We would like to thank the members of the Montgomery and Madison labs for helpful discussion. We acknowledge the funding received from the following sources in this research: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC, and NIH.

Etica Animale Dichiarazione: I protocolli descritti in questo manoscritto seguono le linee guida per la cura degli animali, istituito dall&#39;Università di Auckland e la Stanford University. P7 ratti sono stati sacrificati da una rapida decapitazione. Dissezione ippocampale viene quindi eseguita immediatamente come descritto di seguito. 1 Organotipica ippocampale Fetta Cultura <ol><li> Preparazione <ol><li> Preparare dissezione Media (utilizzato solo per sezionare il cervello). Unire 200 ml Minimum Essential Medium, 2 ml di soluzione di penicillina-streptomicina (10.000 unità di ciascuno, nel 0,85% NaCl), 5 ml di soluzione tampone HEPES, 2 ml di soluzione 1 M Tris (pH 7,2), e filtro sterilizzare con 0,22 micron filtro . Effettuare dissezione ippocampale in media dissezione ghiacciata. </li><li> Raffreddare il medium dissezione. Posizionare il supporto di dissezione nel congelatore circa 1 ora prima di iniziare la dissezione fino a quando il liquido è molto freddo. Non permettere grandi cr ghiaccioystals per formare. Conservare in ghiaccio fino al momento. </li><li> Preparare terreno di coltura (usato per tutto tranne la dissezione di ippocampi). Unire 100 ml Minimum Essential Medium, (concentrazione 1x, liquido) w / sali di Hank, w / L-glutammina, 2 ml di soluzione di penicillina-streptomicina (liquido, 10.000 unità di ciascuno, nel 0,85% NaCl), 2,5 ml di HEPES 1 M tampone soluzione, 50 ml di soluzione salina bilanciata di Hank, 50 ml di siero di cavallo (definito, calore inattivato), e filtro sterilizzare con 0,22 micron filtro. </li><li> Preparare i piatti della cultura. Mettere 1 ml di coltura per 35 millimetri piatto di cultura, e aggiungere un inserto di membrana per ogni piatto. Mettere fino a sette di questi piatti in uno a 150 mm piastra di Petri (di seguito indicato come un &#39;piatto&#39;). Porre la piastra in un incubatore CO 2 per almeno un&#39;ora prima della dissezione inizia in modo che il terreno di coltura nei piatti raggiunge la giusta temperatura e pH. </li></ol></li><li> Dissezione del Hippocampi da Rat cuccioli a postnatale giorno 7 (P7) <ol><li> Pre-sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione sotto la luce UV prima della procedura. </li><li> Dopo una rapida decapitazione, rimuovere il cervello e il luogo in media refrigerate in un piatto, e poi rimuoverlo per un pezzo di carta da filtro inumidita per la dissezione. Tease la corteccia dal mesencefalo utilizzando smussate spatole in plastica rivestita lisce in miniatura, esponendo l&#39;ippocampo. Tagliare il fornice, e poi lavorare delicatamente la spatola sotto l&#39;ippocampo per capovolgere fuori (Figura 1A). NOTA: Riuscito culture fetta possono essere preparati utilizzando animali fino a P10. </li><li> Tagliare il ippocampo isolato dal resto del cervello. Trasferire il dell&#39;ippocampo in un nuovo piatto contenente i media dissezione refrigerata utilizzando un pennello morbido inumidito (ad esempio, bianco sable # 4). </li><li> Pulire la parte inferiore (cioè il lato piatto) dell&#39;ippocampo del plesso coroideo durante la dissezione, in quanto tali, tessuti meninge-come spugnosi rendono difficile separare ippocampaleFette una dall&#39;altra in seguito. NOTA: Lasciare questi tessuti in atto se non possono essere presi in giro dolcemente. </li><li> Eseguire l&#39;intero dissezione più rapidamente possibile senza danneggiare l&#39;ippocampo. NOTA: Un attento dissezione è più importante di un veloce, a patto che le condizioni sperimentali sono refrigerati. Affettare il ippocampi da tre ratti contemporaneamente. La salute fetta non è influenzata purché il tempo totale dall&#39;inizio a quando le fette placcati vanno in incubatore è sotto 30 min. </li></ol></li><li> Affettare <ol><li> Affettare le dell&#39;ippocampo trasversalmente in 400 micron sezioni utilizzando un&#39;affettatrice manuale dei tessuti. Il metodo con cui il taglio è condotta non è importante, purché non sia troppo dannoso per il tessuto e produce fette di spessore costante con l&#39;architettura laminare facilmente visibile (cioè corno di Ammon è facilmente visibile da conservare nel tessuto). </li><li> Lie il dell&#39;ippocampo sul palco del tessutochopper in cima a un triplo spessore di # 2 carta da filtro. Il ippocampi sono interamente a fette senza rimuovere alcun fette singolarmente (cioè l&#39;intero ippocampo è lasciato sulla scena del chopper fino a quando sono stati fatti tutti i tagli, ma piuttosto come pagnotte di pane a fette, a questo punto, Figura 1B). </li><li> Trasferire il ippocampi in mezzo dissezione con un pennello morbido di cui uno accanto ippocampo (bianco sable # 2). Spingere delicatamente ogni ippocampo di lato per rompere l&#39;adesione tra l&#39;ippocampo e la carta da filtro sottostante. Arrotolare la spazzola sotto ogni ippocampo a raccoglierla dal palco. Mettere tutti gli ippocampi nella stessa piastra da 35 mm di Petri di media dissezione refrigerata. Separare la ippocampi in singole sezioni agitando manualmente il piatto alternando movimenti in senso orario e antiorario. </li><li> Ispezionare le fette sotto un microscopio da dissezione e scartare qualsiasi che vengono danneggiati, piccola, o che non possiedono cellule chiaramente visibilestrati del corpo. NOTA: Sarà spesso il caso che non tutte le sezioni sono separate con successo dai loro fratelli in questo modo. In questo caso, essi possono essere separati da trasformandoli sul bordo e li incitamento con le punte di una pinza sottile. &quot;Good&quot; fette vengono poi trasferiti in un altro piatto di Petri pulita contenente medio dissezione refrigerata utilizzando un cut-off e il fuoco-lucidato pipetta Pasteur (Figure 1C-E). </li></ol></li><li> Conservazione <ol><li> Mettere le singole sezioni sugli inserti del filtro a membrana. Usando una pipetta Pasteur tagliato e fuoco lucido per dare un foro più grande, trasferire singolarmente fette agli inserti di cultura. NOTA: La dimensione del foro creato durante il taglio e il fuoco lucidare la pipetta è importante. Troppo piccolo e le fette non sarà facile lasciare la pipetta per la membrana. Fluido troppo grande e l&#39;eccesso è posto sulla superficie della membrana assieme alla fetta. Il miglior diametro del foro è di solito circa la metà del diametrotro del barile della pipetta. Durante il taglio, questo diametro può essere scelto tagliando al posto giusto sul cono della pipetta. </li><li> Fetta di trasferimento <ol><li> Riempire la pipetta con il mezzo prima, e poi aspirare una sola fetta con piccole forze di aspirazione. Ciò mantiene la fetta vicino all&#39;apertura della pipetta e impedisce troppa medio espulsione nell&#39;inserto per posizionare la fetta. </li><li> Applicare una leggera pressione sul bulbo per formare un piccolo pensile goccia, consentono la fetta di stabilirsi in quella goccia, e poi toccare quella goccia alla membrana e lasciare la fetta &quot;caduta&quot; sulla membrana. Generalmente tre fette sono posizionati su ogni inserto di membrana. NOTA: Se la gocciolina liquido è troppo grande, le goccioline delle tre fette tendono a fondersi sulla superficie della membrana, e le fette saranno quindi tutto raccogliere al centro della membrana, il che rende più difficile separarli per la registrazione elettrofisiologica tardi. </li></ol></li><li> Remov Fluidal <ol><li> Aspirare ogni eccesso di terreno dalla parte superiore dell&#39;inserto piastra di coltura per tutte le sezioni di quel piatto (3 fette per inserto = 21 fette per piastra), in modo che le fette non sono immersi in o circondati da un pool di media dissezione. </li><li> Eseguire questo è con un non tagliato, ma il fuoco lucidato pipetta Pasteur. Lasciare che la fetta di stabilirsi e di aderire alla membrana per un minuto prima di pipettaggio. Fare attenzione a non risucchiare la fetta alto nella pipetta. Eseguire la rimozione del liquido per gli inserti che sono placcati in primo luogo, per dare il tempo sufficiente per le fette di stabilirsi. </li></ol></li><li> Fetta di archiviazione <ol><li> Culture fetta Conservare in CO 2 incubatore 5,0% a 37 ° C. Osservare la disposizione finale delle culture in Figura 1E. Le singole sezioni poggiano su un inserto piastra di coltura che ha una membrana porosa per una parte inferiore, e questo inserto si inserisce all&#39;interno di una capsula di Petri riempita con una piccola quantità