Desidero ringraziare i molti studenti universitari che hanno lavorato nel mio laboratorio e ha contribuito all&#39;evoluzione di questi protocolli. NAT ha ricevuto il sostegno del Skidmore-Union Network, un progetto stabilito con un ANTICIPO PAGATO NSF sovvenzione.

I. RNA Mount tutto ibridazione in situ in Elasmobranchi Marine 1. Embrione Fissazione e preparazione <ol><li> Skate embrioni può essere messo in scena secondo Ballard 7. Stadi ottimali per il rilevamento di espressione genica dipende dal tessuto di interesse. Per tenere traccia di espressione genica nel tratto digestivo pattino, le fasi 27-30 sono ottimali 7. </li><li> Dissect embrioni in PBS, separando gli embrioni dal sacco vitellino. </li><li> Fissare in 30 ml di appena fatta paraformaldeide 4% (PFA) in una provetta da 50 ml a 4 ° C con gentile dondolio. Fix per 24 ore. </li><li> Lavare embrioni in PBT, due volte per 15 min, rotazione a temperatura ambiente. Tutte le ricette di soluzioni per il montaggio in situ di RNA intero &#39;s sono inclusi (Tabella 1). </li><li> Disidratare embrioni mediante lavaggio in una serie di metanolo 25%, 50% e 75% metanolo: PBT dondolo a temperatura ambiente. La durata dei lavaggi dipende dallo stadio degli embrioni. Per la pre-neurulation scena embrioni, 5 min di ogni lavaggio nella serie metanolo è sufficiente. Per gli embrioni più vecchi di fase 30, lavaggi possono durare fino a 30 minuti. Per determinare se gli embrioni sono sufficientemente penetrato e acclimatati per ogni lavaggio, tenere il tubo in posizione verticale in mano. Se gli embrioni si depositano sul fondo del tubo, allora siete pronti per il lavaggio successivo. Se gli embrioni a galla della soluzione, cambiare la soluzione e ripetere questo passo particolare disidratazione. </li><li> Lavare due volte in metanolo 100% per 10 minuti agitando lentamente. </li><li> Una volta disidratati al 100% metanolo, embrioni devono essere conservati a -20 ° C per almeno 24 ore prima di procedere con il protocollo. Gli embrioni sono stati correttamente conservati a -20 ° C ed utilizzato per montature RNA intero fino a 1 anno. </li></ol> 2. Sintesi di RNA Probe <ol><li> Generare un frammento lineare del gene la cui espressione si desidera rilevare. Ciò può essere fatto mediante amplificazione PCR o linearizzare un plasmide con il genedi interesse. Per amplificare mediante PCR, primer scegliere il cui legame siti fiancheggiano il gene inserire e conservare i siti di legame di RNA polimerasi della regione amplificata. Per i plasmidi di uso comune come PBS o pGEM, M15 in avanti e reverse primer sono l&#39;ideale. In alternativa, linearizzare un plasmide mediante digestione 15 microlitri di DNA QIAGEN miniprep con un enzima che scinde alla estremità 5 &#39;del gene. Gel estrarre e purificare con l&#39;apposito kit QIAquick. </li><li> Invertire trascrivere RNA utilizzando la sonda 8 microlitri di plasmide lineare o 100 ng del prodotto di PCR come modello utilizzando la RNA polimerasi appropriata (vedi Tabella 2 per reazione di trascrizione). </li><li> Incubare la reazione di trascrizione inversa per 2 ore a 37 ° C. </li><li> Per confermare la reazione, eseguire 1 microlitri della reazione di trascrizione su un 1% di agarosio / TAE gel. Esegui gel a 100 mVolts fino a quando il colorante ha appena incontrato il gel. Una singola banda di primo piano dovrebbe essere visibile. Il modello lineare frammento di DNA può essere debolmente visibili a molecolare maggiorelar peso. </li><li> Aggiungere 1 ml di RNasi-free DNasi I per la reazione di trascrizione e incubare a 37 ° C per 15 min. </li><li> Per precipitato, aggiungere 100 microlitri TE pH 8, 10 pl 4 M LiCl, 300 ul 100% EtOH e incubare a -20 ° C per almeno 60 minuti o per una notte. </li><li> Spin per 10 min a 4 ° C una microcentrifuga a 14.000 rpm. </li><li> Lavare pellet con% EtOH 70 e aria secca. </li><li> Risospendere RNA sonda in 20 ml di dH 2 O. Aggiungere 80 ml di