Gli autori desiderano ringraziare il Dipartimento di Biologia presso la Syracuse University e il Dr. Marilyn Kerr per il loro ruolo nella gestione del corso di Biologia comparata dei Vertebrati. Il laboratorio Albertson è supportato da concedere R21DE019223 dal National Institutes of Health / National Institute of Dental Research e craniofacciale, oltre a concedere R01AG031922 dal National Institutes of Health / National Institute on Aging.

1. Trasformazione plasmide di Target cDNA Parte I: Trasformazione di plasmidi (Tempo richiesto: 3 ore più notte di incubazione) <ol><li> SOC caldo brodo di coltura in un bagno d&#39;acqua ° 42 C (500 microlitri per reazione) </li><li> Scongelare le cellule competenti sul ghiaccio </li><li> Aggiungere 1 ml plasmide a 25 microlitri cellule competenti </li><li> Mettere in ghiaccio per 20 minuti </li><li> Scossa cellule bagno di calore in 42 ° C acqua per 45 secondi </li><li> Immediatamente posto le cellule in ghiaccio per 2 minuti </li><li> Aggiungere 500 ml di 42 ° C brodo di coltura di ogni flaconcino di cellule </li><li> Agitare a 37 ° C per 2 ore a 255 giri al minuto (rpm) </li><li> Tavola 75 mix trasformazione microlitri su Luria Bertani (LB) piastre di agar </li><li> Incubare le piastre invertita a 37 ° C per una notte </li></ol> Parte II: E. coli Cultura (Tempo richiesto: 15 minuti più incubazione overnight) <ol><li> Per ogni reazione, aliquota 3 ml di brodo LB e 3 ml di 50 mg / ml di ampicillina in un tubo di cultura </li><li> Raschiare 1 colonia batteri dalla piastra di agar e aggiungere ad ogni provetta cultura </li><li> Agitare provette di coltura a 37 ° C a 255 giri al minuto durante la notte </li></ol> Parte III: Prep plasmidi (Tempo richiesto: 1,5 ore) <ol><li> Isolare plasmide di culture durante la notte con il 5 Kit Primo Mini FastPlasmid (Catalogo # 2300000) </li><li> Per verificare la presenza del plasmide preparato, eseguire il DNA eluito dal kit su un 1% di Tris-Acetato-EDTA (TAE) gel colorato con bromuro di etidio </li></ol> 2. In Situ DIG marcato Sintesi RNA sonda Parte I: Linearizzazione di plasmidi (Tempo richiesto: 2,5 ore) <ol><li> In una provetta da microcentrifuga 1,5 ml, si combinano: <table border="1"><tbody><tr><td> Preparato plasmidi </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Enzima di restrizione * </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Buffer ** </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> 10X sieroalbumina bovina (BSA) </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> Dietil pirocarbonato (DEPC) Acqua </td><td> 58 ml </td></tr><tr><td></td><td> 100 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Incubare a 37 ° C per 2 ore * Varia con plasmide ** Varia con l&#39;enzima di restrizione </li></ol> Parte II: Trascrizione (Tempo richiesto: 3 ore) <ol><li> In una provetta da microcentrifuga 1,5 ml, si combinano: <table border="1"><tbody><tr><td> Lineare plasmidi </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Trascrizione Buffer 10X ** </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Digossigenina Etichetta Mix </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Polimerasi * </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> RNasi inibitore </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> DEPC acqua </td><td> 24 ml </td></tr><tr><td></td><td> 40 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Incubare a 37 ° C per 1 ora </li><li> Aggiungere 2 ml di * polimerasi </li><li> Incubare a 37 ° C per 1 ora </li><li> Aggiungere 2 ml di DNasi </li><li> Incubare a 37 ° C