di mezzo; in questo modo, le fette non sono immersi nel medium, ma ha accesso ad esso solo attraverso la membrana nella parte inferiore dell&#39;inserto piastra di coltura. </li><li> Facoltativamente, rimuovere le fette possono per motivi di studio o rimuovendo l&#39;inserto piastra di coltura o tagliando fuori una sezione di membrana inserto contenente una fetta. </li></ol></li></ol></li><li> Manutenzione <ol><li> Sostituire il mezzo in piastre di Petri il giorno dopo aver fatto le culture. Trasferire l&#39;inserto piastra di coltura di una nuova capsula di Petri contenente 1 ml di terreno di coltura fresco che viene equilibrato in incubatrice per almeno un&#39;ora prima del trasferimento. </li><li> Cambiare il mezzo nuovamente nello stesso modo il terzo giorno dopo aver culture. Il terzo giorno, il trasferimento delle culture di un incubatore a 34 ° C. Modificare il medio due volte alla settimana (ogni 3-4 giorni). </li><li> Identificare le colture sane. Selezionare colture sane per le registrazioni di cellule intere appaiati. NOTA: colture sane hanno un bordo ben definito e uno strato di cellule piramidali chiaramente definito. Culture with scuro (probabilmente necrotico) aree presenti o un aspetto vacuolato con bordi appiattiti vengono rifiutati. Utilizzando questi criteri, di solito due terzi delle culture fetta sono sufficientemente sani per la registrazione. </li><li> Utilizzare queste culture all&#39;interno di una relativamente piccola finestra di tempo. Non tessuti utilizzati che sono coltivate per più di due settimane da quando i neuroni cominciano a mostrare un comportamento leggermente epilettiforme che peggiora lentamente nel tempo. Il limite superiore esatto della sopravvivenza neuronale non è noto, ma è possibile registrare dal funzionamento delle cellule piramidali più tardi di 16 settimane di cultura. </li></ol></li></ol> 2. accoppiati Registrazioni a cellula intera <ol><li> ACSF e intracellulari Solutions <ol><li> Preparare la soluzione elettrodo presinaptica mescolando (in mm) 120 gluconato di potassio, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 2 NaATP, e 0,3 NaGTP (pH 7,2 con KOH; osmolarità: 290 mOsm). Mentre la stessa soluzione elettrodo è utilizzato per i neuroni postsinaptici, gluconato di cesio (120 mM) È tipicamente utilizzato come il principale sale nella elettrodo postsinaptica, più 5 QX314 mM. NOTA: Questo consente di bloccaggio tensione stabile a potenziali positivi per registrare NMDAR-mediata correnti postsinaptiche 8-10,13. Inoltre impedisce l&#39;ipereccitabilità potassio indotta del neurone presinaptico dalla soluzione interna che scorre dall&#39;elettrodo registrazione postsinaptica prima di un sigillo giga ohm è fatta. </li><li> Preparare la soluzione elettrodo postsinaptico comporre (in mm) 120 gluconato di cesio, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 5 QX314, 2 NaATP, e 0,3 NaGTP (pH 7.2 con CsOH; osmolarità: 290 mOsm). Tirare microelettrodi di vetro 5-10 resistenza MW e riempire con soluzione interna filtrata. </li><li> Preparare liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) composizione (in mm) 119 NaCl, KCl 2.4, 1.3 MgSO 4, 2.4 CaCl 2, 1 Na 2 HPO 4, 26.2 NaHCO 3, 11 glucosio, pH 7.4, saturato con il 95% O 2, 5 % di CO 2. NOTA: Se r Ampar-mediataesponses devono essere bloccate per l&#39;esame di NMDAR EPSCs, includono 10 mM CNQX o NBQX nel ACSF. </li></ol></li><li> Ottenere accoppiati interi Recordings Cellulari <ol><li> Per esaminare la trasmissione sinaptica tra due neuroni individuali, designare un neurone in neurone presinaptico e tenere in pinza per indurre potenziali d&#39;azione e di avviare la trasmissione sinaptica. </li><li> Designare il secondo neurone, il neurone postsinaptico, e tenerlo in clamp corrente o tensione in relazione alla informazioni richieste dal ricercatore. Ottenere un esame dettagliato delle correnti glutamatergiche, con EPSCs Ampar-mediate esaminati a -65 mV e EPSCs NMDAR mediata esaminati a +30 mV 6-16 tenendo il neurone postsinaptico in morsetto di tensione </li><li> Stabilire una registrazione accoppiato. Per stabilire una registrazione accoppiato, la registrazione intera cellula presinaptica è sempre ottenuta prima, consentendo molteplici neuroni postsinaptici sequenziali da ottenere fino a quello che