Ringraziamo le nostre fonti di finanziamento Genome Canada e Québec Genoma, e Université de Montréal, nonché i finanziamenti dalla Fondazione canadese per l&#39;innovazione per il finanziamento nostro &#39;Synapse di malattia&#39; (S2D) del progetto.

1. Selezione di malattia che può essere causata da mutazioni de novo Una malattia che corrisponde ai seguenti criteri può andare bene con la mutazione de novo ipotesi: <ol><li> Il fitness riproduttiva è ridotta. </li><li> La frequenza della malattia è relativamente elevata e costante, nonostante le più diverse ambienti. </li><li> La malattia è associata con un&#39;età superiore paterna. </li><li> Il legame classica e studi di associazione non è riuscito a spiegare una frazione significativa della ereditarietà della malattia. </li><li> I dati di concordanza gemelli sostenere un modello ex novo. </li></ol> L&#39;analisi del rischio che una malattia comune in cui mutazioni de novo può in parte spiegare la base genetica è un primo passo fondamentale. 2. Selezione dei casi e campioni di DNA Selezione dei campioni necessari è fondamentale per il successo della identificazione di mutazioni de novo. Per massimizzare la possibilità di trovare mutazioni de novo, si raccomanda quanto segue: <ol><li> Selezionare i casi con età precoce di insorgenza, fenotipo grave, con genitori non affetti, anziani padri e senza storia famiglia allargata della malattia. </li><li> Scegli pazienti il ​​cui DNA disponibili sono sufficienti per condurre lo studio. Particolarmente critica è la disponibilità di DNA da una fonte cellula primaria che non è stato sottoposto a coltura (ad esempio il DNA del sangue o DNA della saliva), </li><li> La disponibilità di entrambi i genitori del DNA è fondamentale al fine di determinare lo stato di trasmissione mutazione (ereditato vs de novo). Disponibilità di ulteriori coorti interessate e controlli normali è necessario per gli studi di convalida genetici una volta geni candidati sono identificati. </li><li> Stimare la dimensione del campione sulla base del tasso mutazioni, la quantità di geni per essere sottoposti a screening e la stima della frazione di casi che possono derivare da una mutazione de novo. </li></ol> 3. Gene risequenziamento; due approcci principali <ol><li> Un elevato throughput di sequenziamento di bassa qualità Questo approccio si basa su approcci candidato geni. <ol><li> Selezione dei geni candidati (s) Selezionare i geni miglior candidato sulla base di un sistema di punteggio che si basa su 6 criteri principali. Poi calcolare il totale che corrispondeva alla somma di tutti i punti attribuiti utilizzando i sei criteri elencati nella Tabella 1. Vedi l&#39;esempio del nostro progetto in figura 1 selezionati e non selezionati distribuzione geni. <img src="/files/ftp_upload/2534/2534table1.jpg" alt="Tabella 1"/> Criteri Tabella 1. Utilizzati per la selezione gene candidato <img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Grafico mostra la distribuzione dei geni selezionati e non selezionati per il sequenziamento del nostro progetto. Abbiamo ottenuto una distribuzione di geni classificati in base alle proprietà candidato da geni ordinamento in base al loro valore di punteggio. Per esempio, SHANK3 e NRXN1 geni, due geni che abbiamo scoperto la mutazione de novo, avevano un punteggio rispettivamente di 7 e 6 (il massimo è 12). </li><li> Primer di progettazione utilizzando il software attraverso Primers3 Exonprimer. Solo codifica regione e giunzione giunzione devono essere coperti anche un extra di 50 coppie di basi su ogni lato della esone. </li><li> Ottimizzare le condizioni di PCR per la scelta di Taq, volume di reazione, ecc </li><li> Ottimizzare tutti i frammenti di PCR </li><li> Amplifica 5 ng di DNA genomico estratto da campioni di sangue secondo le procedure standard </li><li> Prima di inviare per il sequenziamento, hanno il controllo di qualità dei vostri prodotti PCR caricando un gel di agarosio al 2%. Selezionato in modo casuale campioni. </li><li> Sequenza i prodotti di PCR su un analizzatore di DNA su un filo. Un frammento è considerato sequenziato con successo se l&#39;analisi di oltre il 90% delle tracce è possibile. Questo è applicabile per uno screening su larga scala. </li><li> Varianti di rilevamento <ol><li> Utilizzare strumenti per la rilevazione e la genotipizzazione delle varianti genomiche come PolyPhred, Polyscan e Surveyor mutazione. Una combinazione di più di 2 strumenti di rilevazione è l&#39;ideale. Per esempio, PolyPhred v.5 e PolyPhred v.6 con le impostazioni predefinite non rilevano le stesse variazioni. V.3 Polyscan ha un più alto tasso di mutazione falsi positivi per SNP (96%) e meno per il indel (93%). PolyPhred v.6 non ha rilevato la maggioranza delle indel vero, ma hanno un tasso di falsi positivi mutazione (per indel) inferiore Polyscan complessivo v.3 (90%). Dobbiamo rimuovere l&#39;opzione di rilevamento SNPs per v.3 Polyscan e mantenere entrambi PolyPhred v.5 e PolyPhred v.6 per il rilevamento di variante. Geometra mutazione e Polyscan sono migliori per la rilevazione indel. Nota: l&#39;opzione di rilevamento SNP non dovrebbero essere applicate per l&#39;uso Polyscan. Solo l&#39;opzione &quot;Indel&quot; dovrebbe essere accesa. Polyscan generato a molti falsi positivi per la rilevazione di SNP. </li><li> Per ogni uniche varianti exonic romanzo rilevato, confermare manualmente reamplifying il frammento e resequteleconferenza del probando ed entrambi i genitori con primer reverse e l&#39;ora di eliminare qualsiasi artefatto tecnico. </li></ol></li></ol></li><li> Tutto exome sequenziamento Questo approccio è una sequenza ad alto rendimento mira la maggior parte delle regioni codificanti del genoma umano. Ora siamo attualmente usando questo nuovo approccio nel nostro laboratorio, accelerando l&#39;individuazione di geni candidati potenziali. <ol><li> Ordina &quot;SureSelect Umano Tutti Exon&quot; intese a promuovere l&#39;regione codificante di oltre 16.000 geni (50 MB del genoma) progettato da Agilent o qualsiasi altro prodotto simile da altri come Roche. Prima di ordinare il kit di cattura, le piattaforme di sequenziamento dovrebbe essere stabilire (Illumina vs solido). </li><li> La cattura secondo il protocollo Agilent </li><li> Sequenza del prodotto sul Vostro rispettivi disponibili piattaforma di nuova generazione </li><li> Rilevamento delle varianti dal sequenziamento tutto exome: Diversi strumenti bioinformatici per la rilevazione e la genotipizzazione delle varianti genomiche dalla prossima generazione della piattaforma di sequenziamento sono disponibili come BWA, Bfast, Bioscope che eseguirà l&#39;allineamento. Dopo di che strumenti aggiuntivi liberamente disponibili a valle (ad esempio strumenti SAM, Varscan, Annovar) sarebbero necessari per chiamare e annotare le varianti. Software commerciale che incorpora allineamento di sequenza e la chiamata variante e annotazioni sono disponibili anche come, NextGEN (Softgenetics), CLC Bio, e altri </li></ol></li></ol> 4. Varianti genomiche priorità Varianti individuate sono poi la priorità per il follow up in base alla loro probabilità di essere de novo e deleteri per la funzione delle proteine ​​e mRNA e / o la struttura. La variante di follow-up priorità per il rilevamento della variante de novo dovrebbe essere come segue: <ol><li> Variazioni unica (osservata una volta in un caso singolo) </li><li> Variazioni non presenti nei genitori </li><li> Proteina tronca varianti: una sciocchezza, indel porta a frameshift e mutazioni di splicing. </li><li> Variazione missenso e silenziosa previsto per essere funzionalmente dirompenti (ad esempio, influenzare lo splicing). Usa Polyphen, SIFT e PANTHER per effetto previsione funzionali sulla proteina. </li></ol> Se si utilizza il sequenziamento intero exome, la selezione di geni candidati può essere usato come una strategia di varianti priorità per ulteriori studi. 5. Convalida genetica <ol><li> Resequence l&#39;intero gene nei casi ulteriore paziente (per identificare altre mutazioni causali) e nei controlli. I campioni di controllo saranno utilizzati per valutare le frequenze alleliche di varianti priorità. Ogni gene contiene almeno due diverse mutazioni de novo deleterie (nonsense, splicing, mutazione, e previsto missenso dannose) si trovano in diversi pazienti (ma non nei campioni di controllo o banche dati pubbliche) dovrebbero essere altamente prioritario per gli studi di ulteriore validazione. Ciò include: 1) l&#39;analisi per un difetto di splicing potenziale in linee cellulari linfoblastoidi derivate dal paziente. Nella nostra esperienza, la maggior parte dei geni resa RT-PCR prodotti da linee cellulari linfoblastoidi, 2) indagare alterati livelli di espressione delle proteine ​​da parte quantitativa Western blot di estratti proteici dalle linee linfoblastoidi e 3) verificare ulteriormente la mutazione / gene a livello funzionale in animale (c elegans, Zebrafish) e modelli linea cellulare come precedentemente fatto dal nostro gruppo (es: 5,6). </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: A seguito di questo protocollo, siamo stati in grado di identificare nuovi geni per la schizofrenia e l&#39;autismo. Un esempio è la recente scoperta del gene SHANK3 (Figura 2). Due diverse mutazioni de novo in SHANK3 gene, una mutazione nonsense trovati in tre fratello affetto e una mutazione missense in una femmina affetta. <img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. (A) segregazione della mutazione nonsense R1117X in tre fratelli affetti di famiglia PED 419. Il probando è indicato dalla freccia. (B) segregazione della mutazione missense R536W nel probando, ma non lei non colpite fratello in PED 56.

