Questo lavoro è stato supportato da una Burroughs-Wellcome Premio alla Carriera e da National Institutes of Health a concedere AI074832 GY Liu.

1. Preparazione del MRSA per infezione (due giorni prima infezione) <ol><li> Inoculare un&#39;ansata di MRSA da una coltura madre ad un agar sangue (soia-agar (TSA)) piastra. </li><li> Controllare il fenotipo emolisi (una zona chiara intorno ad ogni colonia) sulla piastra di agar sangue. </li><li> Scegli una colonia che ha un fenotipo emolitica che è coerente con altri esperimenti. </li><li> Inoculare la colonia in 3 ml di Todd Hewitt Broth (THB), con l&#39;antibiotico appropriato quando necessario, in un mL 15 snap-provetta. </li><li> Incubare a 37 ° C per una notte in agitazione a 220 rpm. </li></ol> 2. Preparazione del Mice per infezione (un giorno prima infezione) <ol><li> A seconda delle dimensioni dei topi, accorciare il pelo fuori uno x 3 4 cm sulla superficie posteriore di topi. </li><li> Applicare ~ 5 mm 3 crema Epilatore (acquistato da un negozio locale di droga) per l&#39;area rasata. </li><li> Lasciare la crema Epilatore per incubare sulla superficie della pelle per circa 1 min. </li><li> Tovaglioli di carta bagnati con DDH 2 O. </li><li> Togliere la crema Epilatore con il tovagliolo di carta bagnato. </li></ol> 3. Preparazione del MRSA per infezione (nel giorno di infezione) <ol><li> Diluire la coltura batterica durante la notte a 1:500 a 1:1000 con 10 ml di pre-riscaldato THB, in una da 50 ml con tappo a vite del tubo. </li><li> Incubare a 37 ° C per circa 2,5 ore con agitazione a 220 giri al minuto, fino a raggiungere 540 2.5. </li><li> Raccogliere MRSA per centrifugazione a 3.225 xg per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet batterico in 10 ml di fosfato salina tamponata Dulbecco (DPBS). </li><li> Ripetere i passaggi 3 e 4. </li><li> Risospendere il pellet batterico in DPBS ad una concentrazione desiderata. </li><li> Serie diluire la sospensione batterica da 10 Gennaio - 10 AGOSTO. </li><li> Piastra la sospensione diluita batterica su piastre di agar sangue. </li><li> Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte. </li><li> Osservare e registrare il fenotipo emolitica del inoculi. </li><li> Contare le unità formanti colonia (CFU) il numero sul piatto. </li><li> Calcola il inoculi in base al numero UFC sul piatto. </li></ol> 4. Sottocutaneo infezione di MRSA (nel giorno di infezione e 3 giorni dopo l&#39;infezione) <ol><li> Iniettare per via sottocutanea 100 microlitri della sospensione batterica nella zona rasata. </li><li> Osservare gli animali da 3 a 5 ore dopo l&#39;iniezione per assicurarsi che i topi sono vivi. </li><li> Osservare la lesione sul dorso degli animali e registrare ogni giorno la zona della lesione ogni giorno quando è necessario. Osservazione lesione dovrebbe includere la registrazione di dimensione della lesione e morfologia. Sia la pelle e le lesioni muscolari sono quantificata moltiplicando la lunghezza e la larghezza della lesione. Lesioni di forma irregolare devono essere suddivisi in piccoli pezzi simmetrici, e ogni pezzo misurato con lo stesso metodo. Misure lesione può anche utilizzare un computer-assistita del programma di valutazione istomorfometrica (ImageJ; open-source disponibile presso il NIH di <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) 2. </li><li> Sacrificare gli animali al giorno 3 dopo l&#39;infezione per inalazione dei isoflurano seguita da dislocazione cervicale. </li><li> Osservare e registrare la lesione sulla pelle. </li><li> Nick la pelle con un paio di forbici sterili. </li><li> Sbucciare la pelle fuori e osservare attentamente e registrare la lesione del muscolo. </li><li> Accise della lesione e di circa 2 - 5 mm della zona circostante. </li><li> Raccogliere milza e reni. </li><li> Omogeneizzare i tessuti utilizzando un omogeneizzatore tessuto o dalla ripetuta applicazione di un pistone di una siringa da 1 ml in una provetta da microcentrifuga contenente il tessuto e 100 ml di DPBS. </li><li> Aggiungere 900 ml di DPBS ad ogni provetta. </li><li> Vortex i campioni per 5 minuti. </li><li> Serie diluire la sospensione con DPBS 10 gennaio-10 giugno. </li><li> Piastra le sospensioni diluito su piastre THA. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: <ol><li> Subito dopo ogni iniezione sottocutanea, una bozza verrà osservato sulla superficie della pelle quando l&#39;infezione è fatto correttamente (Figura 1A). Se non bleb si osserva sulla superficie della pelle, l&#39;iniezione può essere troppo profondo, e questo può influenzare l&#39;esito dell&#39;infezione (dimensione della lesione, CFU). </li><li> La sospensione batterica deve essere diluito in serie e la CFU devono essere esaminati su piastre di agar sangue per ogni esperimento. Questo passo porterà importanti informazioni: 1) se l&#39;inoculo hanno fenotipo omogeneo; 2) l&#39;esatto numero di organismi vitali per l&#39;infezione batterica. </li><li> Le lesioni e la sopravvivenza dei batteri può essere valutato in vari momenti dopo l&#39;infezione. Qui, abbiamo esaminato l&#39;infezione al giorno 3 dopo l&#39;infezione. Le dimensioni della lesione vengono analizzati sulla superficie della pelle (Figura 1B: 1x 10 9; 1D Figura: 1 x 10 7 CFU) e sulla superficie del muscolo (Figura 1C: 1x 10 9 </sfino&gt;; Figura 1E: 1 x 10 7 CFU). L&#39;area di lesione uguale lunghezza (mm) x larghezza (mm) può essere misurato per valutare il danno tissutale (Fig. 2 A e B). Questo risultato può aiutare a determinare l&#39;entità del danno tissutale causato da un fattore di virulenza dato. Inoltre, le lesioni sono escisse e omogeneizzati in DPBS, e placcato per quantificare il numero di CFU (Figura 2C), che indica la vitalità dei batteri nella sede di infezione. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2528/2528fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. La pelle e le lesioni muscolari. CD1 topi sono stati inoculati per via sottocutanea su un fianco con MRSA (LAC). Le foto sono state scattate a 0 ora e il giorno 3 post-infezione. (A) durante il giorno 0 post-infezione (pi), (B) - (G) 3 ° giorno pi, B, D e F: lesioni cutanee, C, E e G: lesioni muscolari, B e C: 1 x 10 9 CFU infetti, D ed E: 1 x 10 7 CFU infetti, F e G: finto. <img src="/files/ftp_upload/2528/2528fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Dimensioni della lesione cutanea e batteri vitali contare nella sede di infezione al giorno 3 dopo l&#39;infezione. Lesioni della pelle e muscoli sulla MRSA (LAC) infettati topi CD1. (A) dimensioni lesione della pelle. (B), dimensione della lesione muscolare. (C) Totale CFU tessuto. H: 1 x 10 9 inoculi CFU; L: 1 x 10 7 CFU inoculi. *: P &lt;0,05, test di Mann-Whitney.

