Le cellule della linea cellulare SW1353 condrosarcoma sono stati gentilmente forniti dal Prof. Dr. PCW Hogendoorn e il Prof. Dr. J. Bovée di Leida, Paesi Bassi. Ringraziamo J. Mestach e G. Wagemans per l&#39;eccellente supporto tecnico, e G. De Bruyne per il disegno professionale della panoramica del nostro protocollo.

Vedere la Figura 1 per una panoramica Materiale tumorale 1. Raccogliere ed elaborare campioni tumorali Per l&#39;uso del materiale del paziente, l&#39;approvazione del comitato etico è necessario, e il consenso informato deve essere ottenuto dal paziente. <ol><li> Raccolto materiale rappresentativo (minimo 1 cm 3) al momento dell&#39;intervento, sia una biopsia o una resezione di un sarcoma. Il corretto sito di biopsia è definita utilizzando dinamico contrasto per risonanza magnetica. </li><li> Posizionare immediatamente il materiale in un flacone sterile contenente DMEM supplementato con 1.000 U penicillina e 1 mg / ml di streptomicina. </li><li> Trasportare il flacone immediatamente (30 - 90 min) al laboratorio. </li></ol> Tutte le seguenti procedure sono eseguite sotto flusso laminare. <ol start="4"><li> Versare il contenuto della fiala in una piastra di Petri sterile. </li><li> Mettere il campione di tumore in piccole parti di al massimo 1 mm 3 utilizzando un bisturi sterile. Rimuovere tutte le parti calcificate in quanto tendono a mettere in pericolo l&#39;ulteriore elaborazione del tessuto. </li><li> Casualmente prendere 10 innesti tumorali per la domanda da CAM. </li></ol> 2. Preparazione delle derivate dal tumore sospensioni singola cella Durata approssimativa: 3 ore <ol><li> Pesare il tessuto rimanente del campione. </li><li> Mettere 2 - 4 g di tessuto in un tubo dissociatore, più di una valvola può essere richiesto per digerire tutto il tessuto tumorale residuo. </li><li> Per la digestione di 2 - 4 g di tessuto, aggiungere 2,5 ml di soluzione di collagenasi 2 (500 U / ml RPMI 1640) e 2,5 ml di soluzione di DNasi (22 KU / ml RPMI 1640). </li><li> Elaborare il tessuto secondo il protocollo h_tumor dissociatore. Questo comporta due cicli di incubazione a 37 ° C in incubatore CO 2 mentre il tubo viene agitato delicatamente per 30 min. </li><li> Filtrare la sospensione rimanente attraverso un colino cellula 150 pm. </li><li> Centrifugare il lisato a 1.000 rpm per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet in 10 ml di tampone di lisi degli eritrociti (ELB), consentendo 10 minuti di incubazione con sospensione regolare. </li></ol> Nota: tampone di lisi degli eritrociti è prodotto come segue: Aggiungere 0,037 g di EDTA, 0,99 g K 2 HPO 4, 8,29 g di NH 4 Cl a 1,000 ml di acqua, usare NaOH 10 N per regolare il pH a 7,3, filtro sotto pressione attraverso una 0,22 micron filtrare. Conservare a 4 ° C. <ol start="9"><li> Aggiungere 25 ml di terreno di coltura (DMEM supplementato con 10% siero fetale bovino, 100 U / ml di penicillina, e 100 pg / ml streptomicina) per arrestare la reazione. </li><li> Centrifugare la sospensione a 1000 rpm per 5 min. Il colore del pellet dovrebbe essere bianco ora. </li><li> Rimuovere il surnatante. </li><li> Aggiungere 5 ml di terreno al pellet. Filtrare la sospensione attraverso un colino cella 70 micron. </li><li> Contare il numero di cellule vive / ml mediante un contatore automatico cella. </li></ol> 3. CAncer Linee Cellulari SAOS2 cellule di osteosarcoma (numero ATCC: HTB-85) che esprimono maggiore proteina fluorescente verde sono state elettroporate da pEGFP-C1 vettoriale utilizzando la linea cellulare Nucleofector Kit V secondo il protocollo del produttore. Stabilire linee cellulari stabili, le cellule transfettate sono state selezionate in G418 (1 mg / ml) per 4 settimane in linea con le precedenti stabilita protocollo 20. Inoltre ordinamento è stato eseguito da fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS) secondo le istruzioni del produttore. Cellule dalla linea cellulare SW1353 condrosarcoma (numero ATCC: HTB-94) o sospensioni di cellule singole tumorali appena preparati sono etichettati utilizzando una membrana lipofilo fluorescente rossa macchia. <ol><li> Rimuovere le cellule dal pallone di coltura in modo classico utilizzando tripsina (0,5% peso / vol) di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA; 0,2% peso / vol) di soluzione. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare per 5 min a 1000 rpm. </li><li> Rimuovere il supernatant. </li><li> Aggiungere 1 ml di mezzo privo di siero e 5 microlitri DII (Vybrant Rosso) / 10 6 cellule. </li><li> Avvolgere la fiala in un foglio di alluminio e metterlo nel incubatore CO 2 per 10 min a 37 ° C. </li><li> Centrifugare nuovamente per 5 min a 1000 rpm e rimuovere il surnatante. </li></ol> Saggio membrana corioallantoidea 1. Uovo di incubazione <ol><li> Sono tenuti uova fecondate da un vivaio commerciale locale garantendo il 95% la fecondazione delle uova. </li><li> Uova fecondate possono essere conservati a temperatura ambiente fino a 10 giorni. </li></ol> Nota: prima di iniziare l&#39;incubazione, sporcizia, piume ed escrementi vengono accuratamente rimossi dai gusci d&#39;uovo meccanicamente da eliminare a secco con i tovaglioli di carta, che hanno una ruvida piuttosto che una struttura di superficie morbida. Pulendo le uova con il 70% di etanolo denaturato o altro reagente di pulizia riduce significativamente il tasso di sopravvivenza degli embrioni di pollo. <ol start="3"><li> Mettere le uova in incubator su un lato, che segna la superficie superiore. Il giorno in cui le uova sono messe in incubatrice è designato 0 giorno di sviluppo embrionale. </li><li> Impostare la temperatura di incubazione a 37,8 ° C, e l&#39;umidità al 47%. Assicurarsi che l&#39;opzione di rotazione automatica è disattivata. </li></ol> 2. Schiusa delle uova Durata: ± 60 min per 25 uova Il giorno di sviluppo 3, le uova sono aperti in flusso d&#39;aria laminare. Aprire le uova in ulteriori risultati inerenti allo sviluppo sui palchi dei danni al CAM, come la membrana tende ad attaccarsi al guscio. Una lampada a infrarossi viene utilizzata per mantenere le uova caldo durante la procedura. Per migliorare la sterilità, si consiglia l&#39;uso di guanti. <ol><li> Mettere l&#39;uovo nel portauovo, con il lato contrassegnato rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Abbassare il livello della CAM rimuovendo due ml di albumina attraverso un ago 18 G inserita sulla punta dell&#39;uovo. Se l&#39;ago è spuntato dopo perforazione diversigusci d&#39;uovo, sostituire l&#39;ago. Se no, troppa forza deve essere esercitata, con conseguente danno per il tuorlo d&#39;uovo o frattura del guscio. A volte, l&#39;ago è bloccato dal chalazae, una delle due bande a spirale sospendono il tuorlo in albume. Questo può essere risolto spingendo delicatamente lo stantuffo verso il basso fino a quando il blocco è stato risolto. Se tuorlo viene aspirato nella siringa, sostituire l&#39;ago e la siringa. A volte l&#39;embrione muore dopo questo evento. Se una quantità insufficiente di albume viene rimosso, il CAM sarà danneggiato quando il guscio viene rimosso. </li><li> Applicare una pellicola semipermeabile adesivo sul lato marcato superiore della calotta, per evitare la fuoriuscita di particelle shell sulla CAM durante il taglio la finestra. </li><li> Fare un foro di introduzione con un piccolo punteruolo alla superficie dell&#39;uovo. </li><li> Tagliare una finestra di 1 cm 2 nella shell, con un paio di forbici chirurgiche sterili appuntiti. </li><li> Cuore pulsante dell&#39;embrione e dei vasi comunicanti possono essere osservati al secolosuperficie e del tuorlo d&#39;uovo. Togliere le uova non fecondate o embrioni morti. Un aspetto interrotto dei vasi sanguigni che caratterizza gli embrioni morti. </li><li> Sigillare la finestra con un film adesivo semipermeabile. Non è necessario coprire il sito di puntura, salvo che il serbatoio ha incrinato durante l&#39;inserimento dell&#39;ago. </li></ol> 3. Procedura di inoculo Durata: ± 1 h ogni linea cellulare Il pulcino di sviluppo embrionale giorno 9, le uova vengono inoculati sotto flusso d&#39;aria laminare. Valutazione della cellula tumorale diffondendo la CAM richiede contenimento delle cellule ad una superficie limitata durante l&#39;inoculo. Matrigel è una matrice (ECM) gel extracellulare dal sarcoma di topo Engelbreth-Holm-Swarm frequentemente utilizzata in condizioni di coltura delle cellule sperimentali. Si tratta di un fluido quando raffreddato, ma a polimerizzazione attivato termicamente quando portato a 20 - 40 ° C, formando così un gel stabile. Durantegli esperimenti, Matrigel è conservato in una scatola contenente ghiaccio fondente. Nota: Noi insistiamo a non utilizzare lamelle forate. Abbiamo osservato l&#39;attaccamento e la crescita delle cellule tumorali innestate sul disco di plastica di polarizzazione in tal modo il potenziale di crescita delle cellule della membrana stessa. <ol><li> Risospendere il pellet cellulare in gel ECM raffreddato ad una concentrazione di 10 6 cellule/100 gel ECM microlitri. Conservare questa soluzione sulla fusione del ghiaccio. </li><li> Parte delle accise della membrana semipermeabile con un paio di sterile chirurgica sotto flusso d&#39;aria laminare. Se il film adesivo viene rimosso completamente, questo si tradurrà in una proporzione maggiore di morte embrionale causa della contaminazione. </li><li> Toccare destra CAM sotto la finestra guscio leggermente con una bacchetta di vetro sterile, al fine di rimuovere lo strato di cellule epiteliali. Toccando la CAM con una bacchetta di vetro sterile dimostra meno traumatico rispetto all&#39;utilizzo di un bisturi n ° 11, che richiede più praticità ed esperienza. Possono verificarsi piccole emorragie. </li><li> Adding materiale tumorale. </li><li> Per innesti tumorali: abbassare delicatamente un pezzo di tessuto sulla CAM con un paio di pinze sterili, senza schiacciarla. </li><li> Per la procedura di gel ECM: 4x Aggiungere 25 microlitri della cellula-ECM sospensione