è sinapticamente Connected è ottenuta. Se l&#39;esecuzione di esperimenti di plasticità sinaptica, è particolarmente critico per ottenere il neurone presinaptico prima come l&#39;induzione di LTP nel neurone postsinaptico deve essere avviata entro 10 min di ottenere l&#39;intera registrazioni cellulari per evitare dilavamento dei fattori citoplasmatici necessari per la LTP 8,19. </li><li> Evitare la perdita di cellule movimento-indotta. Una sfida importante quando si eseguono registrazioni di cellule intere appaiati è di evitare vibrazioni e disagi indotti dal movimento della prima registrazione cellula intera, mentre ottenere la seconda registrazione. <ol><li> Ottenere la prima registrazione cellula intera e quindi spostare il microscopio lente 10-200 micron in asse x in modo che la registrazione stabilita si trova ai margini della zona visibile sul monitor (Figura 2A). </li><li> Sollevare la lente del microscopio ~ 5-10 mm, garantendo nel contempo che il ACSF mantiene ancora il contatto con la lente. Montare il secondo elettrodo e guidare nel menisco liquido (Figura 2B </sTrong&gt;). </li><li> Spostare l&#39;elettrodo nel piano xy fino a quando non è direttamente sotto il percorso della luce attraverso l&#39;obiettivo, ma ancora significativamente sopra l&#39;elettrodo di registrazione stabilita. Una volta che l&#39;elettrodo è visibile al microscopio, garantire la punta è al limite estremo del monitor lontano dal primo elettrodo. </li><li> Spostare il secondo elettrodo nella sequenza con la messa a fuoco del microscopio fino a che entrambi gli elettrodi sono sullo stesso piano focale. E &#39;importante che il livello di pressione positiva è abbastanza forte per evitare punta blocco ma non troppo forte in modo da interrompere la prima registrazione cellula intera. Questo si traduce in pressione positiva inducendo movimento tra 2-3 neuroni dall&#39;elettrodo quando entra per la prima fetta. </li><li> Individuare un partner postsinaptico in un piano focale simile alla prima registrazione presinaptico (Figura 2C). La registrazione è generalmente associato ottenere registrazioni tra i neuroni piramidali CA3 seconda cella tutto da un neurone 0-200 mm della prima recording (Figure 2C, D). NOTA: La trasmissione sinaptica tra coppie neuronali sono stabili su periodi di tempo fino a 3-4 ore quando si utilizzano queste tecniche intere standard di registrazione delle cellule. </li></ol></li></ol></li><li> Plasticità sinaptica: Once Upon ottenere un paio di cellule piramidali sinapticamente-collegato di successo (3A figure, B), esaminare le caratteristiche di trasmissione e plasticità sinaptica. <ol><li> Induzione di LTP. <ol><li> Indurre LTP accoppiando potenziali d&#39;azione presinaptico (1 Hz) con depolarizzazione postsinaptica a -10 a 0 mV per 1 min (Figura 3C) 7-9,12-14. Avviare l&#39;associazione entro 10 minuti di break-in al neurone postsinaptico. NOTA: LTP può anche essere indotta con entrambi i neuroni tenutasi a pinza con l&#39;associazione potenziali d&#39;azione presinaptici e postsinaptici a 1 Hz per 1 min, con potenziali d&#39;azione postsinaptici suscitato 10 msec dopo l&#39;iniezione di corrente nel neurone presinaptico 8 </sup&gt;. </li></ol></li><li> Ulteriori indurre LTD dalla bassa frequenza di stimolazione (LFS) a 1 Hz combinata con una leggera depolarizzazione del neurone postsinaptico a -55 mV per 5-10 min (Figura 3C) 9. </li></ol></li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAP-mediated+protein-protein+interactions+essential+for+neurotransmitter+release.">SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release.</a> Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).</li><li>Bekkers, J. M., Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+variability+in+quantal+size+in+cultured+hippocampal+neurons+and+hippocampal+slices.">Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).</li><li>Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+between+pairs+of+hippocampal+slice+neurons:+quantal+levels,+oscillations,+and+LTP.">Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP.</a> Science. 252, 722-724 (1991).</li><li>Debanne, D., Gu&#233;rineau, N. C., G&#228;hwiler, B. H., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pharmacology+of+unitary+synaptic+connections+between+pairs+of+cells+in+areas+CA3+and+CA1+of+rat+hippocampal+slice+cultures.">Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).