<ol>
	<li>Bassett, A. S., Bury, A., Hodgkinson, K. A., Honer, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+fitness+in+familial+schizophrenia.">Reproductive fitness in familial schizophrenia.</a> Schizophr Res. 21, 151-160 (1996).</li><li>Jablensky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizophrenia:+manifestations,+incidence+and+course+in+different+cultures.+A+World+Health+Organization+ten-country+study.">Schizophrenia: manifestations, incidence and course in different cultures. A World Health Organization ten-country study.</a> Psychol Med Monogr. , 1-97 (1992).</li><li>Malaspina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizophrenia+risk+and+paternal+age:+a+potential+role+for+de+novo+mutations+in+schizophrenia+vulnerability+genes.">Schizophrenia risk and paternal age: a potential role for de novo mutations in schizophrenia vulnerability genes.</a> CNS Spectr. 7, 26-29 (2002).</li><li>DeLisi, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+scan+for+linkage+to+chromosomal+regions+in+382+sibling+pairs+with+schizophrenia+or+schizoaffective+disorder.">A genome-wide scan for linkage to chromosomal regions in 382 sibling pairs with schizophrenia or schizoaffective disorder.</a> Am J Psychiatry. 159, 803-812 (2002).</li><li>Gauthier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+SHANK3+Mutations+in+Patients+Ascertained+for+Schizophrenia.">De Novo SHANK3 Mutations in Patients Ascertained for Schizophrenia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).</li><li>Piton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+calcium-related+gene+IL1RAPL1+are+associated+with+autism.">Mutations in the calcium-related gene IL1RAPL1 are associated with autism.</a> Hum Mol Genet. 17, 3965-3974 (2008).</li><li>Krawczak, M., Ball, E. V., Cooper, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neighboring-nucleotide+effects+on+the+rates+of+germ-line+single-base-pair+substitution+in+human+genes.">Neighboring-nucleotide effects on the rates of germ-line single-base-pair substitution in human genes.</a> Am J Hum Genet. 63, 474-488 (1998).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La procedura descritta qui si propone di individuare specifiche malattie comuni che probabile risultato, in parte, da mutazioni de novo, e per dimostrare questa ipotesi. Mutazioni de novo sono un meccanismo ben definito per lo sviluppo di una serie di malattie, per esempio il cancro sindromi ereditarie, ma è stato poco esplorato in malattie comuni. Questo in parte la conseguenza le sfide tecniche coinvolte nella identificazione di mutazioni de novo, che richiede il sequenziamento di grandi quantità di DNA, che ha solo molto recentemente diventato conveniente con l&#39;avvento di sequenziamento di nuova generazione. Inoltre, il tasso di mutazione de novo negli esseri umani è stato, fino a poco tempo fa, solo una stima. Solo molto recentemente ci sono stati rapporti direttamente determinare il tasso di mutazione negli esseri umani. Prima di queste misure, era difficile prevedere la dimensione del campione necessaria per questo tipo di studio e di determinare se la mutazione osservata de novo tasso è superiore al tasso di base. Sequenziamento geni candidati contro il genoma? Poiché la maggior parte delle mutazioni malattia riportati sono missenso / mutazioni nonsenso e sono mutazioni sito di splice (secondo il sito web HGMD) la nostra strategia di screening dovrebbe identificare oltre il 68% delle mutazioni note. Vi è anche una chiara relazione tra la gravità della sostituzione di aminoacidi e la probabilità di un fenotipo clinico. Rispetto ad una sostituzione conservativa aminoacido, un cambiamento senza senso è 9,0 volte più probabilità di presentare clinicamente 7. Così, in questo momento geni candidati sequenziamento è la strategia più conveniente. Il successo della procedura descritta dipende da diversi passaggi critici, che sono descritte in dettaglio e illustrata con due esempi, l&#39;autismo e la schizofrenia. Ci sono molti trabocchetti che devono essere evitati, come ad esempio che la malattia di scegliere, che i pazienti a schermo, fonte di DNA, e dettagli su come identificare in modo efficace le mutazioni de novo. Forniamo un metodo più efficiente per la determinazione della frazione di casi di una malattia che deriva da tali mutazioni spontanee.