tampone di ibridazione (tampone di ibridazione deve essere pre-riscaldato a 70 ° C). La sonda può essere memorizzato in tampone di ibridazione 80% per diversi mesi a -20 ° C o più a -80 ° C. </li></ol> 3. Embrioni pre-trattamento e ibridazione <ol><li> Rimuovere embrioni conservati in metanolo 100% da -20 ° C. Per i più piccoli embrioni procedere con il passo (3.2). Per la successiva fase di messa in scena embrioni (29/30 &lt;) si può visualizzare un strato di epidermide che si e &#39;tolto&#39; dal corpo dell&#39;embrione. Sotto il microscopio, con attenzione dissect lo strato epidermico per massimizzare la penetrazione della sonda. </li><li> Embrioni Luogo in fiale di vetro puliti scintillazione. Reidratare gli embrioni della serie metanolo inverso descritto sopra: (75%, 50%, 25% metanolo: PBT) agitando delicatamente ogni soluzione per ogni 5-30 min a temperatura ambiente. Reidratazione completa con due lavaggi di PBT per 10 minuti ciascuno, delicatamente a dondolo. </li><li> Per rimuovere qualsiasi pigmento, embrioni candeggina con perossido di idrogeno al 6% in PBT per 1 ora a temperatura ambiente, dondolo. </li><li> Rimuovere perossido di idrogeno mediante lavaggio tre volte in PBT, (dondolo a temperatura ambiente, 10 min ciascuna). </li><li> Trattare embrioni con proteinasi K per consentire la penetrazione della sonda durante l&#39;ibridazione. La quantità di proteinasi K e la durata del trattamento dipende dal tessuto che si desidera esaminare e l&#39;età dell&#39;embrione. Tessuti più superficiali e più giovani embrioni richiedono K più breve e meno proteinasi, mentre i tessuti più profondi e più embrioni richiedono una maggiore concentrazione e un trattamento più lungo time al permeabilize pienamente l&#39;embrione per l&#39;ibridazione della sonda. Per esempio, per rilevare Shh nella endoderma dell&#39;intestino di fase 29 embrioni skate, 30 ug / ml di proteinasi K / PBT viene incubata per 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Rapidamente il risciacquo embrioni in PBT per lavare via proteinasi K. </li><li> Per disattivare proteinasi K, embrioni postfix con 4% PFA, 0,2% glutaraldeide in PBT per 20 minuti, delicatamente a dondolo. </li><li> Lavare due volte per 10 minuti con PBT. </li><li><ol class="lalpha"><li> Per la pre-ibridazione, aggiungere 2-3 ml di pre-riscaldato soluzione di ibridazione per gli embrioni, quanto basta per coprirli. Oscillare delicatamente in un bagno d&#39;acqua riscaldata a 70 ° C per 1 ora. </li><li> Per preparare la soluzione di ibridazione, preriscaldare RNA sonda a 70 ° C per 10 minuti e raffreddare in ghiaccio. Diluire 15-20 microlitri di RNA sonda a 2 ml di soluzione di ibridazione fresco preriscaldato, per ottenere una concentrazione finale di 0,5-1,0 mg / ml. Rimuovere pre-hybe e aggiungere diluito sonda RNA agli embrioni. Gli embrioni devono essere appena coperto da una soluzione, undd soluzione di ibridazione più se necessario. Coperchio a tenuta sicura di fiala di scintillazione. Ibridano agitando delicatamente in un bagno d&#39;acqua riscaldata a 70 ° C per una notte. </li></ol></li></ol> 4. Posta lavaggi di ibridazione e di ibridazione Anticorpo <ol><li> Rimuovere soluzione di ibridazione con sonda da embrioni e posto in una fiala di scintillazione fresco o provetta Eppendorf. La sonda può essere conservato a -20 ° C e riutilizzati in futuro. Per la post-ibridazione lavaggi, gli embrioni in un posto Netwell seduto in una piastra da 6 pozzetti di coltura. </li><li> Lavare 3 volte per 30 minuti in ciascuna delle pre-riscaldato Soluzione # 1, dondolo a 70 ° C. </li><li> Lavare 3 volte per 30 minuti in ciascuna pre-riscaldato Solution # 2, dondolo a 70 ° C. </li><li> Lavare 3 volte per 5 minuti ciascuno in TBST dondolo, a temperatura ambiente. </li><li> Pre-blocco con 10% di siero siero ovino in TBST per 1 ora, a temperatura ambiente dondolo. </li><li> Trasferimento embrioni da Netwell in una fiala di vetro