per 20 minuti * Varia con plasmide ** Varia con la polimerasi </li></ol> Parte III: Precipitazioni (Tempo richiesto: 5 minuti più 2 ore per notte di incubazione, 1 ora di centrifugare e risospendere) <ol><li> Aggiungere 4 ml di EDTA 0,2 M </li><li> Aggiungere 5 ml di cloruro di litio 4M </li><li> Aggiungere 150 ml di etanolo freddo ghiaccio al 100% </li><li> Incubare a -80 ° C per 2 ore a notte </li><li> Centrifugare a 14.000 rpm per 30 minuti a 4 ° C, lontano decantare il surnatante </li><li> Pellet secco per 7 minuti </li><li> Risospendere in 20 microlitri di acqua DEPC </li><li> Incubare a 37 ° C per 5 minuti </li></ol> Parte IV: Frazionamento - Eseguire solo se la dimensione della sonda è maggiore di 0,6 kb (Tempo richiesto: Varia in base alle dimensioni della sonda, di solito non più di 20 minuti) <ol><li> In una provetta da microcentrifuga 1,5 ml, si combinano: <table border="1"><tbody><tr><td> RNA sonda </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> DEPC acqua </td><td> 12 ml </td></tr><tr><td> Sodio Bicarbonato </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Carbonato di sodio </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td></td><td> 40 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Incubare in un bagno d&#39;acqua a 60 ° C. Base il tempo di incubazione sull&#39;equazione: Tempo (min.) = (a partire kb - voluta kb) / (0,11 x a partire kb x desiderato kb) Media dimensione desiderata = 0,6 kb </li></ol> Parte V: Precipitazioni finale (Tempo richiesto: 5 minsce più 2 ore per notte di incubazione, 1 ora di centrifugare e ri-sospendere, 1 ora per elettroforesi su gel) <ol><li> Aggiungere 40 microlitri di acqua DEPC </li><li> Aggiungere 8 microlitri di sodio acetato </li><li> Aggiungi 1,04 microlitri di acido acetico glaciale </li><li> Aggiungere 240 microlitri etanolo freddo ghiaccio al 100% </li><li> Incubare a -80 ° C per 2 ore a notte </li><li> Centrifugare a 14.000 rpm per 30 minuti a 4 ° C, lontano decantare il surnatante </li><li> Pellet secco per 7 minuti </li><li> Risospendere in 20 microlitri di acqua DEPC </li><li> Vortex per miscelare </li><li> Per verificare la presenza di riboprobe, eseguire il risospese in una soluzione 1% gel colorato TAE con bromuro di etidio </li></ol> 3. Montare tutto ibridazione in situ Parte I: Fissazione di embrioni e di digestione proteinasi K (Tempo richiesto: Fix più 4 ore durante la notte il giorno dopo per la conservazione, 2,5 ore da storage a parte II) <ol><li> Raccogliere in scena embrioni di zebrafish e fissare nel 4% paraformaldeide (PFA) notte a 4 ° C </li><li> Lavare gli embrioni fissato in tampone fosfato contenente 0,1% di Tween-20 (PBST) 3 volte per 10 minuti ciascuno </li><li> Per garantire l&#39;esposizione degli embrioni ai reagenti sperimentale, gli embrioni dechorionate manualmente (se necessario) con pinze a punta fine </li><li> Disidratare embrioni con il lavaggio in una serie graduata di 25% e 50% di metanolo in PBST per un&#39;ora ogni lavaggio, quindi memorizzare in 100% di metanolo a -20 ° C </li><li> Quando si è pronti ad utilizzare, reidratare gli embrioni in PBST con il lavaggio a 50% (2 volte) e il 25% (1 volta) metanolo in PBST per 10 minuti ciascuno. Infine lavare 2 volte per 10 minuti ciascuno in 100% PBST. Data esatta non è importante per PBST / metanolo lava </li><li> Embrioni candeggina in una soluzione di perossido di idrogeno al 10% in PBST, se necessario, per rimuovere i pigmenti scuri. Gli embrioni devono incubare in una soluzione di perossido di idrogeno per 10-20 minuti, a seconda dell&#39;età