gel alla CAM, uno sopra l&#39;altro, permettendo al gel ECM per polimerizzare tra le applicazioni. In questo modo viene creata una placca aderente contenente le cellule tumorali. </li><li> Sigillare di nuovo la finestra di shell con un film adesivo semipermeabile. </li></ol> 4. Imaging e raccolta del CAM Durata: 2 ore per 25 uova Il pulcino di sviluppo embrionale giorno 16, le camme sono raccolti. Lavorare sotto flusso d&#39;aria laminare non è necessario. <ol><li> Ingrandire la finestra con un paio di forbici chirurgiche. Assicuratevi di non tagliare troppo basso, altrimenti la CAM sarà danneggiato, con conseguente sanguinamento dei vasi feriti. </li><li> Aggiungere 300 - 500 ml di PBS D con una pipetta sulla setta CAMione contenente il materiale inoculato. Se non si utilizzano sonde fluorescenti, formaldeide tamponato può essere utilizzato come tale rende la membrana rigida per facilitare il taglio della membrana. </li><li> Fare una fotografia della CAM nell&#39;uovo attraverso un microscopio a fluorescenza stereo, dotato di una fotocamera digitale a colori, utilizzando sia la GFP o il filtro DSR, e senza filtro. Per gli innesti tumorali, tutte le fotografie sono fatte senza filtri. L&#39;illuminazione dall&#39;alto da luci a LED è fortemente raccomandato durante fotografare (Figura 2). </li><li> Record di migrazione delle cellule tumorali per le cellule marcate. I confini dei tumori possono essere irregolari e sfilacciati. Cellule sparse possono essere presenti vicino ai confini del tumore. In alcuni esemplari, possono essere osservate file di cellule tumorali (Figura 3). </li><li> Tagliare la membrana con un paio di forbici sterili al confine sdraiato contro il guscio. </li><li> Posizionare il CAM raccolte in una capsula di Petri sterile pieno di PBS D o tamponata performaldeide. </li><li> Fare una fotografia sia del lato superiore e il lato inferiore della CAM, con e senza filtro. </li><li> Mettere la membrana in un contenitore etichettato con formaldeide tamponata per almeno 72 ore. </li><li> Incorpora la Cam in paraffina e li prepara per l&#39;esame istologico. Aver cura di tagliare gli innesti tumorali al centro del nodulo, assicurandosi che la superficie di taglio è parallelo al fondo della cassetta. Se non, l&#39;interazione tra la camma e l&#39;innesto del tumore non sarà visibile. La stessa strategia vale per le placche gel ECM: la superficie rivolta verso la lama di taglio deve essere perpendicolare alla placca. </li></ol> 5. Valutazione istologica Ematossilina-eosina e Ki-67 immunoistochimica sono state eseguite per ulteriori chiarimenti, se necessario. L&#39;immunoistochimica è stata eseguita su sezioni di tessuto incluse in paraffina fissati in formalina di 3,5 micron di spessore, utilizzando un Stainer presentazione automatica secondoalle istruzioni del produttore. È stato usato un anticorpo monoclonale di topo primario Ki-67 (clone MIB-1, diluizione 1/100). Indotta dal calore epitopo recupero è stata effettuata utilizzando cellule condizionata 1, e la visualizzazione è stato raggiunto con l&#39;universale DAB Detection Kit, secondo le istruzioni del produttore. Disidratazione delle sezioni di tessuto è stata effettuata utilizzando un Montavetrini automatizzato. Per il linee cellulari SW1353 SAOS2 e, il numero di Ki67-positive e negative Ki67-cellula nuclei/100 micron 2 sono stati contati in tre zone: una vicino al confine della CAM, uno vicino la superficie e una al centro di il gel placca ECM. Questa procedura è stata ripetuta per ogni slitta 6x Ki-67 tinto. L&#39;indice di proliferazione è stata determinata per ciascun vetrino dividendo il numero di cellule Ki67-positive per il numero totale di cellule contate. Necrosi è definito da una perdita di dispersione fine della cromatina nel nucleo della cellula, accompagnato da fading dei margini delle celle distinte. Per xenotrapianti, necrosi è segnato come completo, parziale (spesso in superficie), o assenti. Infiltrazione di cellule tumorali nella camma è definita dalla osservazione di cellule tumorali nel mesoderma della CAM, ed è segnato come presente o assente. Tre elementi sono segnati per comportamento host. Fibroblasto infiltrazione è definito come cellule allungate lasciando la CAM e invadendo l&#39;innesto del tumore / targa, ed è segnato come presente o assente. Vascolare ricrescita può osservare come la crescita interna di vasi proliferanti pulcino, caratterizzati dalla presenza di eritrociti nucleati pulcino.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Tempo di inoculazione e raccolto Temporizzare il giorno di inoculazione è stata effettuata utilizzando SAOS2 in ECM gel (36 CAM) e variava tra lo sviluppo embrionale giorno 5 e 10. Prima giornata di incubazione 9, il CAM non è stato sempre abbastanza grande per sostenere il gel ECM abbiamo applicato. Alla raccolta, le cellule tumorali a volte hanno dovuto essere recuperato dal CAM più profondo, e alcuni campioni di gel ECM giacevano sciolto nel albume o in CAM. N...