a strategy to identify de novo mutations in common disorders such as autism and schizophrenia

Ci sono diverse linee di prove a sostegno del ruolo delle mutazioni de novo come un meccanismo per malattie comuni, come l&#39;autismo e la schizofrenia. In primo luogo, il tasso di mutazione de novo negli esseri umani è relativamente alto, in modo da nuove mutazioni sono generati ad una frequenza elevata nella popolazione. Tuttavia, mutazioni de novo, non sono state riportate nella maggior parte delle malattie comuni. Le mutazioni nei geni che porta a malattie gravi dove vi è una forte selezione negativa contro il fenotipo, come ad esempio letalità embrionale o nelle fasi ridotta capacità riproduttiva, non saranno trasmessi a più membri della famiglia, e quindi non verranno rilevati dalla mappatura genetica linkage o associazione studi. L&#39;osservazione di concordanza molto elevata nei gemelli monozigoti e concordanza molto basso in gemelli dizigoti inoltre sostiene con forza l&#39;ipotesi che una frazione significativa di casi possono derivare da nuove mutazioni. Tale è il caso di malattie come l&#39;autismo e la schizofrenia. In secondo luogo, nonostante la riduzione di fitness riproduttiva 1 e fattori ambientali estremamente variabili, l&#39;incidenza di alcune malattie è mantenuta in tutto il mondo ad un tasso relativamente alto e costante. Questo è il caso per l&#39;autismo e la schizofrenia, con un&#39;incidenza di circa l&#39;1% in tutto il mondo. Carico mutazionale può essere pensato come un equilibrio tra scelta a favore o contro una mutazione deleteria e la sua produzione da mutazione de novo. Abbassare i tassi di riproduzione costituiscono un fattore negativo di selezione che dovrebbe ridurre il numero degli alleli mutanti nella popolazione, in ultima analisi porta alla prevalenza della malattia è diminuita. Queste pressioni selettive tendono ad essere di diversa intensità in ambienti diversi. Tuttavia, questi disturbi mentali gravi sono stati mantenuti con una prevalenza costante relativamente alta nella popolazione di tutto il mondo attraverso una vasta gamma di culture e paesi, nonostante una forte selezione negativa contro di loro 2. Questo non è ciò che si potrebbe prevedere in malattie con ridotta capacità riproduttiva, a meno che non vi era un alto tasso di mutazione. Infine, gli effetti dell&#39;età paterna: vi è un aumento significativo del rischio della malattia con l&#39;aumento dell&#39;età paterna, che potrebbe derivare dalla crescita legate all&#39;età paterna a mutazioni de novo. Questo è il caso per l&#39;autismo e la schizofrenia 3. Il maschio-femmina rapporto tra tasso di mutazione è stimato in circa 4-6:1, presumibilmente a causa di un maggior numero di cellule germinali divisioni con l&#39;età nei maschi. Pertanto, si potrebbe prevedere che mutazioni de novo sarebbe più frequentemente vengono da maschi, soprattutto maschi più anziani 4. Un alto tasso di nuove mutazioni possono in parte spiegare perché studi genetici non sono ancora riusciti a identificare molti geni predisponenti alle malattie complessi di geni, come l&#39;autismo e la schizofrenia, e perché le malattie sono state identificate per solo il 3% dei geni nel genoma umano . Identificazione di mutazioni de novo come causa di una malattia che richiede un approccio mirato molecolare, che comprende i genitori lo studio e soggetti affetti. Il processo per determinare se la base genetica di una malattia può risultare in parte da mutazioni de novo e l&#39;approccio molecolare per stabilire questo collegamento saranno illustrate, con l&#39;autismo e la schizofrenia come esempi.