dell&#39;embrione, e il tappo della provetta da microcentrifuga deve rimanere aperta per evitare l&#39;accumulo di pressione dell&#39;aria </li><li> Embrioni digerire con 50 mg / ml proteinasi K diluito 1:5000 in PBST per 3-15 minuti, a seconda dell&#39;età degli embrioni </li><li> Ri-fix embrioni in PFA 4% per 30 minuti, e poi lavare 3 volte in PBST per 5 minuti ciascuno </li></ol> Parte II: ibridazione di Riboprobes (Tempo richiesto: 3 ore in più durante la notte per l&#39;ibridazione, 1,5 ore il giorno successivo alla Parte III) <ol start="9"><li> Prehybridize embrioni con la soluzione prehybridization (PHS), in un caldo 70 ° C acqua bagno per 2-3 ore </li><li> Rimuovere PHS, aggiungere 0,5 mL soluzione di ibridazione e di 1,5 microlitri precedentemente sintetizzato riboprobes digossigenina marcato, incubare a 70 ° C durante la notte. La temperatura può oscillare all&#39;interno di pochi gradi a seconda del bersaglio riboprobe </li><li> Il giorno dopo, lavare gli embrioni a 70 ° C in soluzioni graduali di 75%, 50% e 25% PHS di 2X citrato di soluzione fisiologica di sodio (SSC) per 10 minuti ciascuno, quindi lavare in SSC 0.2X per 30 minuti a 68 ° C </li><li> Lavare in tampone di acido maleico (MAB) 2 volte per 10 minuti a temperatura ambiente </li></ol> Parte III: Anti-digossigenina (α-DIG) Incubazione Anticorpo (Tempo richiesto: 3 ore in più durante la notte per bloccare, 2,5 ore il giorno successivo alla Parte IV) <ol start="13"><li> Trasferimento degli embrioni a una piastra 12 pozzetti </li><li> Pre-embrioni in blocco 1-2 mL di soluzione di blocco per almeno 3 ore a temperatura ambiente </li><li> Allo stesso tempo, pre-blocco l&#39;anticorpo preparando un secondo volume di soluzione di saturazione e diluendo il anticorpo anti-digossigenina 1:2000 in questa soluzione </li><li> Rimuovere pre-blocco e aggiungere 1-2 ml di pre-bloccato α-DIG soluzione, incubare una notte a 4 ° C </li><li> Il giorno dopo, lavare gli embrioni in MAB. Lasciare gli embrioni ad incubare in MAB per 5 minuti prima, quindi eseguire modifiche del buffer e incubare per due di 10 minuti, uno di 30 minuti e un intervallo di 60 minuti. Data esatta non è necessaria </li><li> Lavare embrioni 3 volte per 5 minuti ciascuno in fosfatasi alcalina (AP) tampone </li></ol> Parte IV: La colorazione e trattamento finale (Tempo richiesto: 1 ora a notte per la colorazione, a seconda della riboprobe usato, 4 ore all&#39;inizio della lava glicerolo, 6-10 ore per lavare glicerolo, possono essere conservati in glicerolo) <ol start="19"><li> Aggiungere 1-2 mL di soluzione colorante per gli embrioni, avvolgere la piastra in alluminio, colorazione e controllare a intervalli regolari (ogni 20 minuti circa) fino a colorazione è sufficiente </li><li> Lavare gli embrioni con PBST 2 volte per 5 minuti ciascuno per fermare la reazione di colorazione </li><li> Disidratare embrioni utilizzando 10 lavaggi minuti nel 25% (1 volta) e il 50% (2 volte) metanolo in PBST, poi in 100% di metanolo, per eliminare la colorazione di fondo </li><li> Lasciare embrioni ad incubare in 100% di metanolo per almeno 2 ore a temperatura ambiente </li><li> Reidratare in PBST con 10 lavaggi minuti nel 50% (2 volte) e il 25% (1 volta) metanolo in PBST, quindi lavare in 100% PBST 2 volte </li><li> Trasferimento e coloratimbryos ad una soluzione di glicerolo 80% in PBST, utilizzando una serie graduata di lava, e conservare a 4 ° C. </li></ol> Ricette: <ul><li> Piastre di agar-10 LB agar LB g + 250 ml di acqua distillata, autoclave, quando fredde al tatto si aggiungano 250 microlitri ampicillina, versare 