Sarcoma è un tumore raro del tessuto connettivo con un alto tasso di mortalità a causa di terapia resistenza 1,2. I progressi nella sopravvivenza del paziente è ostacolato dalla loro bassa incidenza annuale, la loro grande diversità, e il fatto che le cellule del sarcoma sono segnalati per essere difficile da coltura in vitro 3,4. L&#39;uso di cellule in coltura per la valutazione preclinica terapia ha rivelato che le nuove molecole, apparentemente attivi in vitro non sempre riflettono i risultati in ambito clinico. Inoltre, aberrazioni genomiche rivelati da array di espressione genica non sono sempre correlati alle caratteristiche di comportamento tumorali nel singolo paziente 5-7. Per cercare di risolvere questi problemi, la medicina personalizzata ha acquistato importanza, che si riflette in una maggiore ricerca di modelli di xenotrapianto 8-12. I test in vivo ha il vantaggio di riflettere la complessa interazione tra ccellule Ancer e dell&#39;ambiente tessuto ospite in tumori solidi, necessari per la proliferazione del cancro e l&#39;invasione 13. Attualmente si studia l&#39;uso del dosaggio a membrana Chorio-allantoideo (CAM-assay) come un modello di xenotrapianto riproducibile per sarcoma 14,15. Questo saggio è ampiamente usato per lo studio di angiogenesi tumorale 16,17. In letteratura, tuttavia, abbiamo trovato protocolli diversi per questo test, mentre altri studi hanno osservato una marcata differenza nella crescita o angiogenesi secondo diversi protocolli 18,19. In questo articolo analizziamo l&#39;effetto delle condizioni del CAM-dosaggio variabile sul comportamento delle cellule tumorali utilizzando innesti, sospensioni di cellule singole derivate da tumore e colture cellulari sarcoma affermati.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Line Nucleofector Kit V</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>VCA-1003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965-039</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11811031</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1270</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse primary monoclonal antibody Ki67</td>
			<td>Dako Denmark</td>
			<td>MIB-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>D76240</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20012019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBSD</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14040083</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peGFP-C1 vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22409-015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant cell-labeling DiI</td>
			<td>Lifetechnologies</td>
			<td>22885</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10227</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital color camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC 340 FX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Egg Incubator</td>
			<td>Auto Elex Co</td>
			<td>R-COM 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSAriaIII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs C-Tube</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-237</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>semipermeable adhesive film (Suprasorb F)</td>
			<td>Lohmann&amp;Rauscher</td>
			<td>20468</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereo fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205 FA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Film automated Coverslipper</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>6400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultraView Universal DAB Detection Kit</td>
			<td>Ventana Medical Systems Inc</td>
			<td>760-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ventana Automated Slide Stainer</td>
			<td>Ventana Medical Systems</td>
			<td>Benchmark XT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the in ovo cam-assay as a xenograft model for sarcoma