fresco di scintillazione. Aggiungi anti-DIGFrammenti Fab (1:5.000) in 1% di siero siero ovino / TBST agli embrioni. Muovere la notte a 4 ° C. </li></ol> 5. Anticorpo ibridazione Messaggio lava <ol><li> Rimuovere l&#39;anticorpo e scartare. Embrioni posto nuovamente dentro Netwell per lavaggi. </li><li> Lavare 3 volte per 5 minuti in ciascuna delle TBST, dondolo a temperatura ambiente </li><li> Lavare almeno 6 volte per 1 ora ciascuno, dondolo a temperatura ambiente. </li><li> Lavare pernottamento in TBST, dondolo a 4 ° C. Mentre i lavaggi post-anticorpo aiuta a diminuire la colorazione di fondo, massimizzando il numero e la durata dei lavaggi è preferibile. Gli embrioni vengono regolarmente lavati in TBST a 4 ° C, durante il fine settimana. </li></ol> 6. Rilevamento di sonda <ol><li> Make up soluzione fresca NTMT e filtro sterilizzare. </li><li> Scartare la soluzione di lavaggio e gli embrioni TBST posto in un flaconcino di vetro pulito scintillazione. Lavare 3 volte in embrioni NTMT fresco per 10 min a temperatura ambiente, a dondolo. </li><li> Rimuovere NTMT lavare e aggiungere miscela di reazionedi 1 x NBT / 1 x BCIP in NTMT. Dal momento che questi reagenti sono sensibili luce, coprire fiala di scintillazione in un foglio e roccia a temperatura ambiente. </li><li> Monitorare la reazione colore ogni 15 min fino genica desiderata è chiaramente visibile. Sonde forti può prendere un minimo di 10 minuti per lo sviluppo. Sonde deboli può richiedere 1-2 ore. Non lasciare che la reazione andare troppo a lungo o la colorazione di fondo cominceranno a comparire (l&#39;embrione tutto inizia a girare un colore opaco viola o marrone). </li><li> Lavare 2 volte per 10 min in PBT a temperatura ambiente, a dondolo. </li><li> Embrioni postfix in paraformaldeide al 4%, 0,1% di glutaraldeide per 1 ora a temperatura ambiente. Gli embrioni possono essere a tempo indeterminato in negozio di fissativo a 4 ° C. </li><li> Visualizza embrioni con uno stereomicroscopio dissezione. Per produrre uno sfondo blu chiaro per le immagini, gli embrioni posto in un piatto con pre-temprato di agarosio all&#39;1% / PBS. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati per Mount I. RNA totale ibridazione in situ in elasmobranchi marine Mount RNA tutto in espressione in situ &#39;s raffigurante di Sonic hedgehog (Shh) e HOXA13 in embrioni da skate sono illustrati nella Figura 1. L&#39;espressione di Shh nei vertebrati superiori si trova nel endoderma notocorda e intestino, e questo pattern di espressione è conservato nel pattino (Figura 1a) 8,9. Elasmobranchi marini hanno un metodo unico di osmoregulation che utilizza la ghiandola rettale di sali secernono. HOXA13 espressione è elevata nella ghiandola sviluppo rettale (Figura 1b) 10. HOXA13 ruolo prodotto genico in patterning ghiandola rettale rimane sconosciuta. II. Paraffina Incorporamento e sezionamento del tessuto Elasmobranch 1. Raccolta e Preparazione del tessuto <ol><li> Dissect tessuto desiderato e fissare in formalina al 10% per 24-48 ore, dondolo a temperatura ambiente. 4% paraformaldeide (PFA) può anche essere utilizzato come fissativo(Vedi Discussione). </li><li> Lavare fissativo mediante lavaggio in PBS, 3 volte per 30 minuti ciascuno. A seconda delle dimensioni del tessuto, tempi di lavaggio può essere ridotto a 10 min o aumentata a 1 h. </li><li> Disidratare embrioni mediante lavaggio in una serie di etanolo 25%, 50% e 75% etanolo: rocking PBS a temperatura ambiente. Di nuovo, il tempo per ogni lavaggio dipende dalla dimensione del tessuto. Per 0,5 cm 3 tessuti, incubare ogni lavaggio per 15 min. Aumentare il tempo per i più grandi pezzi. Se la conservazione a lungo termine del tessuto è desiderato, lavare ulteriori due volte in 75% etanolo e conservare a -20 ° C fino ad un anno. In caso contrario, passare alla fase successiva. </li><li> Ulteriori disidratare mediante lavaggio 3 volte in etanolo al 100% per 15 minuti ciascuno, a