Gli autori desiderano ringraziare Mayumi Sakuraba e Rebecca Foehring per l&#39;eccellente assistenza tecnica. Inoltre, vorremmo ringraziare Drs. Rodrigo Andrade per l&#39;assistenza nell&#39;attuazione della cultura organotipica fetta e protocolli di trasfezione biolistic e il Dr. Giovanna Nerbonne per averci fornito i costrutti di cDNA per la trasfezione. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH sovvenzione: NS044163 dal NINDS (a RCF).

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	<li>Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+the+5-hydroxytryptamine+2A+receptor-mediated+facilitation+of+synaptic+activity+in+prefrontal+cortex.">Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).</li><li>Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+neural+responses+in+cortical+organotypic+slices.">Timing of neural responses in cortical organotypic slices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).</li><li>Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+organization+and+development+of+slice+cultures+from+rat+visual+cortex.">Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex.</a> Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).</li><li>Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actions+of+Kv2.1+channels+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons.">Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons.</a> Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).</li><li>G&#228;hwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).</li><li>G&#228;hwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+of+neural+tissue.">Organotypic cultures of neural tissue.</a> Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).</li><li>G&#228;hwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li><li>G&#228;hwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Maintenance+of+Organotypic+Slice+Cultures+of+CNS+Tissue.">Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).</li><li>Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+biophysical+properties+of+Kv1+channels+in+supragranular+neocortical+pyramidal+neurones.">Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones.</a> J Physiol. 571, 371-389 (2006).</li><li>Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+Kv1+containing+channels+in+neocortical+pyramidal+neurons.">Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons.</a> J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).</li><li>Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kv2+subunits+underlie+slowly+inactivating+potassium+current+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons.">Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons.</a> J Physiol. 581, 941-960 (2007).</li><li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+chronic+stimulation+of+cortical+organotypic+cultures+using+implanted+electrodes.">A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes.</a> Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).</li><li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+plasticity+of+spontaneous+activity+and+Up+states+in+cortical+organotypic+slices.">Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices.</a> J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).</li><li>Malin, S. A., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+rectifier+K++currents,+IK,+are+encoded+by+Kv2+alpha-subunits+and+regulate+tonic+firing+in+mammalian+sympathetic+neurons.">Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons.</a> J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).</li><li>O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun:+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue.">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKCa+channels+mediate+the+medium+but+not+the+slow+calcium-activated+afterhyperpolarization+in+cortical+neurons.">SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons.</a> J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).</li><li>Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biolistic+transfection+of+neuronal+cultures+using+a+hand-held+gene+gun.">Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun.</a> Nat Proc. 1, 977-981 (2006).</li><li>Joshi, P., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+gun+transfection+of+hippocampal+neurons.">Gene gun transfection of hippocampal neurons.</a> J Vis Exp. , (2006).</li><li>Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo studiato i ruoli espressione e funzionale di canali del potassio voltaggio-dipendenti in neuroni piramidali da ratto neocorteccia (4, 9-11). A causa della mancanza di specifici agenti farmacologici per questi canali, usiamo un approccio genetico per manipolare l&#39;espressione canale (1,14,15,17-19). Utilizziamo una preparazione organotipica cultura (2,3; 5-8; 12,13,15-22). Modificata da un approccio di Stoppini et al (16), al fine di mantenere la morfologia cellulare e il modello laminare del...