</li><li>Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+altered+inhibition+in+Ts65Dn,+a+mouse+model+of+Down+syndrome.">Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome.</a> Brain Research. 1440, 1-8 (2012).</li><li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li><li>Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+nature+of+synaptic+circuitry+is+altered+in+area+CA3+of+the+hippocampus+in+a+mouse+model+of+Down's+syndrome.">The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome.</a> Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Qui abbiamo descritto i requisiti per la creazione di successo registrazioni di cellule intere associati nel organotipica culture fetta dell&#39;ippocampo. Registrazioni accoppiati possono essere eseguite in diverse preparazioni, tra cui fettine acute e sistemi di colture dissociate 26,27. Mentre il fuoco qui è stato sul induzione di forme di plasticità sinaptica (LTP e LTD cioè) più lunghi, è importante sottolineare che le coppie di registrazioni di cellule intere in organotipica, fetta acuta e dissocia...

Recettori del glutammato mediano la maggior parte della trasmissione sinaptica eccitatoria a livello delle sinapsi del sistema nervoso centrale. I due principali sottotipi di recettori ionotropici del glutammato localizzate alla testa dorso della membrana postsinaptica sono N-metil-D-aspartato (NMDA) e α-ammino-3-idrossi-5-methylisoxazole-4-proprionic acido (AMPA) recettori. A riposo potenziali di membrana, i recettori AMPA portano la maggior parte della corrente post-sinaptica durante la trasmissione sinaptica. Nel ippocampo, il recettore NMDA svolge un ruolo chiave nello scatenare variazioni nel numero di recettori AMPA nella membrana postsinaptica: agendo come un &quot;rivelatore coincidenza&quot; 1 per avviare cambiamenti nella forza sinaptica 1, il recettore NMDA partecipa ai meccanismi sinaptici che si pensa di sostenere l&#39;apprendimento e la memoria a livello subcellulare. In risposta alla depolarizzazione del neurone postsinaptico in parallelo con rilascio di neurotrasmettitore presinaptico, calcio entra attraverso l&#39;NMDArecettore per avviare l&#39;inserimento dei recettori AMPA o la rimozione 2. Queste dinamiche recettori sono alla base della plasticità sinaptica: un aumento della forza sinaptica è a lungo termine 2,3 potenziamento (LTP), mentre una diminuzione della forza sinaptica è la depressione a lungo termine 4 (LTD). Quindi il movimento del recettore AMPA è pensato per essere responsabile di espressione plasticità sinaptica, mentre i recettori NMDA sono pensati per controllare la sua induzione. Determinare i precisi meccanismi alla base della trasmissione sinaptica e la plasticità è necessario studiare piccole popolazioni di sinapsi, idealmente singole sinapsi. Mentre alcune sinapsi sono molto adatti per lo studio a questo livello, ad esempio, il calice di Held 5, per le popolazioni più sinaptici questo è estremamente difficile a causa della natura piccola e diffusa delle connessioni sinaptiche. Due principali tecniche di elettrofisiologia sono state sviluppate per esaminare le connessioni sinaptiche singoli: il primo è la stimolazione minima, DOVe una fibra presinaptica si presume stimolata extracellulare. La seconda tecnica è accoppiato registrazioni, in cui si svolge due registrazioni di cellule intere simultanee da neuroni sinapticamente collegati. Un vantaggio importante di stimolazione minima è che è rapido e relativamente semplice da eseguire, coinvolgendo il posizionamento di un elettrodo di stimolazione extracellulare nel tratto assonale e contemporaneamente registrare da un neurone postsinaptico. La preoccupazione principale quando si utilizza questa tecnica è che la stimolazione affidabile di una singola cellula può raramente essere garantita prova dopo prova. Negli ultimi quindici anni abbiamo abitualmente utilizzati accoppiato registrazioni whole-cell da due neuroni piramidali sinapticamente collegati 6-17. Il principale vantaggio di questa tecnica è che solo neurone presinaptico è coerente e affidabile stimolato. Inoltre permette non solo la caratterizzazione elettrofisiologica, ma anche la