Yazarlar, üstün teknik yardım için Mayumi Sakuraba ve Rebecca Foehring teşekkür etmek istiyorum. Buna ek olarak, Dr teşekkür etmek istiyorum. Rodrigo Andrade transfeksiyon için cDNA yapıları bize sağlamak için Organotipik dilim kültür ve Biyolistik transfeksiyon protokolleri ve Dr. Jeanne Nerbonne uygulanmasında yardım için. NS044163 NINDS (RCF): Bu çalışma NIH hibe tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+the+5-hydroxytryptamine+2A+receptor-mediated+facilitation+of+synaptic+activity+in+prefrontal+cortex.">Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).</li><li>Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+neural+responses+in+cortical+organotypic+slices.">Timing of neural responses in cortical organotypic slices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).</li><li>Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+organization+and+development+of+slice+cultures+from+rat+visual+cortex.">Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex.</a> Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).</li><li>Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actions+of+Kv2.1+channels+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons.">Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons.</a> Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).</li><li>G&#228;hwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).</li><li>G&#228;hwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+of+neural+tissue.">Organotypic cultures of neural tissue.</a> Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).</li><li>G&#228;hwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li><li>G&#228;hwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Maintenance+of+Organotypic+Slice+Cultures+of+CNS+Tissue.">Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).</li><li>Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+biophysical+properties+of+Kv1+channels+in+supragranular+neocortical+pyramidal+neurones.">Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones.</a> J Physiol. 571, 371-389 (2006).</li><li>Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+Kv1+containing+channels+in+neocortical+pyramidal+neurons.">Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons.</a> J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).</li><li>Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kv2+subunits+underlie+slowly+inactivating+potassium+current+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons.">Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons.</a> J Physiol. 581, 941-960 (2007).</li><li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+chronic+stimulation+of+cortical+organotypic+cultures+using+implanted+electrodes.">A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes.</a> Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).</li><li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+plasticity+of+spontaneous+activity+and+Up+states+in+cortical+organotypic+slices.">Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices.</a> J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).</li><li>Malin, S. A., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+rectifier+K++currents,+IK,+are+encoded+by+Kv2+alpha-subunits+and+regulate+tonic+firing+in+mammalian+sympathetic+neurons.">Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons.</a> J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).</li><li>O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun:+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue.">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKCa+channels+mediate+the+medium+but+not+the+slow+calcium-activated+afterhyperpolarization+in+cortical+neurons.">SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons.</a> J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).</li><li>Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+preprotachykinin+promoter+activity+in+single+cortical+neurons.">Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons.</a> J Neurochem. 75, 882-885 (2000).</li><li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture.">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biolistic+transfection+of+neuronal+cultures+using+a+hand-held+gene+gun.">Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun.</a> Nat Proc. 1, 977-981 (2006).</li><li>Joshi, P., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+gun+transfection+of+hippocampal+neurons.">Gene gun transfection of hippocampal neurons.</a> J Vis Exp. , (2006).</li><li>Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz sıçan neokorteks (4, 9-11) piramidal nöronlar voltaj bağımlı potasyum kanalları ifade ve işlevsel roller eğitim görüyor. Çünkü bu kanallar için özel farmakolojik ajanların eksikliği, kanal ifade (1,14,15,17-19) işlemek için genetik bir yaklaşım kullanır. Hücre morfolojisi ve korteks laminer düzenini korumak için Stoppini ve ark (16) yaklaşım değiştirilmiş. Organotipik kültür hazırlanması (12,13,15-22; 5-8 2,3) kullanır. Biz 6-17 postnatal gün akut neokortikal di...

