L'ibridazione in situ è una tecnica molto istruttiva per presentare modelli di espressione di mRNA e IncRNA di geni specifici nei tessuti. Il nostro scopo in questo articolo è quello di sviluppare un metodo sensibile per rilevare la localizzazione specifica dell'mRNA nel fluido coelomico di Sipunculus nudus, che è una risorsa di pesca cruciale. Abbiamo presentato i risultati rappresentativi ottenuti dai nostri esperimenti riusciti utilizzando questo metodo.
Si spera che il nostro metodo si applichi ad altre specie di Sipuncula per identificare i modelli di espressione dell'mRNA specifico e dell'IncRNA nel fluido coelomico. Fissare il Sipunculus nudus sulla tabella di dissezione. Apri il corpo del Sipunculus nudus con piccole forbici autoclavate.
Quindi raccogliere e trasferire il fluido coelomico con pipetta su vetrini al microscopio trattati con poli-D-lisina, spalmabili leggermente. Asciugare all'aria gli scivoli per un'ora a 37 gradi Celsius. Lavare gli scivoli con DEPC-PBS per tre volte, cinque minuti per lavaggio con delicata agitazione.
Scolare il PBS, aggiungere la soluzione proteicaa K sulle diapositive per cinque minuti a temperatura ambiente. Scolare la soluzione di proteinasi K. Aggiungere la soluzione PFA sulle diapositive per 20 minuti a temperatura ambiente.
Scolare la soluzione PFA. Lavare gli scivoli con DEPC-PBS per tre volte, cinque minuti per lavaggio con delicata agitazione. Scolate il PBS.
Aggiungere 50 microliter riboprobe. Aggiungere un coverslip. Mettere gli scivoli nella scatola bagnata e sigillare bene con pellicola di paraffina.
Ibridare durante la notte a 60 gradi Celsius. Immergere le diapositive nel tampone di lavaggio e lasciarle riposare fino a quando il coverslip scivola automaticamente. Lavare gli scivoli con il tampone di lavaggio preriscaldato per due volte a 65 gradi Celsius, 30 minuti per lavaggio con delicata agitazione.
Lavare gli scivoli con la soluzione SSC preriscaldata per due volte a 65 gradi Celsius, 30 minuti per lavaggio con delicata agitazione. Lavare gli scivoli con la soluzione MABT per due volte a temperatura ambiente. 30 minuti per lavaggio con delicata agitazione.
Scolare il MABT. Aggiungere il buffer di blocco. Incubare i vetrini a temperatura ambiente per tre o quattro ore.
Svuotare il buffer di blocco. Aggiungere l'anticorpo, incubare i vetrini a quattro gradi Celsius durante la notte. Scolare la soluzione anticorpale.
Lavare gli scivoli con la soluzione MABT per quattro volte, 25 minuti per lavaggio con delicata agitazione. Scolare il MABT. Aggiungere il tampone di fosfatasi alcalina per tre volte, cinque minuti per incubazione.
Rimuovere il tampone di fosfatasi alcalina. Aggiungere la soluzione di colorazione BCIP-NBT. Tenere le diapositive al buio.
Il tempo di colorazione varia da minuti a ore, anche durante la notte, il che dipende dall'intensità del segnale. Lo stato di colorazione deve essere controllato più frequentemente all'inizio della colorazione. Ad esempio, con un intervallo di diversi minuti e diverse ore al più tardi della colorazione.
Il tempo di controllo dovrebbe essere il più breve possibile per evitare l'introduzione di segnalazioni di fondo elevate a causa dell'esposizione alla luce. Vengono mostrati i segnali rappresentativi dell'ibridazione in situ. L'ibridazione in situ del liquido coelomico Sipunculus nudus con riboprobe anti-senso che prende di mira dmrt1 indica che la colorazione viola concentrata nelle cellule trophoblast degli spermatozeugmata, figura 2A e B.Sense riboprobe per dmrt1 non ha rilevato alcun segnale di ibridazione, figura 2C.
Dopo aver visto questo video, si avrebbe un'ottima comprensione di come visualizzare i modelli di espressione dell'mRNA target o dell'IncRNA nel fluido coelomico di Sipunculus nudus.