15-20 mL di soluzione calda in ogni scatola di Petri, permettono agar per solidificare </li><li> LB brodo-12.5 g brodo LB + 200 ml di acqua distillata, autoclave, lasciare raffreddare prima dell&#39;uso </li><li> 1% TAE-gel 0.4 g di agarosio, 40 ml 1X TAE, 2 bromuro di etidio microlitri; carico 7 microlitri plasmide (plasmidi Trasformazione di Target cDNA) o 3 riboprobe microlitri di acqua e 4 microlitri DEPC (in situ DIG marcato Sintesi RNA Probe) + 1 tintura microlitri di carico, 5 scaletta del DNA microlitri </li><li> Prehybridization soluzione-50% formammide, SSC 5X, 9.2mm acido citrico, 1% Tween-20 </li><li> Ibridazione soluzione prehybridization soluzione più 500 mg / ml tRNA e 50 mg / mL di eparina </li><li> MAB-100mm acido maleico, 150mm NaCl, NaOH 0,2 M, 0,1% Tween-20, il pH a 7,5 </li><li> Blocco Soluzione-3 parti MAB, 1 parte di reagente al 10% Boehringer blocco in MAB, 1 parte di calore disattivato agnello siero </li><li> AP buffer-60mm Tris-HCl pH 9.5, NaCl 60mm, 30mm MgCl 2, 0.1% Tween-20 </li><li> Soluzione-5-Bromo-4-cloro-3-fosfato indolil colorazione (BCIP) e Nitro blu di tetrazolio (NBT) in tampone AP </li></ul> 4. RAPPRESENTANTE RISULTATI Quando eseguito correttamente, la reazione tra l&#39;NBT, BCIP, e fosfatasi alcalina si formerà un precipitato viola che dovrebbe apparire sul pesce zebra embrione come una macchia viola. Riboprobes deve essere preventivamente sintetizzato da cDNA corrispondente al gene di interesse. Pertanto, si può concludere qualsiasi visualizzati macchia rappresenta le aree del pesce zebra in cui il gene di interesse è stato trascritto in quella fase particolare dello sviluppo. Ai fini di questo corso, sono stati sintetizzati da riboprobes aldh1a2 (precedentemente raldh2; Begemann et al, 2001;. Figura 1); fgf8a (Reifers et al, 1998;. Figura 2); deltaC (Oates et al, 2005.) myod1 (Weinberg et al, 1996.) shha (. Krauss et al, 1993), pax2a (Brand et al, 1996;. Figura 3) e myl7 (precedentemente cmlc2;. Yelon et al, 1999) cDNA. La colorazione era atteso sulla linea mediana e in strutture anatomiche tra cui il somiti, tailbud, myotome, cervello e cuore. Mutanti Ace/fgf8a ci si aspettava di avere difetti di molte di queste strutture. La colorazione era facilmente visualizzati utilizzando un microscopio standard di dissezione. Ulteriori fonti contengono maggiori informazioni e suggerimenti su Wish tecniche simili a quelle descritte qui (Clark, 2003;. Costa D&#39;et al, 2009; Schmoldt et al, 2009;. Schoenwolf, 2009). <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Un embrione di zebrafish 24 ore dopo la fecondazione, che è stata ibridata con riboprobes specifici per aldh1a2. Colorazione specifica può essere vista negli occhi, romboencefalo, pinne pettorali gemma primordi, e somiti. Anteriore è al top, posteriore è al fondo. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Un embrione di zebrafish allo stadio di 13 somiti di sviluppo che è stato ibridato con una sonda specifica per fgf8a. Colorazione specifica è visto nel telencefalo, diencefalo dorsale, mesencefalo-rombencefalo confine, somiti e tailbud. È ventrale a sinistra, dorsale è a destra. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Un post 22 ore embrione fecondazione zebrafish che è stato ibridato con una specifica riboprobe per pax2a, un marker utile per la visualizzazione robusto il sistema nervoso. Colorazione specifica può essere visto nella fessura coroide, mesencefalo-rombencefalo confine, vescicola dell&#39;orecchio, e neuroni del midollo spinale. Con vista dorsale anteriore a sinistra.

