Die Autoren bedanken sich bei Mayumi Sakuraba und Rebecca Foehring für hervorragende technische Unterstützung danken. Darüber hinaus möchten wir Drs danken. Rodrigo Andrade für die Unterstützung bei der Umsetzung der organotypischen Kultur und biolistischen Transfektion Protokolle und Dr. Jeanne Nerbonne für die Bereitstellung von cDNA-Konstrukte für die Transfektion. NS044163 aus NINDS (zu RCF): Diese Arbeit wurde vom NIH gefördert.

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	<li>Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+the+5-hydroxytryptamine+2A+receptor-mediated+facilitation+of+synaptic+activity+in+prefrontal+cortex.">Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).</li><li>Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+neural+responses+in+cortical+organotypic+slices.">Timing of neural responses in cortical organotypic slices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).</li><li>Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+organization+and+development+of+slice+cultures+from+rat+visual+cortex.">Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex.</a> Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).</li><li>Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actions+of+Kv2.1+channels+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons.">Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons.</a> Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).</li><li>G&#228;hwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).</li><li>G&#228;hwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+of+neural+tissue.">Organotypic cultures of neural tissue.</a> Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).</li><li>G&#228;hwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li><li>G&#228;hwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Maintenance+of+Organotypic+Slice+Cultures+of+CNS+Tissue.">Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).</li><li>Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+biophysical+properties+of+Kv1+channels+in+supragranular+neocortical+pyramidal+neurones.">Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones.</a> J Physiol. 571, 371-389 (2006).</li><li>Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+Kv1+containing+channels+in+neocortical+pyramidal+neurons.">Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons.</a> J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).</li><li>Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kv2+subunits+underlie+slowly+inactivating+potassium+current+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons.">Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons.</a> J Physiol. 581, 941-960 (2007).</li><li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+chronic+stimulation+of+cortical+organotypic+cultures+using+implanted+electrodes.">A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes.</a> Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).</li><li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+plasticity+of+spontaneous+activity+and+Up+states+in+cortical+organotypic+slices.">Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices.</a> J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).</li><li>Malin, S. A., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+rectifier+K++currents,+IK,+are+encoded+by+Kv2+alpha-subunits+and+regulate+tonic+firing+in+mammalian+sympathetic+neurons.">Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons.</a> J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).</li><li>O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun:+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue.">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKCa+channels+mediate+the+medium+but+not+the+slow+calcium-activated+afterhyperpolarization+in+cortical+neurons.">SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons.</a> J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).</li><li>Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+preprotachykinin+promoter+activity+in+single+cortical+neurons.">Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons.</a> J Neurochem. 75, 882-885 (2000).</li><li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture.">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biolistic+transfection+of+neuronal+cultures+using+a+hand-held+gene+gun.">Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun.</a> Nat Proc. 1, 977-981 (2006).</li><li>Joshi, P., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+gun+transfection+of+hippocampal+neurons.">Gene gun transfection of hippocampal neurons.</a> J Vis Exp. , (2006).</li><li>Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben die Untersuchung der Expression und funktionelle Rolle von spannungsabhängigen Kaliumkanälen in pyramidalen Neuronen von Ratten Neokortex (4, 9-11). Wegen des Fehlens von spezifischen pharmakologischen Wirkstoffen für diese Kanäle, verwenden wir einen genetischen Ansatz zur Manipulation Kanal Ausdruck (1,14,15,17-19). Wir verwenden eine organotypischen Kultur Vorbereitung (2,3; 5-8; 12,13,15-22). Aus dem Ansatz der Stoppini et al (16) modifiziert, um Zellmorphologie und der laminaren Must...

