Questo protocollo fornisce un metodo per identificare gli interattori di RNA di una proteina legante l'RNA PKR in modo genomico. Ci aiuta a comprendere meglio la regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica da parte della proteina legante l'RNA. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza un efficiente crosslinking della formaldeide per fissare la RNasi legata alle proteine leganti l'RNA e arricchirle attraverso l'immunoprecipitazione.
Il PKR attivato è osservato in pazienti con malattia neurodegenerativa, come il morbo di Parkinson e il morbo di Alzheimer. Identificare la RNasi a doppio filamento che interagisce con PKR ci aiuterà a comprendere meglio la patogenesi di queste malattie degenerative. Questo metodo può essere usato per studiare gli interattori di RNA di qualsiasi proteine legante l'RNA.
In particolare, crediamo che questo metodo sia utile per studiare proteine che riconoscono la RNasi strutturata, come la RNasi a doppio filamento. Controllare l'omogeneità del campione arrestato in bicicletta prima di raccogliere le cellule. Inoltre, è fondamentale ottimizzare l'efficienza dell'immunoprecipitazione utilizzando il miglior anticorpo disponibile.
Per cominciare, semina 750.000 o un milione di cellule HeLa rispettivamente per campioni arrestati in fase S o M. Far crescere le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 24 ore. Trattare le cellule con timidina due millimolare e incubare a 37 gradi Celsius per 18 ore.
Lavare le celle due volte con PBS. Quindi, aggiungere mezzi freschi e incubare a 37 gradi Celsius per nove ore. Per le cellule arrestate in fase S, trattare le cellule con timidina due millimolare.
Per le cellule arrestate in fase M, trattare le cellule con 100 nanogrammi per millilitro di nocodazolo. Incubare a 37 gradi Celsius per 15 ore. Per un campione in fase S, raccogliere le cellule con un raschietto cellulare e trasferirlo in un tubo conico da 15 millilitri.
Per un campione in fase M, toccare il lato del piatto di coltura cellulare per staccare le cellule arrestate in fase M e trasferirle in un tubo conico da 15 millilitri. Quindi, centrifugare le cellule a 380 g a temperatura ambiente per tre minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule con un millilitro di PBS freddo.
Trasferire le cellule in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Centrifugare le cellule a 10.000 g a quattro gradi Celsius per 30 secondi e rimuovere completamente i supernatanti. Per eseguire il crosslinking della formaldeide, aggiungere prima 750 microlitri dello 0,1% di paraformaldeide alle cellule e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti per fissare le cellule.
Quindi, aggiungere 250 microlitri di glicina unmolare e incubare a temperatura ambiente per altri 10 minuti per spegnere la reazione. Centrifugare le cellule a 10.000 g a quattro gradi Celsius per 30 secondi. Rimuovere completamente i supernatanti.
Quindi, resuspend con un millilitro di PBS. Centrifugare le cellule a 10.000 g a quattro gradi Celsius per 30 secondi e rimuovere il supernatante. Resuspend con 400 microlitri di tampone di llisi fCLIP integrati con inibitore della proteasi dello 0,2% e inibitore della RNasi del due volumi%.
Incubare sul ghiaccio per 10 minuti e sonicare usando un ultrasuonatore. Successivamente, aggiungere 11 microlitri di cloruro di sodio a cinque molari per regolare brevemente la concentrazione di cloruro di sodio a 150 millimolare e vortice. Quindi, centrifuga a 21,130 g a quattro gradi Celsius per 15 minuti.
Trasferire i supernatanti in un tubo di microcentrifugo pre-refrigerato da 1,5 millilitri. Per eseguire l'immunoprecipitazione, aggiungere prima 20 microlitri di perline proteiche A in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Quindi, lavare le perline con 400 microlitri di tampone di lisi fCLIP.
Centrifugare le perline a 1.000 g a quattro gradi Celsius per un minuto. Quindi, rimuovere il supernatante, aggiungere con cura 400 microlitri di tampone dilisi fCLIP e rimescolare delicatamente le perline invertendo da tre a quattro volte. Ripetere il passaggio di lavaggio tre volte.