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	<li>Albertson, R. C., Yelick, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+fgf8+signaling+in+left-right+patterning+of+the+visceral+organs+and+craniofacial+skeleton.">Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton.</a> Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).</li><li>Aramaki, M., Kimura, T., Udaka, T., Kosaki, R., Mitsuhashi, T., Okada, Y., Takahashi, T., Kosaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+expression+profile+of+chicken+CHD7,+the+ortholog+of+the+causative+gene+for+CHARGE+syndrome.">Embryonic expression profile of chicken CHD7, the ortholog of the causative gene for CHARGE syndrome.</a> Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 79, 50-57 (2007).</li><li>Begemann, G., Schilling, T. F., Rauch, G. 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A., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+zebrafish+genes+affecting+the+formation+of+the+boundary+between+midbrain+and+hindbrain.">Mutations in zebrafish genes affecting the formation of the boundary between midbrain and hindbrain.</a> Development. 123, 179-190 (1996).</li><li>Clark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ Hybridization: Laboratory Companion. , (2003).</li><li>D'Costa, A., Shepherd, I. 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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Desiderio era utilizzato in un corso di laboratorio di Biologia comparata dei vertebrati per aiutare gli studenti a comprendere il ruolo della genetica nello sviluppo anatomico attraverso la visualizzazione di modelli noti di espressione genica. Per la prima parte del corso, gli studenti eseguito dissezioni sugli organismi che rappresentino più diversi taxa cordati, permettendo loro il tempo per studiare, capire, confrontare e vertebrati anatomia contrasto. Come introduzione alla seconda parte del corso, gli studenti hanno ricevuto una lezione formale che descrive lo sviluppo zebrafish e anatomia. I metodi e risultati attesi dell&#39;esperimento WISH sono stati anche discussi. Gli studenti hanno poi dato zebrafish vivo al somitogenesis e prim-6 fasi di sviluppo, ed a 2 e 5 giorni dopo la fecondazione (DPF) di esaminare al microscopio dissezione. Questo è stato quello di dare agli studenti una migliore comprensione di ciò che embrioni di zebrafish aspetto e le tipologie di cambiamenti morfologici che si verificano con l&#39;ontogenesi. Nella prossima sessione di laboratorio, gli studenti hanno ricevuto embrioni di zebrafish, in cui desiderio era stato precedentemente effettuato. Sono stati invitati a studiare e descrivere i pattern di espressione genica per ogni gene di interesse (riboprobe utilizzato). Gli embrioni utilizzati per DESIDERA sono stati ottenuti da accoppiamenti tra i membri di una linea eterozigoti ace/fgf8a. Sulla base di eredità mendeliana, il 25% degli embrioni da accoppiamenti ace/fgf8a dovevano essere omozigoti mutanti e di esporre i difetti di molte delle strutture anatomiche focalizzato su in questo corso. Sulla base delle relazioni pubblicate e osservazioni non pubblicate in laboratorio Albertson, difetti nel cervello e nel cuore loop improprio ci si aspettava, così come difetti del somiti (Brand et al, 1996;. Albertson e Yelick, 2005; osservazioni personali). Agli studenti è stato chiesto di esaminare tutti i campioni, wild-type (animali eterozigoti sono indistinguibili da fratelli di tipo selvatico nelle fasi iniziali di sviluppo) e mutanti omozigoti, per ogni pattern di espressione genica presentato. Sono stati poi chiesto di scrivere relazioni di laboratorio che descrivono i loro risultati, e in base alla loro conoscenza dell&#39;anatomia e della genetica, come espressione dei geni difettosi possono avere precipitato malformazioni anatomiche. Studenti sembravano a ricevere questo esercizio di laboratorio con entusiasmo e curiosità. La maggior parte non avevano mai usato prima e DESIDERA erano estremamente interessati a questa parte del corso. Gli studenti trovano i diversi modelli di espressione genica in embrioni di zebrafish intrigante, alcuni addirittura descritto il pattern di colorazione visualizzati associandoli con i ben noti