Chirurgia / trasfezione / cultura: <ol><li> Cervello Slicer: Campden Vibroslice # MA572 Strumenti di precisione mondiale, Sarasota, FL, USA </li><li> Sistema Gun gene: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547) <ul><li> Include: pistola Gene, assemblaggio tubo flessibile con regolatore di elio, tubi stazione della preparazione (# 165-2418), siringa kit, tubi Tefzel, taglio tubi, ottimizzazione kit (# 165-2424), taglio tubi </li><li> Bio-Rad Elio Regolatore (# 165-2413) </li><li> materiali di consumo usa e getta per Helios da Bio-Rad: <ul><li> Microcarriers 1,6 micron oro: # 165-2264 </li><li> Tefzel Tubing: # 165-2441 </li></ul></li></ul></li><li> Incubatore: modello Forma Scientific # 3110 (Thermo-scientifiche: (866) 984-3766). </li></ol> Media: <ol><li> Siero di cavallo: Hyclone donatore equino SH # 30074. (Hyclone, 925 Sud Occidentale 1800, Logan, UT 84321) </li><li> HMEM (Minimal Essential Media più HBSS e HEPES, non glutammina: Lonza BioWhittaker catalogo # 12-137F): GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, opzione 1. </li><li> HBSS (GIBCO Hanks soluzione salina tamponata, # 24020-117): GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, opzione 1. </li><li> MEM (GIBCO terreno minimo indispensabile, # 12360-038), GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, opzione 1. </li><li> 250 ml Millipore 0,2 micron filtro: # SC6PU02RE </li><li> Pipette di plastica di trasferimento: Fisher # 13-711-20. </li><li> 50 mL Millipore steriflip 0,22 micron filtro (# SCGP00525) </li></ol> Elementi 6-8 ottenuto a partire da: Fisher Scientific, 1241 Ambasciatore Blvd., PO Box 14989, St. Louis, MO 63132. Registrazione: <ol><li> Pipetta di vetro: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 ottobre Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746 </li><li> Sutter P-87 estrattore orizzontale elettrodo: Strumento azienda Sutter, One Digital Drive, Novato, CA 94949 </li><li> Axon Instruments Multiclamp 700B amplificatore: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 </li><li> PClamp 10 software di acquisizione dati: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 </li><li> posizione lectrode è controllato con Sutter ROE manipolatori-200 e PC-200 controller: Instrument Company Sutter, One Digital Drive, Novato, CA 94949. </li><li> Microscopio: Olympus BX-50WI microscopio in posizione verticale con IR-DIC ottica </li><li> IR sensibile fotocamera OLY-150 (Olympus) o DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 del Nord Roeske Avenue, Michigan City, IN 46360). </li></ol>

whole cell recording from an organotypic slice preparation of neocortex

Abbiamo studiato i ruoli espressione e funzionale di canali del potassio voltaggio-dipendenti in neuroni piramidali dalla neocorteccia del ratto. A causa della mancanza di specifici agenti farmacologici per questi canali, abbiamo adottato un approccio genetico per manipolare l&#39;espressione dei canali. Noi usiamo una preparazione organotipica cultura (16) al fine di mantenere la morfologia cellulare e il modello laminare della corteccia. Noi di solito isolare acuta fette neocorticale a 8-10 giorni dopo la nascita e mantenere le fette in coltura per 3-7 giorni. Questo ci permette di studiare i neuroni ad un&#39;età simile a quella nel nostro lavoro con le fette acuta e riduce al minimo lo sviluppo delle connessioni eccitatorie esuberante nella fetta. Noi registriamo da visivamente identificati neuroni piramidali negli strati II / III o V con illuminazione ad infrarossi (IR) e l&#39;interferenza differenziale microscopia a contrasto (DIC) con il morsetto intera patch di cellule in corrente o tensione-clamp. Noi usiamo biolistic (pistola Gene) trasfezione di tipo selvaggio o del DNA mutante canale del potassio per manipolare l&#39;espressione dei canali per studiare la loro funzione. Le cellule trasfettate sono facilmente identificabili mediante microscopia in epifluorescenza dopo la co-trasfezione con cDNA per la proteina fluorescente verde (GFP). Confrontiamo le registrazioni delle cellule transfettate adiacenti, i neuroni untransfected nello stesso strato dalla stessa porzione.

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Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Questo è un protocollo di preparare e mantenere una preparazione neocorticale fetta di cultura organotipica allo scopo di effettuare registrazioni elettrica da neuroni piramidali.

Registrazione intera cella da un Preparazione Tagliare organotipica della neocorteccia

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

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JoVE Journal

Neuroscience

14.1K Views.  University of Tennessee Health Science Center. Questo è un protocollo di preparare e mantenere una preparazione neocorticale fetta di cultura organotipica allo scopo di effettuare registrazioni elettrica da neuroni piramidali.