dondolo. </li></ol> 2. Paraffina Incorporamento e sezionamento <ol><li> Chiarire con il lavaggio dei tessuti 2 volte in xilene per 5 minuti in ciascuna delle fiale di vetro con coperchio a scintillazione con tappo a vite. Xilene renderà il tessuto fragile, in modo da non superare un totale di 10 min per erahes. Il tessuto dovrebbe essere trasparente quando lo si tiene fino a una luce. Se il tessuto è ancora molto opachi dopo due lavaggi, fare un ulteriore lavaggio in xilene per 5 min e quindi procedere con protocollo. Maneggiare xilene all&#39;interno di una cappa di aspirazione con i guanti. </li><li> Rimuovere xilene e riempire la fiala di scintillazione in 2/3 con paraffina fusa. Incubare in un forno a 60 ° C per 30 min. Per la messa paraffina nel flaconcino, si noterà la paraffina solidifica lungo i lati della fiala. Porre la fiala in forno e consentire la paraffina di ri-sciogliere per qualche minuto. Prendere il flacone dal forno e dare la soluzione di un swirl resoconto di mescolare e sostituire in forno per la restante incubazione. </li><li> Paraffina Ripetere incubazioni altre due volte per 30 min. </li><li> Incubare in paraffina due volte per un&#39;ora ciascuno. Modifica paraffina per l&#39;ultima volta e incubare durante la notte nel forno a 60 ° C. </li><li> Il giorno seguente, posizionare il tessuto in una camera riscaldata bagno di paraffina e posto sotto vuoto per 2-3 ore. Questo faciliterà l&#39;infiltrazione di paraffina nel tessuto ed eliminare eventuali bolle d&#39;aria. Per alcuni tipi di tessuto sottile, una fase di vuoto potrebbe non essere necessaria, ma è necessario che gli embrioni interi o del tratto digerente e altri organi con compartimenti luminali. </li><li> Dopo sottovuoto facilitato infiltrazione di tessuto, tessuto posto in uno stampo metallico con paraffina fusa, e raffreddare su una piastra di ghiaccio. Lasciare in ghiaccio oppure a 4 ° C per una notte prima di cercare di rimuovere il tessuto dallo stampo. Blocchi di paraffina di tessuto può essere conservata indefinitamente a 4 ° C. </li><li> Collocare un blocco di paraffina su un microtomo e tagliare 8 sezioni micron. Sezioni deve essere collocato in un bagno d&#39;acqua a 48 ° C, montato su vetro * vetrini Superfrost Plus. </li><li> Vetrini secco per una notte in un forno a 37 ° C. </li><li> Sezioni Conservare a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> III. Alcian Blu / Nuclear Fast Red Stain of Tissue Elasmobranch 1. Alcian Blu Colorare per mucine <ol><li> Luogo scorre con sezioni rivolti verso l&#39;alto su un vetrino più caldo. Melt per 45 min. </li><li> Luogo scivola in un portavetrini. Tutte le soluzioni conseguenti sono contenuti in vasche all&#39;interno di una cappa aspirante. Vetrini vengono lavati trasferendoli da una vasca con una soluzione ad un altro. Assicurarsi che i livelli di soluzione delle vasche riguarda le diapositive, i tessuti sui vetrini siano completamente immersi. Sciogliere paraffina mediante lavaggio diapositive 2 volte in xilene per 5 minuti ciascuno. </li><li> Lavare i vetrini due volte con etanolo al 100% per 1 min ciascuna. </li><li> Reidratare vetrini in una serie di etanolo (75%, 50%, 25% etanolo) lavaggio in ciascuna soluzione per 1 min. Lavare in dH 2 O per 1 min. </li><li> Colorare in soluzione Alcian blu, pH 2,5 per 15 min. </li><li> Sviluppare macchia mediante lavaggio in acqua corrente per 3 min. Immergere una volta in dH 2 O. </li><li> Di contrasto nucleare in soluzione rapida di contrasto rosso per 10 min. </li><li> Lavare in acqua corrente per 3 minuti e immergere in dH 2 O una volta. </li><li> Disidratatimonoidrato in una serie di etanolo (25%, 50%, 75%, 100%, 100%) per 20 tuffi ciascuno, o 1 min ciascuno. Lavare 2 volte in xilene per 5 minuti ciascuno. Montare con il mezzo di montaggio e DPX coprioggetti. Lasciare mezzo di montaggio a secco e indurire per 48 ore nella cappa prima di manipolare diapositive. </li></ol>

