophenyl cellobioside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Provided by Dr. Steve Withers, UBC</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a high throughput screen for biomining cellulase activity from metagenomic libraries

Cellulosa, la fonte più ricca di carbonio organico del pianeta, ha applicazioni industriali di ampio respiro con enfasi crescente sulla produzione di biocarburanti 1. Metodi chimici per modificare o degradare la cellulosa in genere richiedono acidi forti e temperature elevate. Come tale, i metodi enzimatici sono diventati di primo piano nel processo di bioconversione. Mentre l&#39;individuazione delle cellulasi attivo da ceppi di batteri e funghi è stata in qualche modo efficace, la stragrande maggioranza dei microbi in natura resistere coltura di laboratorio. Genomica ambientale, noto anche come approcci metagenomica, lo screening ha una grande promessa per colmare il divario coltivazione nella ricerca di enzimi bioconversione romanzo. Approcci di screening metagenomica hanno recuperato con successo cellulasi romanzo da ambienti diversi, come i terreni 2, bufali rumine 3 e la termite posteriori-gut 4 con carbossimetilcellulosa (CMC) piastre di agar colorate con colorante rosso congo (basato sul metodo del Teatro e Wood 5). Tuttavia, il metodo CMC è limitata in velocità, non è quantitativo e manifesta un basso rapporto segnale rumore 6. Altri metodi sono stati segnalati 7,8 ma entrambi utilizzare un piatto a base di test di agar, che è indesiderabile per high-throughput screening di grandi biblioteche genomiche inserire. Qui vi presentiamo una soluzione a base di schermo per l&#39;attività cellulasi utilizzando un dinitrofenolo cromogenico (DNP)-cellobioside substrato 9. La nostra biblioteca è stato clonato nel controllo pCC1 copia fosmid per aumentare la sensibilità del test attraverso l&#39;induzione copia numero 10. Il metodo utilizza una pentola chimica in 384 pozzetti con la lettura finale fornito come misura dell&#39;assorbanza. Questa lettura è quantitativa, sensibile e automatizzati con un throughput fino a 100X piastre da 384 pozzetti al giorno, utilizzando un gestore di liquidi e lettore di piastre con annesso sistema di impilaggio.

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A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Questo protocollo descrive uno schermo ad alta velocità per l&#39;attività cellulosolitici da una libreria metagenomica espressa in Escherichia coli. Lo schermo è soluzione basata e altamente automatizzata, ed utilizza una pentola chimica nel 384 micropiastre bene con la lettura finale come una misura di assorbanza.

Una schermata di High Throughput per Biomining attività Cellulase da librerie metagenomiche

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

a-high-throughput-screen-for-biomining-cellulase-activity-from

Research

JoVE Journal

Biology

15.0K Views.  University of British Columbia - UBC. Questo protocollo descrive uno schermo ad alta velocità per l'attività cellulosolitici da una libreria metagenomica espressa in Escherichia coli. Lo schermo è soluzione basata e altamente automatizzata, ed utilizza una pentola chimica nel 384 micropiastre bene con la lettura finale come una misura di assorbanza.

Video: A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Su larga scala Schermi di librerie metagenomiche

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

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High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

High-throughput iperespressione schermo lievito plasmidi

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Throughput Screening elevati di attività Endoglucanase fungine in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other genome-wide analyses. mRNA-Seq even opens the gate for gene expression analysis of non-sequenced genomes. mRNA-Seq offers high sensitivity, a large dynamic range and allows measurement of transcript copy numbers in a sample. Illumina&#x2019;s genome analyzer performs sequencing of a large number (&gt; 107) of relatively short sequence reads (&lt; 150 bp).The &quot;paired end&quot; approach, wherein a single long read is sequenced at both its ends, allows for tracking alternate splice junctions, insertions and deletions, and is useful for de novo transcriptome assembly.
One of the major challenges faced by researchers is a limited amount of starting material. For example, in experiments where cells are harvested by laser micro-dissection, available starting total RNA may measure in nanograms. Preparation of mRNA-Seq libraries from such samples have been described1, 2 but involves significant PCR amplification that may introduce bias. Other RNA-Seq library construction procedures with minimal PCR amplification have been published3, 4 but require microgram amounts of starting total RNA.
Here we describe a protocol for the Illumina Genome Analyzer II platform for mRNA-Seq sequencing for library preparation that avoids significant PCR amplification and requires only 10 nanograms of total RNA. While this protocol has been described previously and validated for single-end sequencing5, where it was shown to produce directional libraries without introducing significant amplification bias, here we validate it further for use as a paired end protocol. We selectively amplify polyadenylated messenger RNAs from starting total RNA using the T7 based Eberwine linear amplification method, coined &quot;T7LA&quot; (T7 linear amplification). The amplified poly-A mRNAs are fragmented, reverse transcribed and adapter ligated to produce the final sequencing library. For both single read and paired end runs, sequences are mapped to the human transcriptome6 and normalized so that data from multiple runs can be compared. We report the gene expression measurement in units of transcripts per million (TPM), which is a superior measure to RPKM when comparing samples7.

Here we describe a method for preparation of both single read and paired end Illumina mRNA-Seq sequencing libraries for gene expression analysis based on T7 linear RNA amplification. This protocol requires only 10 nanograms of starting total RNA and generates highly consistent libraries representing whole transcripts.

Leggi singolo e accoppiamento finale mRNA-Seq Biblioteche Illumina da 10 nanogrammi di RNA totale

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microiniezioni di Sea Urchin zigoti

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Un manuale Schermo piccole molecole si avvicina ad alta velocità Uso embrioni di zebrafish

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Analisi qPCRTag - A High Throughput, Real Time PCR Assay per Sc2.0 genotipizzazione

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

Un protocollo per la valutazione funzionale del Whole-Protein Saturazione mutagenesi biblioteche Utilizzando High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;