Chirurgie / Transfektion / Kultur: <ol><li> Brain-Slicer: Campden Vibroslice # MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA </li><li> Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547) <ul><li> Enthält: Gene gun, Helium Schlauchleitung mit Regler, Schläuche prep Station (# 165-2418), Spritze Kit, Tefzel Schläuche, Rohrschneider, Optimierung Kit (# 165-2424), Rohrschneider </li><li> Bio-Rad Helium Regulator (# 165-2413) </li><li> Einweg-Lieferungen für Helios von Bio-Rad: <ul><li> 1,6 um Gold-Mikropartikel: # 165-2264 </li><li> Tefzel Tubing: # 165-2441 </li></ul></li></ul></li><li> Incubator: Forma Scientific Modell # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984-3766). </li></ol> Media: <ol><li> Pferd Serum: Hyclone Spender equine # SH 30074. (HyClone, 925 West-Süd 1800, Logan, UT 84321) </li><li> HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS und HEPES, ohne Glutamin: Lonza BioWhittaker Catalog # 12-137f): GIBCO / Invitrogen, (800) 955 bis 6288, Option 1. </li><li> HBSS (GIBCO Hanks Salzlösung, # 24020-117): GIBCO / Invitrogen, (800) 955 bis 6288, Option 1. </li><li> MEM (GIBCO minimal essential medium, # 12360-038), GIBCO / Invitrogen, (800) 955 bis 6288, Option 1. </li><li> 250 mL Millipore 0,2 um-Filter: # SC6PU02RE </li><li> Plastic Transferpipetten: Fisher # 13-711-20. </li><li> 50 ml Millipore Steriflip 0,22 um Filter (# SCGP00525) </li></ol> Artikel 6-8 von Tieren, Fisher Scientific, 1241 Botschafter Blvd, PO Box 14989, St. Louis, MO 63132. Aufnahme: <ol><li> Pipet Glas: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 Oktober Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746 </li><li> Sutter P-87 horizontalen Elektrode puller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949 </li><li> Axon Instruments Multiclamp 700B Verstärker: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 </li><li> PClamp 10 Daten Erfassungs-Software: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 </li><li> Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949: lectrode Position wird mit Sutter ROE-200 Manipulatoren und PC-200-Controller gesteuert. </li><li> Mikroskop: Olympus BX-50WI aufrechten Mikroskop mit IR-DIC-Optik </li><li> IR-empfindliche Kamera OLY-150 (Olympus) oder DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 Nord Roeske Avenue, New York City, IN 46360). </li></ol>

whole cell recording from an organotypic slice preparation of neocortex

Wir haben die Untersuchung der Expression und funktionelle Rolle von spannungsabhängigen Kaliumkanälen in pyramidalen Neuronen von Ratten Neocortex. Wegen des Fehlens von spezifischen pharmakologischen Wirkstoffen für diese Kanäle, haben wir einen genetischen Ansatz zur Manipulation Kanal Ausdruck übernommen. Wir verwenden ein organotypischen Kultur Vorbereitung (16), um Zellmorphologie und der laminaren Muster der Hirnrinde zu halten. Wir in der Regel zu isolieren akuten neokortikalen Scheiben an postnatalen Tag 8-10 und halten die Scheiben in der Kultur für 3-7 Tage. Dies erlaubt uns, Neuronen in einem ähnlichen Alter wie in unserer Arbeit mit akuter Scheiben Studie und minimiert die Entwicklung von üppigen exzitatorischen Verbindungen in die Scheibe. Wir erfassen von visuell identifizierten Pyramidenneuronen in den Schichten II / III oder V mit Infrarot-Beleuchtung (IR-) und Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie (DIC) mit ganzen Zelle Patch-Clamp-in Strom-oder Spannungs-Klemme. Wir verwenden biolistischen (Gene gun) Transfektion von Wildtyp-oder mutierte Kaliumkanal DNA, um die Expression der Kanäle, um ihre Funktion zu untersuchen manipulieren. Die transfizierten Zellen werden leicht durch Epifluoreszenzmikroskopie nach Co-Transfektion mit cDNA für das grün fluoreszierende Protein (GFP) identifiziert. Wir vergleichen Aufnahmen von transfizierten Zellen zu benachbarten, nicht transfizierten Neuronen in der gleichen Schicht aus dem gleichen Stück.

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Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Dies ist ein Protokoll zu erstellen und Aufrechterhaltung eines Neokortex Scheibe Vorbereitung in organotypischen Kultur zum Zwecke der Herstellung elektrischer Aufnahmen von pyramidalen Neuronen.

Whole Cell Aufnahme von einem organotypischen Vorbereitung der Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

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14.1K Aufrufe.  University of Tennessee Health Science Center. Dies ist ein Protokoll zu erstellen und Aufrechterhaltung eines Neokortex Scheibe Vorbereitung in organotypischen Kultur zum Zwecke der Herstellung elektrischer Aufnahmen von pyramidalen Neuronen.