Sarcoma è una malattia molto rara, che è di natura eterogenea, tutte ostacolando lo sviluppo di nuove terapie. Pazienti sarcoma sono candidati ideali per la medicina personalizzata dopo stratificazione, che spiega l&#39;attuale interesse per lo sviluppo di un modello di xenotrapianto riproducibile e di basso costo per questa malattia. Il corioallantoidea membrana pulcino è un ospite immunodeficienti naturale in grado di sostenere i tessuti e le cellule innestate senza restrizioni specie-specifici. Inoltre, esso è facilmente accessibile, manipolato e ripreso con stereomicroscopia ottica e fluorescenza. Istologia permette ulteriori analisi dettagliata delle interazioni cellulari eterotipiche. Questo protocollo descrive in dettaglio l&#39;in ovo innesto della membrana corioallantoidea con sarcoma dei tessuti derivati ​​freschi del tumore, le loro sospensioni di cellule singole, e stabilite le linee cellulari del sarcoma permanenti e transitori fluorescente (Saos-2 e SW1353). La sopravvivenza ratto pulcinoes sono fino al 75%. Il modello è utilizzato per lo studio del trapianto (viabilità, indice di proliferazione Ki67, necrosi, infiltrazione) e host (fibroblasti infiltrazione, crescita interna vascolare) comportamento. Per localizzata innesto di sospensioni di cellule singole, ECM gel offre vantaggi significativi rispetto ai materiali di contenimento inerti. L&#39;indice di proliferazione Ki67 è legato alla distanza delle cellule dalla superficie della CAM e la durata della applicazione sul CAM, quest&#39;ultimo determina un intervallo di tempo per l&#39;aggiunta di prodotti terapeutici.