Watch this Scientific Journal Video about A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia at JoVE.com

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

Strategia di genetica molecolare per la ricerca di mutazioni de novo che causano malattie comuni come l&#39;autismo e la schizofrenia.

Una strategia per identificare le mutazioni de novo nei disturbi comuni come autismo e schizofrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

a-strategy-to-identify-de-novo-mutations-common-disorders-such-as

Research

JoVE Journal

Medicine

25.6K Views.  Universite de Montreal. Strategia di genetica molecolare per la ricerca di mutazioni de novo che causano malattie comuni come l'autismo e la schizofrenia.

Video: A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

Bilaterale occlusione comune Arteria carotide come uno stimolo precondizionamento in grado di indurre tolleranza ischemica precoce di focale Ischemia Cerebrale

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

Ricerca

Medicina

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for personalized medicine after stratification, explaining the current interest in developing a reproducible and low-cost xenotransplant model for this disease. The chick chorioallantoic membrane is a natural immunodeficient host capable of sustaining grafted tissues and cells without species-specific restrictions. In addition, it is easily accessed, manipulated and imaged using optical and fluorescence stereomicroscopy. Histology further allows detailed analysis of heterotypic cellular interactions.
This protocol describes in detail the in ovo grafting of the chorioallantoic membrane with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines (Saos-2 and SW1353). The chick survival rates are up to 75%. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior. For localized grafting of single cell suspensions, ECM gel provides significant advantages over inert containment materials. The Ki67 proliferation index is related to the distance of the cells from the surface of the CAM and the duration of application on the CAM, the latter determining a time frame for the addition of therapeutic products.

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

The in ovo chorioallantoic membrane (CAM) is grafted with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior.

Gli<em&gt; In ovo</em&gt; CAM-saggio come Xenograftmodel per Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties of the smooth muscle as well as changes induced by pathology. This method provides critical information for understanding bladder function while overcoming major methodological difficulties encountered in in vivo experiments, such as surgical and pharmacological manipulations that affect stability and survival of the preparations, the use of human tissue, and/or the use of expensive chemicals. It also provides a way to investigate the properties of each bladder component (i.e. smooth muscle, mucosa, nerves) in healthy and pathological conditions.
The urinary bladder is removed from an anesthetized animal, placed in Krebs solution and cut into strips. Strips are placed into a chamber filled with warm Krebs solution. One end is attached to an isometric tension transducer to measure contraction force, the other end is attached to a fixed rod. Tissue is stimulated by directly adding compounds to the bath or by electric field stimulation electrodes that activate nerves, similar to triggering bladder contractions in vivo. We demonstrate the use of this method to evaluate spontaneous smooth muscle contractility during development and after an experimental spinal cord injury, the nature of neurotransmission (transmitters and receptors involved), factors involved in modulation of smooth muscle activity, the role of individual bladder components, and species and organ differences in response to pharmacological agents. Additionally, it could be used for investigating intracellular pathways involved in contraction and/or relaxation of the smooth muscle, drug structure-activity relationships and evaluation of transmitter release.
The in vitro smooth muscle contractility method has been used extensively for over 50 years, and has provided data that significantly contributed to our understanding of bladder function as well as to pharmaceutical development of compounds currently used clinically for bladder management.

This manuscript presents a simple, yet powerful, in vitro method for evaluating smooth muscle contractility in response to pharmacological agents or nerve stimulation. Main applications are drug screening and understanding tissue physiology, pharmacology,&#160;and pathology.