disegni e simboli, come ad esempio una faccina sorridente. Le relazioni di laboratorio risultante ha mostrato gli studenti avevano una comprensione generale del protocollo desiderio e l&#39;espressione dei geni in specifiche strutture anatomiche. Gli studenti sono stati necessari per comprendere le funzioni specifiche dei geni studiati utilizzando WISH durante l&#39;(Stickney et al, 2000 laboratorio;. Huelsken et al, 2002;. Geetha-Loganathan et al, 2008a;.. Gita-Loganathan et al, 2008b ). Era evidente però, che alcuni studenti hanno una conoscenza limitata di fondo delle vie di segnalazione e di geni di interesse. Ulteriori informazioni su questi concetti nel desiderio conferenza introduttiva potrebbe essere una gradita aggiunta per l&#39;utilizzo del desiderio in futuro corsi di vertebrati Comparative Biology. Dato che il protocollo richiede generalmente quattro giorni consecutivi, a seconda del calendario del corso, gli studenti possono solo essere in grado di completare una parte dell&#39;esperimento in classe e l&#39;istruttore deve essere responsabile per il resto. Nella nostra classe comparata Biologia dei Vertebrati, studenti hanno completato le reazioni colorazione in laboratorio, mentre l&#39;Assistente didattico effettuato tutti i passaggi precedenti. Se si preferisce avere il WISH studenti svolgono in classe, il protocollo può essere diviso in subunità che può essere eseguito su diverse sessioni di laboratorio, a seconda del lasso di tempo della classe. Se non è possibile per gli studenti a svolgere l&#39;intero protocollo, come è stato qui per l&#39;incontro di laboratorio una volta alla settimana, gli studenti possono aggiungere la soluzione colorante all&#39;inizio di classe e, a seconda del riboprobe usato, hanno la colorazione completa nel giro di un&#39;ora. Il tempo necessario per la macchia di sviluppare varia notevolmente con ogni riboprobe e una varietà di condizioni sperimentali, e devono essere predeterminati prima classe. In particolare, se gli studenti saranno solo sviluppando la macchia in laboratorio, gli istruttori sarà responsabile per tutte le fasi precedenti, che richiederà tempo e risorse al di fuori della classe. Se lo si desidera, un&#39;alternativa più breve di DESIDERA potrebbe essere immunoistochimica, utilizzando etichette di anticorpi per visualizzare la localizzazione delle proteine, tuttavia in questo momento, zebrafish anticorpi specifici per i geni dello sviluppo non sono facilmente disponibili. Un&#39;altra opzione sarebbe quella di eseguire DESIDERA su diverse specie di vertebrati uno° gli studenti hanno confrontare i pattern di espressione degli stessi geni in diversi organismi (Pizard et al, 2004;. Aramaki et al, 2007;. Organismi modello emergente, 2008; organismi modello emergente, 2010). L&#39;obiettivo primario di utilizzare desiderio in un corso di biologia comparata dei vertebrati è stato quello di dimostrare agli studenti come vengono utilizzate tecniche di biologia molecolare per studiare lo sviluppo anatomico. Ha anche fornito l&#39;opportunità per gli studenti di speculare su come modificare l&#39;espressione genica può portare non solo a malformazioni di sviluppo, ma anche di cambiamento evolutivo. Formalizzato come la biologia evoluzionistica dello sviluppo (spesso definito come &quot;evo-devo&quot;), questo campo in rapida crescita di studio mira a collegare genotipo e fenotipo attraverso lo sviluppo, e di chiarire le basi meccanicistiche potenziale di cambiamento evolutivo. Con l&#39;ascesa di questo campo, più ecologi, biologi organismal, e fisiologi stanno adottando tecniche molecolari nella loro ricerca. Ci sostengono che l&#39;uso di desiderio in un corso di Biologia comparata dei Vertebrati contribuirà a mantenere il curriculum aggiornato con gli attuali progressi tecnologici e concettuali nella ricerca, e per facilitare un migliore allineamento orizzontale dei corsi di alto livello, combinando biologia sottocampi biologico. Inoltre, questo approccio integrato offrirà agli studenti l&#39;opportunità di imparare una varietà di tecniche di ricerca biologica in un unico corso, portando a una formazione più diversificata e la promozione della futura ricerca scientifica interdisciplinare.