Valutazione della CAM Innesti tumorali diventano aderente al CAM (Figura 2A). Sospensioni di cellule singole a partire da materiali paziente spesso mostrano una, la placca leggermente rialzato secca (Figura 2D). Dopo l&#39;asportazione della CAM, contrassegnato raggrinzimento della membrana avviene (figure 2E e 2F). Per le linee cellulari commerciali la placca diventa più opaco nel tempo, indicando...

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The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Gli<em&gt; In ovo</em&gt; Corioallantoidea membrana (CAM) si innesta con tessuti freschi sarcoma di derivazione tumorale, le sospensioni di cellule singole, e stabilite le linee cellulari del sarcoma fluorescente permanenti e transitori. Il modello è utilizzato per lo studio del trapianto (viabilità, indice di proliferazione Ki67, necrosi, infiltrazione) e host (fibroblasti infiltrazione, crescita interna vascolare) comportamento.

Gli<em&gt; In ovo</em&gt; CAM-saggio come Xenograftmodel per Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

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The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

25.3K Views.  Ghent University Hospital. Gli In ovo Corioallantoidea membrana (CAM) si innesta con tessuti freschi sarcoma di derivazione tumorale, le sospensioni di cellule singole, e stabilite le linee cellulari del sarcoma fluorescente permanenti e transitori. Il modello è utilizzato per lo studio del trapianto (viabilità, indice di proliferazione Ki67, necrosi, infiltrazione) e host (fibroblasti infiltrazione, crescita interna vascolare) comportamento.

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A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, the de novo mutation rate in humans is relatively high, so new mutations are generated at a high frequency in the population. However, de novo mutations have not been reported in most common diseases. Mutations in genes leading to severe diseases where there is a strong negative selection against the phenotype, such as lethality in embryonic stages or reduced reproductive fitness, will not be transmitted to multiple family members, and therefore will not be detected by linkage gene mapping or association studies. The observation of very high concordance in monozygotic twins and very low concordance in dizygotic twins also strongly supports the hypothesis that a significant fraction of cases may result from new mutations. Such is the case for diseases such as autism and schizophrenia. Second, despite reduced reproductive fitness1 and extremely variable environmental factors, the incidence of some diseases is maintained worldwide at a relatively high and constant rate. This is the case for autism and schizophrenia, with an incidence of approximately 1% worldwide. Mutational load can be thought of as a balance between selection for or against a deleterious mutation and its production by de novo mutation. Lower rates of reproduction constitute a negative selection factor that should reduce the number of mutant alleles in the population, ultimately leading to decreased disease prevalence. These selective pressures tend to be of different intensity in different environments. Nonetheless, these severe mental disorders have been maintained at a constant relatively high prevalence in the worldwide population across a wide range of cultures and countries despite a strong negative selection against them2. This is not what one would predict in diseases with reduced reproductive fitness, unless there was a high new mutation rate. Finally, the effects of paternal age: there is a significantly increased risk of the disease with increasing paternal age, which could result from the age related increase in paternal de novo mutations. This is the case for autism and schizophrenia3. The male-to-female ratio of mutation rate is estimated at about 4&#x2013;6:1, presumably due to a higher number of germ-cell divisions with age in males. Therefore, one would predict that de novo mutations would more frequently come from males, particularly older males4. A high rate of new mutations may in part explain why genetic studies have so far failed to identify many genes predisposing to complexes diseases genes, such as autism and schizophrenia, and why diseases have been identified for a mere 3% of genes in the human genome. Identification for de novo mutations as a cause of a disease requires a targeted molecular approach, which includes studying parents and affected subjects. The process for determining if the genetic basis of a disease may result in part from de novo mutations and the molecular approach to establish this link will be illustrated, using autism and schizophrenia as examples.

