La dissezione retinica del topo è un processo davvero delicato a causa delle dimensioni e della forma degli occhi e della fragilità della sezione della retina. Imperativo da praticare, avere un protocollo dettagliato che fornisca metodi e suggerimenti efficienti è la chiave per la dissezione retinica e la sezione di alta qualità. Forniamo suggerimenti e consigli per aiutare il ricercatore a evitare insidie comuni e ottenere alcune sezioni retiniche di alta qualità adatte all'immunoistochimica.
Segnare la parte temporale dell'occhio di un topo eutanasiato usando un cauterizzatore di coda toccando la cornea molto leggermente e per non più di una frazione di secondo per bruciare leggermente la cornea ed evitare di fare un buco. Subito dopo usava le forcep Dumont 545 curve per enucleare gli occhi del topo. Mettere gli occhi in un criotubo da 1,5 millilitri con un millilitro del 4%PFA e PBS e incubare per 15 minuti sul ghiaccio.
Quindi, trasferire gli occhi fissi utilizzando le forcep Dumont 545 curve in un piatto di dissezione modificato da 35 millimetri riempito con PBS e posto al microscopio sezionato. Utilizzare un microknife per fare una piccola incisione al segno di bruciatura perpendicolare e appena sopra il bordo limbo della cornea. Inserire forbici curve nell'incisione ed eseguire un taglio circonferenziale della cornea seguendo il limbo.
Quindi, usando sottili forcep Dumont 5, rimuovere la cornea, estrarre la lente e sollevarla delicatamente lontano dalla porzione posteriore dell'occhio. Il corpo vitreo verrà fuori con l'obiettivo e la retina sarà visibile come una superficie bianca che copre l'interno della coppa degli occhi posteriore. Lavare le coppe per gli occhi isolate due volte in un millilitro di PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.
Per crioprotettare le coppe per gli occhi, equilibratele nel 15% di saccarosio e PBS durante la notte a quattro gradi Celsius fino a quando non affondano. Quindi trasferire le coppe per gli occhi al 30% di saccarosio e PBS per due o tre ore fino a quando non affondano. Posizionare le coppe per gli occhi in OCT in crio-stampi da 10 per 10 millimetri per l'incorporamento.
Al microscopio sezionato, orientare l'occhio nel crio-muffa lungo il suo asse ventrale dorsale ruotando l'occhio fino a quando il segno di bruciatura è in cima. Il nervo ottico è uno a sinistra e la parte ritaglia dello stampo si affaccia a destra. Per congelare il tessuto retinale, immergere il criosta stampo per almeno cinque minuti in un bicchiere metallico contenente isopentane e quindi posizionare il becher in azoto liquido fino a un terzo dell'altezza del becher.
Rimuovere il blocco congelato, avvolgerlo in un foglio di alluminio e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Utilizzare una penna o una sharpie per contrassegnare il blocco bloccato per registrarne l'orientamento. Dopo aver regolato la temperatura del criostato tra meno 20 e meno 25 gradi Celsius, posizionare gli stampi contenenti le coppe oculari incorporate all'interno e consentire loro di equilibrare alla temperatura del criostato per un'ora.
Installare il blocco nel criostato con l'orientamento ventrale dorsale e iniziare a tagliare sezioni seriali spesse 10 micrometri. Posizionare con cura le sezioni retiniche su vetrini al microscopio annotati e numerati e quindi conservare in caselle di scorrimento a meno 20 gradi Celsius o meno 80 gradi Celsius fino a quando non sono pronti per l'immunosottenzione. Immunoistochimica con anticorpi contro la rodopsina, un marcatore fotorecettore, decarbossilasi dell'acido glutammico 65, marcatore cellulare di amacrina, glutammina sintetasi e marcatore cellulare muller, e calbindina, un marcatore cellulare orizzontale è stato eseguito su sezioni retiniche.
I risultati indicano che questo protocollo produce sezioni retiniche di alta qualità e ben conservate a differenza delle sezioni retiniche di scarsa qualità ottenute da un protocollo diverso. I segmenti interni ed esterni ricchi di rodopsina rimangono verticali e intatti con poca o nessuna separazione dall'sovrascrivere l'epitelio pigmentato retinico. Gli internaurioni, come le cellule di amacrina positiva gad65, rimangono adeguatamente stratificati all'interno dello strato nucleare interno e dello strato plexiforme interno.
Inoltre, le cellule di Muller rimangono ben conservate con soma correttamente allineato nei processi citoplasmatici che vanno dallo strato cellulare ganglio allo strato nucleare esterno. Inoltre, cellule orizzontali ben definite sono rilevabili allo strato nucleare interno e al bordo esterno dello strato di plexiforme. È importante contrassegnare la regione topper degli occhi e mantenere l'orientamento durante l'incorporamento.
Preparare sempre la paraformaldeide sotto il cofano con gli opportuni dispositivi di protezione individuale.