<ol>
	<li>Forester, R., Goldstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+osmoregulatory+role+of+amino+acids+and+urea+in+marine+elasmobranchs.">Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs.</a> Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).</li><li>Shuttleworth, T., Shuttleworth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physiology of elasmobranch fishes. , 171-194 (1988).</li><li>Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D., Somero, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+with+water+stress:+evolution+of+osmolyte+systems.">Living with water stress: evolution of osmolyte systems.</a> Science. 217, 1214-1222 (1982).</li><li>Ballatori, N., Villalobos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+molecular+and+cellular+basis+of+toxicity+using+comparative+models.">Defining the molecular and cellular basis of toxicity using comparative models.</a> Toxicl. Appl. Pharmacol. 183, 207-220 (2002).</li><li>Nieto, M. A., Patel, K., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+analysis+of+chick+embryos+in+whole+mount+and+tissue+sections.">In situ hybridization analysis of chick embryos in whole mount and tissue sections.</a> Methods Cell Biol. 51, 219-235 (1996).</li><li>Jass, J. R., Walsh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mucin+expression+in+the+gastrointestinal+tract:+a+review.">Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review.</a> J Cell Mol Med. 5, 327-351 (2001).</li><li>Ballard, W. W., Mellinger, J., Lechenault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+for+development+of+Scyliorhinus+canicula,+the+lesser+spotted+dogfish+(Chondrichthyes;+Scyliorhinidae).">A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae).</a> J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).</li><li>Echelard, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog,+a+member+of+a+family+of+putative+signaling+molecules,+is+implicated+in+the+regulation+of+CNS+polarity.">Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity.</a> Cell. 75, 1417-1430 (1993).</li><li>Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA.">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75, 1401-1416 (1993).</li><li>Theodosiou, N. A., Hall, D. A., Jowdry, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+acid+mucin+goblet+cell+distribution+and+Hox13+expression+patterns+in+the+developing+vertebrate+digestive+tract.">Comparison of acid mucin goblet cell distribution and Hox13 expression patterns in the developing vertebrate digestive tract.</a> J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 442-453 (2007).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+7.">Ch. 7.</a> Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1, 7.82 (2001).</li><li>Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamprey+type+II+collagen+and+Sox9+reveal+an+ancient+origin+of+the+vertebrate+collagenous+skeleton.">Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li><li>Theodosiou, N. A., Simeone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+rudimentary+colon+in+the+elasmobranch,+Leucoraja+erinacea.">Evidence of a rudimentary colon in the elasmobranch, Leucoraja erinacea.</a> Dev. Genes Evol. 222, 237-243 (2012).</li><li>Filipe, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucins+in+the+human+gastrointestinal+epithelium:+a+review.">Mucins in the human gastrointestinal epithelium: a review.</a> Invest. Cell Pathol. 2, 195-216 (1979).</li><li>Corfield, A. P., Wagner, S. A., Clamp, J. R., Kriaris, M. S., Hoskins, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin+degradation+in+the+human+colon:+production+of+sialidase,+sialate+O-acetylesterase,+N-acetylneuraminate+lyase,+arylesterase,+and+glycosulfatase+activities+by+strains+of+fecal+bacteria.">Mucin degradation in the human colon: production of sialidase, sialate O-acetylesterase, N-acetylneuraminate lyase, arylesterase, and glycosulfatase activities by strains of fecal bacteria.</a> Infect. Immun. 60, 3971-3978 (1992).</li><li>Reid, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+and+histological+progression+to+malignancy+in+Barrett's+esophagus:+prospective+endoscopic+surveillance+of+a+cohort.">Flow-cytometric and histological progression to malignancy in Barrett's esophagus: prospective endoscopic surveillance of a cohort.</a> Gastroenterology. 102, 1212-1219 (1992).</li><li>Mowry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+staining+of+pancreatic+beta-cell+granules.+Evolution+and+present+status.">Selective staining of pancreatic beta-cell granules. Evolution and present status.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 107, 464-468 (1983).</li><li>Roberts, D. J., Smith, D. M., Goff, D. J., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+signaling+during+the+regionalization+of+the+chick+gut.">Epithelial-mesenchymal signaling during the regionalization of the chick gut.</a> Development. 125, 2791-2801 (1998).</li></ol>