Molecular genetic strategy for finding de novo mutations causing common disorders such as autism and schizophrenia.

Una strategia per identificare le mutazioni de novo nei disturbi comuni come autismo e schizofrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

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A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma (glioma) and medulloblastoma. The widely used stereotactic approach only allows for the injection of a single animal at a time, is labor intensive and requires highly specialized equipment. The guide screw method, initially developed by Lal et al.,1 was developed to eliminate cumbersome stereotactic procedures. We now describe a modified guide screw approach that is rapid and exceptionally safe; both of which are critical ethical considerations. Notably, our procedure now incorporates an infusion pump that allows up to 10 animals to be simultaneously injected with tumor cells.
To demonstrate the utility of this procedure, we established human U87MG glioma cells as intracranial xenografts in mice, which were then treated with AMG102; a fully human antibody directed to HGF/scatter factor currently undergoing clinical evaluation2-5. Systemic injection of AMG102 significantly prolonged the survival of all mice with intracranial U87MG xenografts and resulted in a number of complete cures. 
This study demonstrates that the guide screw method is an inexpensive, highly reproducible approach for establishing intracranial xenografts. Furthermore, it provides a relevant physiological model for validating novel therapeutic strategies for the treatment of brain cancers.

In order to evaluate novel therapeutic paradigms for the treatment of glioma, physiological relevant models are essential. We utilize an implantable guide screw procedure for establishment of intracranial xenograft models that is more rapid and safer than stereotactic approaches.

Un semplice metodo vite Guida per intracranica Studi dello xenotrapianto in topi

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Neuroendocrini umani cella linee tumorali come un modello tridimensionale per lo studio dei diritti dell&#39;uomo e terapia dei tumori neuroendocrini

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Eccitotossica stimolazione del cervello Microslices come<em&gt; In vitro</em&gt; Modello di Corsa

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Glutamate and Hypoxia as a Stress Model for the Isolated Perfused Vertebrate Retina

Neuroprotection has been a strong field of investigation in ophthalmological research in the past decades and affects diseases such as glaucoma, retinal vascular occlusion, retinal detachment, and diabetic retinopathy. It was the object of this study to introduce a standardized stress model for future preclinical therapeutic testing.
Bovine retinas were prepared and perfused with an oxygen saturated standard solution, and the ERG was recorded. After recording stable b-waves, hypoxia (pure N2) or glutamate stress (250 &#181;m glutamate) was exerted for 45 min. To investigate the effects on photoreceptor function alone, 1 mM aspartate was added to obtain a-waves. ERG-recovery was monitored for 75 min.
For hypoxia, a decrease in a-wave amplitude of 87.0% was noted (p &#60;0.01) after an exposition time of 45 min (decrease of 36.5% after the end of the washout p = 0.03). Additionally, an initial decrease in b-wave amplitudes of 87.23% was recorded, that reached statistical significance (p &#60;0.01, decrease of 25.5% at the end of the washout, p = 0.03).
For 250 &#181;m glutamate, an initial 7.8% reduction of a-wave amplitudes (p &#62;0.05) followed by a reduction of 1.9% (p &#62;0.05). A reduction of 83.7% of b-wave amplitudes (p &#60;0.01) was noted; after a washout of 75 min the reduction was 2.3% (p = 0.62). In this study, a standardized stress model is presented that may be useful to identify possible neuroprotective effects in the future.