<ul><li> Autoclave </li><li> Micro-centrifuga </li><li> 37 ° C incubatore (con agitatore) </li><li> 4 ° C, micro-centrifuga </li><li> Bagnomaria </li><li> Vortice </li><li> Gel elettroforesi apparato </li><li> Congelatore a -20 ° C </li><li> -80 ° C congelatore </li><li> Rocker / agitatore </li><li> 4 ° C frigorifero </li><li> Microscopio da dissezione (preferibilmente con uno schermo di insegnamento o fotocamera) </li></ul>

using whole mount in situ hybridization to link molecular and organismal biology

Montare tutto ibridazione in situ (WISH) è una tecnica comune nei laboratori di biologia molecolare per studiare l&#39;espressione genica attraverso la localizzazione di trascritti di mRNA specifico all&#39;interno intero campione mount. Questa tecnica (adattato da Albertson e Yelick, 2005) è stato utilizzato in un superiore livello universitario comparativa aula laboratorio di Biologia dei Vertebrati alla Syracuse University. I primi due terzi del Comparative corso di laboratorio di Biologia dei Vertebrati ha dato agli studenti l&#39;opportunità di studiare l&#39;embriologia e anatomia degli organismi diversi che rappresentano diversi taxa cordati principalmente attraverso dissezioni tradizionale e l&#39;uso di modelli. La parte finale del corso ha comportato un approccio innovativo per l&#39;insegnamento dell&#39;anatomia attraverso l&#39;osservazione dello sviluppo dei vertebrati impiegando tecniche molecolari in cui è stata effettuata desiderio su embrioni di zebrafish. Un eterozigote fattore di crescita dei fibroblasti 8 bis (fgf8a) mutante linea, asso, è stato utilizzato. A causa di eredità mendeliana, asso incrociati prodotto wild-type, eterozigote e omozigote mutanti ace/fgf8a in un rapporto 01:02:01. Sonde di RNA con pattern di espressione nota sulla linea mediana e nello sviluppo di strutture anatomiche come il cuore, somiti, tailbud, myotome, e il cervello sono stati utilizzati. DESIDERO è stata effettuata utilizzando pesce zebra alla somite 13 e prim-6 tappe, con gli studenti di eseguire la reazione di colorazione in classe. Lo studio di embrioni di zebrafish a diversi stadi di sviluppo ha dato agli studenti la capacità di osservare come queste strutture anatomiche cambiata nel corso dell&#39;ontogenesi. Inoltre, alcuni mutanti ace/fgf8a visualizzata looping improprio cuore e difetti di somite e lo sviluppo del cervello. Gli studenti in questo laboratorio di osservare il normale sviluppo dei vari apparati utilizzando sia l&#39;anatomia esterni così come i modelli di espressione genica. Essi hanno inoltre identificato e descritto embrioni visualizzazione improprio sviluppo anatomico e di espressione genica (cioè, i mutanti putativo). Per gli istruttori di istituzioni che non già in possesso delle attrezzature necessarie e dove i fondi per laboratorio e di innovazione curriculare sono limitate, il costo finanziario dei reagenti e gli apparecchi possono essere un fattore da considerare, così come il tempo e lo sforzo necessario da parte del istruttore indipendentemente dall&#39;impostazione. Tuttavia, ci sostengono che l&#39;uso del desiderio in questo tipo di impostazione in aula di laboratorio in grado di fornire un collegamento importante tra la genetica dello sviluppo e anatomia. L&#39;avanzare della tecnologia e la capacità di studiare lo sviluppo organismal a livello molecolare diventa più facile, più economico, e sempre più popolare, molti biologi evoluzionisti, ecologisti, e fisiologi si stanno rivolgendo a strategie di ricerca nel campo della biologia molecolare. Utilizzando DESIDERANO in una comparativa aula laboratorio di Biologia dei Vertebrati è un esempio di come le molecole e anatomia possono convergere all&#39;interno di un singolo corso. Questo dà agli studenti universitari di livello superiore la possibilità di praticare le moderne tecniche di ricerca biologica, portando a una formazione più diversificata e la promozione della futura ricerca scientifica interdisciplinare.

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Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Intero monte<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; (desiderio) è stato utilizzato in un corso di laurea alto livello comparata dei vertebrati Biologia oltre a vertebrati dissezioni. Questo ha dato agli studenti l&#39;opportunità di studiare gli schemi di espressione genica e anatomia, che collega lo studio della biologia molecolare e organismal all&#39;interno di un corso.

Utilizzando il monte intero In situ Ibridazione a Link Biologia Molecolare e organismal

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

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Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

21.5K Views.  Syracuse University. Intero monte In situ (desiderio) è stato utilizzato in un corso di laurea alto livello comparata dei vertebrati Biologia oltre a vertebrati dissezioni. Questo ha dato agli studenti l'opportunità di studiare gli schemi di espressione genica e anatomia, che collega lo studio della biologia molecolare e organismal all'interno di un corso.

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Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

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Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Metodo per la colorazione intero anticorpi Monte a Chick

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish intero monte ad alta risoluzione doppia fluorescente In Situ Ibridazione

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Tutto il monte In Situ</emIbridazione> di E8.5 a E11.5 embrioni di topo

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

High-throughput mappatura fisica dei cromosomi con modalità automatizzate<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Cromosoma Timing Replica combinazione con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Tutta la Monte RNA fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; L&#39;ibridazione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; in embrioni Mount interi e istologia Adattato per Elasmobranchi Marine

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta Risoluzione intero monte<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in embrioni di zebrafish per studiare l&#39;espressione genica e la funzione

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...