Non ho nulla da rivelare.

I protocolli presentati sono i metodi classici per monitorare l&#39;espressione genica e di individuare i tipi di cellule differenziate, ed è stato adattato per l&#39;uso in elasmobranchi marini. Ulteriori modifiche di questi protocolli possono essere necessarie per adattarsi alle diverse specie di elasmobranchi. Il problema più comune relativa montatura intera RNA in situ &#39;s è il rischio di contaminazione RNasi e quindi la degradazione della sonda RNA e messaggi endogeni. Du...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x transcription buffer</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11-465-384-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DIG-RNA labeling mix</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11-277-073-910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAse inhibitor</td>
 <td>Roche</td>
 <td>03-335-399-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNA polymerase - SP6</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-810-274-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNAseI, RNAse-free </td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-776-785-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Yeast RNA</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15401-029</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>EMD-Millipore</td>
 <td>220201</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>heparin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H4784</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEPC (diethyl pyrocarbonate)</td>
 <td>Research Organics</td>
 <td>2106D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Moria Perforated Spoon</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>10370-17</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Netwell inserts</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>64713-00</td>
 <td>Netwells for use in 6-well tissue culture dishes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well tissue culture plate</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass scintillation vials with screw-cap lids</td>
 <td>Weaton Science Products</td>
 <td>986540</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>formamide</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP227500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Proteinase K</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>59895 (AM2542)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NBT</td>
 <td></td>
 <td>11585029001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BCIP</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11585002001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrogen peroxide, 30%</td>
 <td>EMD</td>
 <td>HX0635-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sheep serum</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101301-478</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>glutaraldehyde</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G5882</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-109-541-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-DIG Fab Fragments</td>
 <td>Roche</td>
 <td>1137-6623</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>26323-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclear Fast Red</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>26078-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPX Mountant</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>13510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraffin (Paraplast X-tra)</td>
 <td>McCormick Scientific</td>
 <td>39503002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% Formalin, NBF</td>
 <td>VWR</td>
 <td>95042-908</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass scintillation vials with screw-cap lids</td>
 <td>Weaton Science Products</td>
 <td>986540</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steal base molds</td>
 <td>Tissue-Tek</td>
 <td>4161-4165</td>
 <td>Multiple sizes available.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cassettes </td>
 <td>Tissue-Tek</td>
 <td>4170</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slide warmer</td>
 <td>Fisher-Scientific</td>
 <td>12-594Q</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue Embedder</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>EG1160</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microtome, rotary</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>RM2235</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue-Tek Slide Staining Set</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>62540-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue-Tek 24-Slide Holder</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>62543-06</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Superfrost*Plus slides</td>
 <td>Fisherbrand</td>
 <td>12-550-17</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