manipolazione farmacologica del neurone presinaptico 6,18 &lt;/ Sup&gt;. Tuttavia, la probabilità di connettività sinaptica tra neuroni è basso, accoppiando collegati difficile ottenere 19. L&#39;utilizzo di culture fetta cerebrale organotipica aggira questo ostacolo come connettività sinaptica può ristabilire in vitro ed inoltre la natura della connettività risultante è simile a quello nel tessuto cerebrale nativo 20. Inoltre, culture organotipiche esprimono LTP, LTD 7-10,12-15,21 e ulteriori forme di plasticità sinaptica a breve termine, tra cui la facilitazione paired-pulse (PPF) e depressione (PPD) 6,22,23, consentendo meccanismi di plasticità a essere studiato in coppie di neuroni. Qui si descrive la metodologia dettagliata coinvolti nel raggiungimento di successo registrazioni appaiati in questo sistema in vitro. Questa informazione può essere facilmente adattato ad altri sistemi sperimentali, tra cui fettine acute e altre regioni del cervello.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Organotypic cultures</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:64px;">Paired recordings</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimum Essential Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable motorized micromanipulators&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Shallow tissue bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DIC camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1M Tris stock solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vibration isolation table</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic-coated miniature spatulas&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Upright microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">soft paintbrush&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Data acquistion and analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">manual tissue chopper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electrode puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#2 filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#5&#160; forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Membrane inserts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CO2 incubator&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Class II hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paired whole cell recordings in organotypic hippocampal slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Connettività Synaptic è evidente stimolando il neurone presinaptico a fuoco un potenziale d&#39;azione passando un impulso di corrente depolarizzante (tipicamente 20-50 pA per 20 msec) tramite l&#39;elettrodo di registrazione. La traccia corrente postsinaptica viene poi esaminato per la presenza di una EPSC monosinaptico evocata a breve (&lt;5 msec) e latenze coerenti dopo il picco del potenziale d&#39;azione presinaptico (Figura 3A). Nella maggior parte degli esperimenti più neuroni postsinaptici so...

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Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Associati a cellule intere registrazioni in organotipiche fettine di ippocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

paired-whole-cell-recordings-in-organotypic-hippocampal-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.6K Views.  University of Auckland. Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Video: Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Accoppiato a pinza registrazioni patch da Motor-neurone e muscolo scheletrico bersaglio in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Ricerca

Neuroscienze

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotipica Culture Slice ippocampale

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Registrazione intera cella da un Preparazione Tagliare organotipica della neocorteccia

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multi-array di elettrodi Recordings Valanghe neuronali in Culture organotipica

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell&#39;ippocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Colture Hippocampal Fetta organotipiche come modello di studio Neuroprotection e l'invasività delle cellule del tumore

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.