Cerrahi / transfeksiyon / kültür: <ol><li> Beyin Dilimleme: Chipping Vibroslice # MA572 Dünya Hassas Aletler, Sarasota, FL, Amerika Birleşik Devletleri </li><li> Gene Silah Sistemi: Bio-Rad, Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Sürücü, Hercules, CA 94.547) <ul><li> Gen tabancası, regülatör, tüp hazırlık istasyonu (165-2418), şırınga kiti, Tefzel tüp, boru kesici, optimizasyon kiti (165-2424), boru kesici ile helyum hortum montaj dahil </li><li> Bio-Rad Helyum Regülatörü (165-2413) </li><li> tek kullanımlık malzemeler Bio-Rad Helios: <ul><li> 1.6 mikron altın Microcarriers: # 165-2264 </li><li> Tefzel Boru: # 165-2441 </li></ul></li></ul></li><li> Kuluçka: Forma Bilimsel model # 3110 (Termo-Bilimsel: (866) 984 - 3766). </li></ol> Medya: <ol><li> At Serum: Hyclone donör at # SH 30.074. (HyClone, 925 Batı 1800 Güney, Logan, UT 84.321) </li><li> HMEM (Minimal Essential Medya artı HBSS ve Hepes, glutamin: Lonza BioWhittaker Katalog # 12-137F): Gibco / Invitrogen, (800) 955 - 6288, 1. Seçenek. </li><li> HBSS (Gibco Hanks, # 24.020-117 tamponlu tuz): Gibco / Invitrogen, (800) 955 - 6288, Seçenek 1. </li><li> MEM (Gibco asgari temel, orta, 12.360-038), Gibco / Invitrogen, (800) 955 - 6288, Seçenek 1. </li><li> 250 ml Millipore 0.2 mikron filtre: # SC6PU02RE </li><li> Plastik Transfer pipet: Fisher # 13-711-20. </li><li> 50 ml Millipore steriflip 0.22 mikron filtre (# SCGP00525) </li></ol> Elde edilen: Fisher Scientific, 1241 Büyükelçisi Blvd, PO Box 14.989, St Louis, MO 63.132 Öğeler 6-8. Kayıt: <ol><li> Pipetleyin cam: Harvard GC150TF-10: 84 Ekim Hill Road, Holliston, Harvard Apparatus, Massachusetts 01.746 </li><li> Sutter P-87 yatay elektrot çektirmenin: Sutter Instrument Company, Bir Dijital Sürücü, Novato, CA 94.949 </li><li> Axon Instruments Multiclamp 700B amplifikatör: Moleküler Devices, Inc 1311 Orleans Sürücü, Sunnyvale, CA 94.089-1136 </li><li> Moleküler Devices, Inc, 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94.089-1136: 10 veri toplama yazılımı PClamp </li><li> Sutter Instrument Company, Bir Dijital Sürücü, Novato, CA 94.949 lectrode pozisyonu Sutter ROE-200 manipülatörler ve PC-200 denetleyici ile kontrol edilir. </li><li> Mikroskop: IR-DIC optik ile Olympus BX-50WI dik mikroskop </li><li> IR duyarlı kamera OLY-150 (Olympus) veya DAGE MTI (DAGE MTI, 46.360 IN 01 Kuzey Roeske Avenue, Michigan City). </li></ol>

whole cell recording from an organotypic slice preparation of neocortex

Biz sıçan neokorteks piramidal nöronlar gerilim-kapılı potasyum kanalları ifade ve işlevsel roller eğitim görüyor. Çünkü bu kanallar için özel farmakolojik ajanların eksikliği, kanal ifade işlemek için genetik bir yaklaşım almıştır. Biz hücre morfolojisi ve korteks laminer desen korumak için bir Organotipik kültür hazırlama (16) kullanın. Biz genellikle doğum sonrası gün 8-10 akut neokortikal dilim izole ve 3-7 gün boyunca kültür dilimleri korumak. Bu, bize benzer bir yaşta akut dilimleri ile çalışmalarımızı bu nöronların çalışma sağlar ve dilim coşkulu eksitatör bağlantılarının gelişimi en aza indirir. Biz akım veya voltaj-klemp tüm hücre yama kelepçe ile kızılötesi aydınlatma (IR) ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu (DIC) kullanarak katmanları II / III veya V görsel tespit piramidal nöronlar kaydı. Biz onların fonksiyonu çalışma kanalları ifade işlemek için yabani türü veya potasyum kanal DNA mutant Biyolistik (Gen tabancası) transfeksiyon kullanın. Transfekte hücreleri kolayca yeşil flüoresan protein (GFP) için cDNA ile birlikte transfeksiyon sonra Epifloresans mikroskobu ile tanımlanır. Biz transfekte hücreler bitişik, aynı dilim aynı katmanda untransfected nöronlar kayıtları karşılaştırın.

Watch this Scientific Journal Video about Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex at JoVE.com

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Bu piramidal nöronların elektriksel kayıtlar yapma amaçlı bir Organotipik kültür neokortikal dilim hazırlama hazırlamak ve sürdürmek için bir protokoldür.

Neokorteks bir Organotipik Dilim Hazırlık Tüm Hücre Kaydı

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

whole-cell-recording-from-an-organotypic-slice-preparation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K Görüntüleme.  University of Tennessee Health Science Center. Bu piramidal nöronların elektriksel kayıtlar yapma amaçlı bir Organotipik kültür neokortikal dilim hazırlama hazırlamak ve sürdürmek için bir protokoldür.