Dopo il lavaggio finale, rimuovere completamente i supernatanti. Rimescolare le perline in 300 microlitri di tampone di lysis fCLIP. Aggiungere 8,3 microlitri di cloruro di sodio a cinque molari per regolare la concentrazione di cloruro di sodio a 150 millimolare.
Aggiungere 10 microlitri di anticorpo attivato dall'RNA della protein chinasi e incubare su un rotatore a quattro gradi Celsius per tre ore. Quindi, centrifuga le perline a 1.000 g a quattro gradi Celsius per un minuto. Rimuovere il supernatante, aggiungere 400 microlitri di tampone di lavaggio fCLIP e rimescolare delicatamente le perline invertendo da tre a quattro volte.
Ripetere il passaggio di lavaggio due volte. Dopo il lavaggio finale, rimuovere completamente i supernatanti. Quindi, aggiungere 300 microlitri di lisato e incubare a quattro gradi Celsius su un rotatore per tre ore.
Quindi, centrifuga le perline a 1.000 g a quattro gradi Celsius per un minuto. Rimuovere il supernatante, aggiungere 400 microlitri di tampone di lavaggio fCLIP e rimescolare delicatamente le perline invertendo da tre a quattro volte. Ripetere il passaggio di lavaggio tre volte.
Dopo il lavaggio finale, rimuovere completamente il supernatante. Aggiungere quindi 300 microlitri di tampone di eluizione fCLIP. Incubare in un ThermoMixer a 25 gradi Celsius per tre ore per elutare la protein chinasi attivata dall'RNA dalle perline.
Centrifugare a 1.000 g a temperatura ambiente e trasferire i supernatanti in un tubo siliconizzato pulito. Infine, aggiungere 300 microlitri di Proteinasi K e incubare durante la notte a 65 gradi Celsius. L'efficienza dell'arresto del ciclo cellulare delle cellule HeLa nella fase S o M è stata esaminata utilizzando facs.
L'anticorpo D7F7 ha mostrato una capacità superiore di immuno precipitato protein chinasi RNA attivato. L'analisi western del llysato di HeLa precipitato o totale dell'immuno PKR ha mostrato solo una banda forte corrispondente alle dimensioni del PKR, indicando che l'anticorpo D7F7 è altamente specifico nel riconoscere la PKR. L'uso di diversi anticorpi PKR con diversa efficienza di precipitazione immuno, ha portato a una diversa distribuzione della classe di letture di sequenziamento delle mappe.
La diminuzione del segnale radioisotopico per la RNasi co-immunoprecipitata PKR è stata osservata al successo della rimozione dell'rRNA. Il campione di RNA co-immunoprecipitato PKR ha mostrato un forte arricchimento della RNasi mitocondriale rispetto ai controlli negativi. La trascrizione inversa specifica del filamento è stata utilizzata per distinguere la RNasi mitocondriale a filamento pesante e leggero che sono state co-immunoprecipitate con PKR per cellule arrestate in fase S o M.
Il passaggio più critico nella preparazione del campione di arresto del ciclo cellulare è dove è necessario lavare le cellule due volte con PBS e dove è necessario raccogliere solo cellule pastello per omogeneità o sarebbe un campione compromesso. Per un processo eticamente, i passaggi più critici sono il collegamento incrociato della formaldeide e la quantità. Dopo questa procedura gli RNA eluitati possono essere analizzati utilizzando l'blotting settentrionale, il PCR qRT o il sequenziamento ad alta velocità effettiva.
Questi esperimenti possono identificare il tipo e la quantità relativa di RNasi legata alla PKR. Questa tecnica può essere applicata per studiare e identificare gli interattori di RNA delle proteine leganti l'RNA che miglioreranno la nostra comprensione della regolazione post trascrizionale dell'espressione genica, mediata da proteine leganti l'RNA. La formaldeide è pericolosa, quindi la fissazione, la soluzione e il tampone di lavaggio iniziale devono essere maneggiati con cautela.