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	<li>Ahn, J. Y., Song, J. Y., Yun, Y. S., Jeong, G., Choi, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+Staphylococcus+aureus-infected+septic+mice+by+suppression+of+early+acute+inflammation+and+enhanced+antimicrobial+activity+by+ginsan.">Protection of Staphylococcus aureus-infected septic mice by suppression of early acute inflammation and enhanced antimicrobial activity by ginsan.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 46, 187-197 (2006).</li><li>Girish, V., Vijayalakshmi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affordable+image+analysis+using+NIH+Image/ImageJ.">Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ.</a> Indian J Cancer. 41, 47-47 (2004).</li><li>Hahn, B. L., Onunkwo, C. C., Watts, C. J., Sohnle, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+dissemination+and+cutaneous+damage+in+a+mouse+model+of+staphylococcal+skin+infections.">Systemic dissemination and cutaneous damage in a mouse model of staphylococcal skin infections.</a> Microb Pathog. 47, 16-23 (2009).</li><li>Hruz, P., Zinkernagel, A. S., Jenikova, G., Botwin, G. J., Hugot, J. P., Karin, M., Nizet, V., Eckmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOD2+contributes+to+cutaneous+defense+against+Staphylococcus+aureus+through+alpha-toxin-dependent+innate+immune+activation.">NOD2 contributes to cutaneous defense against Staphylococcus aureus through alpha-toxin-dependent innate immune activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12873-12878 (2009).</li><li>Ji, Y., Zhang, B., Van, S. F., Horn, P. W. a. r. r. e. n., Woodnutt, G., Burnham, M. K., Rosenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+critical+staphylococcal+genes+using+conditional+phenotypes+generated+by+antisense+RNA.">Identification of critical staphylococcal genes using conditional phenotypes generated by antisense RNA.</a> Science. 293, 2266-2269 (2001).</li><li>Somerville, G. A., Beres, S. B., Fitzgerald, J. R., DeLeo, F. R., Cole, R. L., Hoff, J. S., Musser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+serial+passage+of+Staphylococcus+aureus:+changes+in+physiology,+virulence+factor+production,+and+agr+nucleotide+sequence.">In vitro serial passage of Staphylococcus aureus: changes in physiology, virulence factor production, and agr nucleotide sequence.</a> J Bacteriol. 184, 1430-1437 (2002).</li><li>Tseng, C. W., Kyme, P., Low, J., Rocha, M. A., Alsabeh, R., Miller, L. G., Otto, M., Arditi, M., Diep, B. A., Nizet, V., Doherty, T. M., Beenhouwer, D. O., Liu, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Panton-Valentine+leukocidin+contributes+to+inflammation+and+muscle+tissue+injury.">Staphylococcus aureus Panton-Valentine leukocidin contributes to inflammation and muscle tissue injury.</a> PLoS One. 4, e6387-e6387 (2009).</li><li>von Kockritz-Blickwede, M., Rohde, M., Oehmcke, S., Miller, L. S., Cheung, A. L., Herwald, H., Foster, S., Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+mechanisms+underlying+the+genetic+predisposition+to+severe+Staphylococcus+aureus+infection+in+the+mouse+model.">Immunological mechanisms underlying the genetic predisposition to severe Staphylococcus aureus infection in the mouse model.</a> Am J Pathol. 173, 1657-1668 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