Vescica muscolo liscio Striscia contrattilità come un metodo per valutare Lower Urinary Tract Farmacologia

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an important role in maintaining cardiovascular health. The retina is a tissue that lines the interior of the eye and it is the only tissue that allows for a non-invasive analysis of the microvasculature. Nowadays, high-quality fundus images can be acquired using digital cameras. Retinal images can be collected in 5 min or less, even without dilatation of the pupils. This unobtrusive and fast procedure for visualizing the microcirculation is attractive to apply in epidemiological studies and to monitor cardiovascular health from early age up to old age.
Systemic diseases that affect the circulation can result in progressive morphological changes in the retinal vasculature. For example, changes in the vessel calibers of retinal arteries and veins have been associated with hypertension, atherosclerosis, and increased risk of stroke and myocardial infarction. The vessel widths are derived using image analysis software and the width of the six largest arteries and veins are summarized in the Central Retinal Arteriolar Equivalent (CRAE) and the Central Retinal Venular Equivalent (CRVE). The latter features have been shown useful to study the impact of modifiable lifestyle and environmental cardiovascular disease risk factors.
The procedures to acquire fundus images and the analysis steps to obtain CRAE and CRVE are described. Coefficients of variation of repeated measures of CRAE and CRVE are less than 2% and within-rater reliability is very high. Using a panel study, the rapid response of the retinal vessel calibers to short-term changes in particulate air pollution, a known risk factor for cardiovascular mortality and morbidity, is reported. In conclusion, retinal imaging is proposed as a convenient and instrumental tool for epidemiological studies to study microvascular responses to cardiovascular disease risk factors.

Retinal image analysis is an unobtrusive procedure for visualizing the microcirculation. The impact of cardiovascular disease risk factors can result in changes of retinal vessel calibers. The procedures to acquire fundus images and the steps for calculating the vessel calibers are described.

Fundus Fotografia come un comodo strumento per studiare le risposte microvascolari a malattie cardiovascolari Fattori di rischio in studi epidemiologici

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

L&#39;immunoterapia sublinguale come alternativa di indurre una protezione contro le infezioni respiratorie acute

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

Utilizzando virus adeno-associati come strumento per studiare le barriere della retina nella malattia

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide new expandable sources of beta cells to alleviate the donor scarcity in human islet transplantation as therapy for diabetes. Although recent advances have been made towards this aim, mechanisms that regulate beta cell expansion and differentiation from a stem/progenitor cell remain to be characterized. Here, we describe a protocol for an injury model in the adult mouse pancreas that can function as a tool to study mechanisms of tissue remodeling and beta cell proliferation and differentiation. Partial duct ligation (PDL) is an experimentally induced injury of the rodent pancreas involving surgical ligation of the main pancreatic duct resulting in an obstruction of drainage of exocrine products out of the tail region of the pancreas. The inflicted damage induces acinar atrophy, immune cell infiltration and severe tissue remodeling. We have previously reported the activation of Neurogenin (Ngn) 3 expressing endogenous progenitor-like cells and an increase in beta cell proliferation after PDL. Therefore, PDL provides a basis to study signals involved in beta cell dynamics and the properties of an endocrine progenitor in adult pancreas. Since, it still remains largely unclear, which factors and pathways contribute to beta cell neogenesis and proliferation in PDL, a standardized protocol for PDL will allow for comparison across laboratories.

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

Lesioni chirurgica al pancreas mouse attraverso la legatura del Dotto pancreatico come un modello per Endocrine e Esocrine riprogrammazione e la proliferazione

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves focal endothelial-selective transgenesis, thereby allowing an investigator to determine the biological roles of endothelial-expressed transgenes and to quantify the in vivo transcriptional activity of DNA sequences in large artery endothelial cells. The method uses surgical isolation of rabbit common carotid arteries and an arteriotomy to deliver a transgene-expressing viral vector into the arterial lumen. A short incubation period of the vector in the lumen, with subsequent aspiration of the lumen contents, is sufficient to achieve efficient and durable expression of the transgene in the endothelium, with no detectable transduction or expression outside of the isolated arterial segment. The method allows assessment of the biological activities of transgene products both in normal arteries and in models of human vascular disease, while avoiding systemic effects that could be caused either by targeting gene delivery to other sites (e.g. the liver) or by the alternative approach of delivering genetic constructs to the endothelium by germ line transgenesis. Application of the method is limited by the need for a skilled surgeon and anesthetist, a well-equipped operating room, the costs of purchasing and housing rabbits, and the need for expertise in gene-transfer vector construction and use. Results obtained with this method include: transgene-related alterations in arterial structure, cellularity, extracellular matrix, or vasomotor function; increases or reductions in arterial inflammation; alterations in vascular cell apoptosis; and progression, retardation, or regression of diseases such as intimal hyperplasia or atherosclerosis. The method also allows measurement of the ability of native and synthetic DNA regulatory sequences to alter transgene expression in endothelial cells, providing results that include: levels of transgene mRNA, levels of transgene protein, and levels of transgene enzymatic activity.

