Gli autori desiderano ringraziare i membri di Nogales laboratorio alla UC-Berkeley, contribuendo a stabilire i protocolli iniziali ed i membri di Wang laboratorio presso la Yale University nel loro aiuto per stabilire i protocolli pieno. Riconosciamo anche il personale di crio-EM struttura e High-Performance Center di calcolo a Yale School of Medicine per il loro sostegno. HW è una famiglia Smith affidatario.

<ol>
	<li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+reconstitution:+a+posteriori+assignment+of+projection+directions+for+3D+reconstruction.">Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction.</a> Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).</li><li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+from+random+and+nonrandom+tilt+series.">Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series.</a> J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).</li><li>Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+at+improved+resolution:+new+techniques+for+merging+and+orientation+refinement+in+3D+cryo-electron+microscopy+of+biological+particles.">The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles.</a> Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+image+classification+-+powerful+tools+in+modern+electron+microscopy.">Negative staining and image classification - powerful tools in modern electron microscopy.</a> Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+and+WEB:+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields.">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li><li>Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single+particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).</li><li>Heel, M. v. a. n., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).</li><li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN:+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions.">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li><li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).</li><li>Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+yeast+Rrp44+exosome+complex+suggests+routes+of+RNA+recruitment+for+3'+end+processing.">Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3' end processing.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).</li><li>Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+for+electron+microscopy+single-particle+analysis+using+Xmipp.">Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp.</a> Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).</li><li>Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+random+conical+tilt+and+orthogonal+tilt+data+collection+using+feature-based+correlation.">Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation.</a> J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo articolo vi presentiamo un protocollo dettagliato di preparazione del campione e la ricostruzione tridimensionale del complesso exosome tramite microscopia elettronica a colorazione negativa. Utilizzando questo metodo, abbiamo ottenuto la ricostruzione 3D utilizzando il metodo casuale conica tilt senza alcuna conoscenza della struttura. Metodo casuale inclinazione conica non richiede necessariamente un campione omogeneo, ma il passo successivo affinamento proiezione di corrispondenza avrebbe bisogno di un camp...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Polyvinyl Formal Resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Science</td>
<td>63450-15-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Uranyl Formate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Science</td>
<td>22451</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Superfrost Microscope Slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientist </td>
<td>4951F-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>400 mesh grid regular</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SPI Supplies</td>
<td>3040C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbon coater Auto 306</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Edwards</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tecnai-12 Electron Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FEI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glow Discharger</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BAL-TEC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sputter Coater SCD 005</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method

Singolo microscopia elettronica di particelle (EM) la ricostruzione è recentemente diventato uno strumento popolare per ottenere il tridimensionale (3D) struttura di complessi macromolecolari di grandi dimensioni. Rispetto alla cristallografia a raggi X, presenta alcuni vantaggi unici. In primo luogo, singola particella EM ricostruzione non ha bisogno di cristallizzare il campione, che è il collo di bottiglia in cristallografia a raggi X, soprattutto per i grandi complessi macromolecolari. In secondo luogo, non ha bisogno di grandi quantità di campioni di proteine. Rispetto ai milligrammi di proteine ​​necessarie per la cristallizzazione, singola particella ricostruzione EM deve solo alcuni micro-litri di soluzione proteica al nano-molare concentrazioni, utilizzando il metodo di colorazione negativa EM. Tuttavia, nonostante un paio di assemblee macromolecolari con simmetria alto, singola particella EM è limitata ad una risoluzione relativamente bassa (inferiore a 1 nm risoluzione) per molti esemplari specialmente quelli privi di simmetria. Questa tecnica è inoltre limitato dalle dimensioni delle molecole in fase di studio, cioè 100 kDa per i campioni negativamente colorati e 300 kDa per frozen-idratata esemplari in generale. Per un nuovo campione di struttura sconosciuta, si usano generalmente una soluzione di metalli pesanti di inserire le molecole di colorazione negativa. Il campione viene poi esaminato al microscopio elettronico a trasmissione di prendere due-dimensionali (2D) micrografie delle molecole. Idealmente, le molecole di proteine ​​hanno una struttura omogenea 3D, ma presentano diversi orientamenti nelle micrografie. Queste micrografie sono digitalizzati ed elaborati in computer come &quot;particelle singolo&quot;. Utilizzando bidimensionale allineamento e tecniche di classificazione, le molecole omogeneo le stesse idee sono raggruppati in classi. Loro medie potenziare il segnale di forme 2D della molecola. Dopo aver assegnato le particelle con il corretto orientamento relativo (angoli di Eulero), saremo in grado di ricostruire le immagini delle particelle 2D in un volume virtuale in 3D. Nella ricostruzione di singole particelle 3D, un passo essenziale è quello di assegnare correttamente il corretto orientamento di ogni singola particella. Ci sono diversi metodi per assegnare la visualizzazione per ogni particella, compresa la ricostituzione angolare 1 e casuale conica tilt (RCT) metodo 2. In questo protocollo, si descrive la nostra pratica a ottenere la ricostruzione 3D del complesso lievito exosome con colorazione negativa EM e RCT. Va notato che il nostro protocollo di microscopia elettronica e l&#39;elaborazione delle immagini segue il principio di base della RCT, ma non è l&#39;unico modo per eseguire il metodo. Abbiamo prima descritto come incorporare il campione in uno strato di uranile-formiato con uno spessore paragonabile alle dimensioni delle proteine, utilizzando una griglia di carbonio bucata coperta da uno strato continuo di pellicola sottile di carbonio. Poi il campione viene inserito in un microscopio elettronico a trasmissione per raccogliere Untilted (0-laurea) e inclinata (55 gradi) paia di micrografie che verranno utilizzati in seguito per l&#39;elaborazione e ottenere un primo modello 3D del exosome lievito. A tal fine, noi dobbiamo fare RCT e poi affinare il modello iniziale 3D utilizzando la proiezione di corrispondenza metodo raffinatezza 3.

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Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Questo articolo descrive un metodo standard per ottenere un modello tridimensionale (3D) ricostruzione delle macromolecole biologiche mediante microscopia elettronica a colorazione negativa (EM). In questo protocollo, viene spiegato come ottenere la struttura 3D del complesso exosome Saccharomyces cerevisiae a media risoluzione con il metodo casuale conica ricostruzione tilt (RCT).

Singola particella Microscopia Elettronica ricostruzione del complesso Exosome Utilizzo del metodo casuale Tilt conico

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

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JoVE Journal

Biology

23.4K Views.  Yale University. Questo articolo descrive un metodo standard per ottenere un modello tridimensionale (3D) ricostruzione delle macromolecole biologiche mediante microscopia elettronica a colorazione negativa (EM). In questo protocollo, viene spiegato come ottenere la struttura 3D del complesso exosome Saccharomyces cerevisiae a media risoluzione con il metodo casuale conica ricostruzione tilt (RCT).