<ol><li> La pelle morbida modello murino e l&#39;infezione dei tessuti è un potente strumento per la valutazione di virulenza in vivo di un agente patogeno. La patogenicità di S. aureus in infezioni della pelle e dei tessuti molli può variare in funzione una serie di parametri. Queste includono la dimensione dell&#39;inoculo, fase di crescita batterica, la profondità di inoculazione, all&#39;età di topi, e lo sfondo del mouse genetico 7, 8. Nell&#39;esaminare la funzione di virulenza utilizzando questo...

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		<tr>
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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>THB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>95025-314</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21-031-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>27G1/2 needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>305109</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sheep Blood Agar (TSA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>90004-328</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

subcutaneous infection of methicillin resistant staphylococcus aureus (mrsa)

MRSA è una minaccia mondiale per la salute pubblica, e la pelle MRSA e dei tessuti molli ora rappresentano più della metà di tutti i tessuti molli negli Stati Uniti. Fra tessuti molli, miosite, pyomyositis, e fascite necrotizzante sono state aumentate le segnalazioni in associazione con MRSA derivanti dalla comunità. Per capire l&#39;interazione tra MRSA e immunità dell&#39;ospite che porta a più gravi infezioni, la disponibilità di modelli animali è fondamentale, permettendo lo studio dei fattori di accoglienza e batterica. Diversi modelli di infezione sono stati introdotti per valutare la patogenesi di S. aureus durante l&#39;infezione superficiale della pelle. Qui, descriviamo un modello di infezione per via sottocutanea che esamina la pelle, sottocutaneo, muscolare e patologie.

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Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Murino e morbida pelle modello di infezione dei tessuti viene utilizzato per valutare la funzione di virulenza di S. aureus meticillino-resistente (MRSA) e le risposte immunologiche ospite. Qui, abbiamo presentato un modello di infezione per via sottocutanea per la pelle e le infezioni dei tessuti molli.

Sottocutaneo infezione di Staphylococcus aureus meticillino resistente (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

subcutaneous-infection-methicillin-resistant-staphylococcus-aureus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

22.8K Views.  Cedars-Sinai Medical Center. Murino e morbida pelle modello di infezione dei tessuti viene utilizzato per valutare la funzione di virulenza di S. aureus meticillino-resistente (MRSA) e le risposte immunologiche ospite. Qui, abbiamo presentato un modello di infezione per via sottocutanea per la pelle e le infezioni dei tessuti molli.