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

This method is to introduce a transgene into the endothelium of rabbit carotid arteries. Introduction of the transgene allows the assessment of the biological role of the transgene product either in normal arteries or disease models. The method is also useful for measuring activity of DNA regulatory sequences.

In Vivo Trasferimento del gene per l'endotelio dell'arteria carotica comune di coniglio

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

An Experimental Model of Diet-Induced Metabolic Syndrome in Rabbit: Methodological Considerations, Development, and Assessment

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased prevalence due to the rise of sedentary lifestyles and unhealthy eating habits. Thanks to animal models, basic research can investigate the mechanisms underlying pathological processes such as MetS. Here, we describe the methods used to develop an experimental rabbit model of diet-induced MetS and its assessment. After a period of acclimation, animals are fed a high-fat (10% hydrogenated coconut oil and 5% lard), high-sucrose (15% sucrose dissolved in water) diet for 28 weeks. During this period, several experimental procedures were performed to evaluate the different components of MetS: morphological and blood pressure measurements, glucose tolerance determination, and the analysis of several plasma markers. At the end of the experimental period, animals developed central obesity, mild hypertension, pre-diabetes, and dyslipidemia with low HDL, high LDL, and an increase of triglyceride (TG) levels, thus reproducing the main components of human MetS. This chronic model allows new perspectives for understanding the underlying mechanisms in the progression of the disease, the detection of preclinical and clinical markers that allow the identification of patients at risk, or even the testing of new therapeutic approaches for the treatment of this complex pathology.

We describe methods to develop an experimental model of diet-induced metabolic syndrome (MetS) in rabbits using a high-fat, high-sucrose diet. Animals developed central obesity, mild hypertension, pre-diabetes, and dyslipidemia, thus reproducing the main components of human MetS. This chronic model will allow acquisition of knowledge underlying mechanisms of disease progression.

Un modello sperimentale di sindrome metabolica indotta da dieta in coniglio: considerazioni metodologiche, sviluppo e valutazione

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased ...

A Rabbit Model of Durable Transgene Expression in Jugular Vein to Common Carotid Artery Interposition Grafts

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, intimal hyperplasia, and atherosclerosis. The goal of this article is to demonstrate a method for placing bilateral venous interposition grafts in a rabbit, then transducing the grafts with a gene transfer vector that achieves durable transgene expression. The method allows the investigation of the biological roles of genes and their protein products in normal vein graft homeostasis. It also allows the testing of transgenes for the activities that could prevent vein graft failure, e.g., whether the expression of a transgene prevents the neointimal growth, reduces the vascular inflammation, or reduces atherosclerosis in rabbits fed with a high-fat diet. During an initial survival surgery, the segments of right and left external jugular vein are excised and placed bilaterally as reversed end-to-side common carotid artery interposition grafts. During a second survival surgery, performed 28 days later, each of the grafts is isolated from the circulation with vascular clips and the lumens are filled (via an arteriotomy) with a solution containing a helper-dependent adenoviral (HDAd) vector. After a 20-min incubation, the vector solution is aspirated, the arteriotomy is repaired, and flow is restored. The veins are harvested at time points dictated by individual experimental protocols. The 28-day delay between the graft placement and the transduction is necessary to ensure the adaptation of the vein graft to the arterial circulation. This adaptation avoids rapid loss of transgene expression that occurs in vein grafts transduced before or immediately after grafting. The method is unique in its ability to achieve durable, stable transgene expression in grafted veins. Compared to other large animal vein graft models, rabbits have advantages of low cost and easy handling. Compared to rodent vein graft models, rabbits have larger and easier-to-manipulate blood vessels that provide abundant tissue for analysis.

This method describes the placement of interposition vein grafts in rabbits, the transduction of the grafts, and the achievement of durable transgene expression. This allows the investigation of physiological and pathological roles of transgenes and their protein products in grafted veins, and testing of gene therapies for vein graft disease.

Un modello del coniglio di espressione del Transgene durevole nella vena giugulare di innesti di interposizione dell'arteria carotica comune

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, ...