With this study, we introduce a standardized stress model for the isolated superfused bovine retina for future preclinical therapeutic testing. The effect of either hypoxia (pure N2) or glutamate stress (250 &#181;M glutamate) on retinal function represented by a- and b-wave amplitudes was evaluated.

Glutammato e ipossia come modello di stress per l&#39;isolato perfuso vertebrati Retina

Neuroprotection has been a strong field of investigation in ophthalmological research in the past decades and affects diseases such as glaucoma, retinal ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and highly vascularized, making it an ideal system for tumor implantation. Furthermore, the CAM contains extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, collagen, integrin alpha(v)beta3, and MMP-2, making it an attractive model to study tumor invasion and metastasis. Scientists have long taken advantage of the physiology of the CAM by using it as a model of angiogenesis. More recently, the CAM assay has been modified to work as an in vivo xenograft model system for various cancers that bridges the gap between basic in vitro work and more complex animal cancer models. The CAM assay allows for the study of tumor growth, anti-tumor therapies, and pro-tumor molecular pathways in a biologically relevant system that is both cost- and time-effective. Here, we describe the development of CAM xenograft model of hepatocellular carcinoma (HCC) with embryonic survival rates of up to 93% and reliable tumor take leading to growth of three-dimensional, vascularized tumors.

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

Il<em&gt; In Ovo</em&gt; Chick corioallantoidea membrana (CAM) Saggio come un efficiente dello xenotrapianto Modello di carcinoma epatocellulare

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

Istituzione di un mieloma multiplo umano Xenograft modello nel pollo per studiare la crescita del tumore, invasione e l&#39;angiogenesi

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Oleic Acid-Injection in Pigs As a Model for Acute Respiratory Distress Syndrome

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit patients. Despite treatment advances over the last decades, ARDS patients still suffer mortality rates between 35 and 40%. There is still a need for further research to improve the outcome of patients suffering from ARDS. One problem is that no single animal model can mimic the complex pathomechanism of the acute respiratory distress syndrome, but several models exist to study different parts of it. Oleic acid injection (OAI)-induced lung injury is a well-established model for studying ventilation strategies, lung mechanics and ventilation/perfusion distribution in animals. OAI leads to severely impaired gas exchange, deterioration of lung mechanics and disruption of the alveolo-capillary barrier. The disadvantage of this model is the controversial mechanistic relevance of this model and the necessity for central venous access, which is challenging especially in smaller animal models. In summary, OAI-induced lung injury leads to reproducible results in small and large animals and hence represents a well-suited model for studying ARDS. Nevertheless, further research is necessary to find a model that mimics all parts of ARDS and lacks the problems associated with the different models existing today.

In this article, we present a protocol to induce acute lung injury in pigs by central-venous injection of oleic acid. This is an established animal model for studying the acute respiratory distress syndrome (ARDS).

Iniezione di acido oleico in maiali come modello per la sindrome da Distress respiratorio

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Misurazione di contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica Mouse con filo Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to injury. In fact, the most common type of eye injury found in clinic is a corneal abrasion. Here, we utilize an ocular burr to induce an abrasion resulting in removal of the corneal epithelium in vivo on anesthetized mice. This method allows for targeted and reproducible epithelial disruption, leaving other areas intact. In addition, we describe the visualization of the abraded epithelium with fluorescein staining and provide concrete advice on how to visualize the abraded cornea. Then, we follow the timeline of wound healing 0, 18, and 72 h after abrasion, until the wound is re-epithelialized. The epithelial abrasion model of corneal injury is ideal for studies on epithelial cell proliferation, migration and re-epithelialization of the corneal layers. However, this method is not optimal to study stromal activation during wound healing, because the ocular burr does not penetrate to the stromal cell layers. This method is also suitable for clinical applications, for example, pre-clinical test of drug effectiveness.

This protocol describes a method to inflict an abrasion to the ocular surface of the mouse, and to follow the wound healing process thereafter. The protocol takes advantage of an ocular burr to partially remove the surface epithelium of the eye in anaesthetized mice.

Guarigione delle ferite di abrasione epiteliale corneale con oculare Burr come un modello per Cornea

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...