rna in situ hybridization in whole mount embryos and cell histology adapted for marine elasmobranchs

Elasmobranchi Marine sono valutati modelli animali per studi biomedici e genomica in quanto sono i vertebrati più primitivi di avere l&#39;immunità adattativa e hanno meccanismi unici per osmoregolazione 1-3. Come le più primitive di vita ganasce-vertebrati con appendici appaiate, elasmobranchi sono un modello evolutivamente importante, soprattutto per gli studi in evoluzione e sviluppo. Elasmobranchi marini sono stati utilizzati anche per studiare tossicologia acquatica e fisiologia dello stress in relazione a 4 dei cambiamenti climatici. Pertanto, lo sviluppo e l&#39;adeguamento delle metodologie è necessario per agevolare ed estendere l&#39;uso di questi vertebrati primitivi a più discipline biologiche. Qui presento l&#39;adattamento di successo del monte RNA tutto ibridazione in situ e tecniche istologiche per lo studio dell&#39;espressione genica e cellulare in istologia elasmobranchi. Controllo dell&#39;espressione genica è uno strumento di sviluppo segno distintivo di biologists, ed è ampiamente utilizzato per studiare i processi di sviluppo 5. Mount RNA tutto ibridazione in situ permette la visualizzazione e la localizzazione di trascritti del gene specifici nei tessuti dell&#39;embrione in via di sviluppo. Il pattern di espressione del messaggio di un gene in grado di fornire indicazioni su ciò che i processi di sviluppo e le decisioni sul destino delle cellule un gene può controllare. Confrontando il pattern di espressione di un gene in differenti stadi di sviluppo, intuizione può essere ottenuto in quanto il ruolo di un gene cambia durante lo sviluppo. Mentre mount intero in situ &#39;s fornisce un mezzo per localizzare l&#39;espressione genica di tessuti, tecniche istologiche consentire l&#39;identificazione di tipi di cellule differenziate e tessuti. Macchie istologiche hanno funzioni diverse. Macchie generale sono utilizzati per evidenziare la morfologia cellulare, ad esempio ematossilina ed eosina generale per la colorazione dei nuclei e citoplasma, rispettivamente. Altre colorazioni può evidenziare cella specificatipi. Per esempio, il blu Alcian macchia riportati in questo documento è una macchia ampiamente utilizzato per identificare mucosaccharides cationico. Colorazione del tubo digerente con Alcian blue possibile identificare la distribuzione di cellule caliciformi che producono mucosaccharides. Le variazioni intervenute nel perimetro mucosaccharide su brevi peptidi distinguere le cellule caliciformi per funzione all&#39;interno del tubo digerente 6. Utilizzando mount intero RNA in situ metodi &#39;s istochimiche e contemporaneamente, decisioni destino cellulare può essere collegato al gene-specifico espressione. Anche se RNA in situ &#39;s e istochimica sono ampiamente utilizzati dai ricercatori, il loro adattamento e l&#39;uso in elasmobranchi marini hanno incontrato un successo limitato e varia. Qui presento i protocolli sviluppati per elasmobranchi e utilizzato su base regolare nel mio laboratorio. Sebbene ulteriore modifica delle RNA ibridazione in situ metodo &#39;s può essere necessaria per adattarsi a diverse specie, i protocolli descritti qui provide un punto di forza di partenza per i ricercatori che desiderano adattare l&#39;uso di elasmobranchi marini alle loro domande scientifiche.

Esempi di Alcian colorazione blu in diverse regioni del L. tratto digestivo erinacea sono mostrati nella Figura 2. Mucina acido contenente cellule globlet sono chiaramente visibili dal blu Alcian macchia tutto il tratto digestivo. La distribuzione di mucine acide differisce in diverse regioni del tratto digerente, riflettendo differenze nella funzione. Mucine acide sono scarsamente prodotta nell&#39;intestino spirale e cloaca, mentre una concentrazione di mucine acide vengono rilevati ...

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RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Grazie alla combinazione di metodi di montaggio RNA tutto<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; e istologia, l&#39;espressione genica può essere collegato con le decisioni destino delle cellule nell&#39;embrione in via di sviluppo. Questi metodi sono stati adattati per gli Elasmobranchi marine e facilitare l&#39;uso di questi animali come organismi modello per biomedico, tossicologia e studi comparativi.

RNA<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; in embrioni Mount interi e istologia Adattato per Elasmobranchi Marine

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

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Research

JoVE Journal

Biology

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

12.6K Views.  Union College. Grazie alla combinazione di metodi di montaggio RNA tutto In situ e istologia, l'espressione genica può essere collegato con le decisioni destino delle cellule nell'embrione in via di sviluppo. Questi metodi sono stati adattati per gli Elasmobranchi marine e facilitare l'uso di questi animali come organismi modello per biomedico, tossicologia e studi comparativi.

Video: RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

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Biologia

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Metodo per la colorazione intero anticorpi Monte a Chick

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish intero monte ad alta risoluzione doppia fluorescente In Situ Ibridazione

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Utilizzando il monte intero In situ Ibridazione a Link Biologia Molecolare e organismal

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Tutto il monte In Situ</emIbridazione> di E8.5 a E11.5 embrioni di topo

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Rilevamento di RNA virale per fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analisi di Single-cell trascrizione del gene per l&#39;RNA fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Tutta la Monte RNA fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; L&#39;ibridazione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta Risoluzione intero monte<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in embrioni di zebrafish per studiare l&#39;espressione genica e la funzione

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...