Molte persone hanno contribuito al lavoro descritto in questo articolo. CVG ha costruito il setup sperimentale, e LS, SHC, e CVG eseguito gli esperimenti. CVG e SHC ha scritto il manoscritto. Tutti gli autori successivamente preso parte al processo di revisione e approvato la copia definitiva del manoscritto. Ringraziamo Paul Sternberg per il ceppo GCaMP. Alcuni ceppi di nematodi utilizzati in questo lavoro sono stati forniti dal Centro di Genetica Caenorhabditis (CGC), che è finanziato dalla National NIH Center for Research (NCRR). Il programma di analisi di immagine MATLAB è stato adattato da quello utilizzato in 18. Gli autori sono stati sostenuti da Boston University e il Massachusetts Life Sciences Center.

1. Configurazione ottica <ol><li> Utilizzare un microscopio standard composto con capacità di imaging epifluorescenza. Usiamo un Nikon Eclipse Ti-U microscopio invertito con un illuminatore Intensilight HG. </li><li> Per una migliore immagine e la qualità del segnale utilizzare un alto ingrandimento, obiettivo di alta apertura numerica. Si utilizzano in genere un obiettivo Nikon X60 1,4 olio NA immersione. In alcuni casi è possibile usare più basso ingrandimento (X40, X20) a seconda del livello di espressione del fluoroforo e la forza del segnale. </li><li> Utilizzate una sensibilità elevata raffreddato CCD, come ad esempio una telecamera Andor Clara per massimizzare sensibilità delle immagini e ridurre al minimo il rumore di fondo. </li><li> Per fluorofori singolo colore usare il filtro standard a fluorescenza microscopio impostare progettato per la particolare lunghezza d&#39;onda del fluoroforo. Per GCaMP utilizzare uno standard GFP filtro impostato ottimizzato per l&#39;eccitazione a 488 nm ed emissione a 525 nm. Nessuna modifica ulteriore ottici sono necessari. </li><li&gt; Per fluorofori raziometrici, come cameleon, utilizzare un doppio sistema di imaging in modo tale che le immagini identiche potranno essere contemporaneamente catturato a due lunghezze d&#39;onda diverse. Questo si ottiene proiettando le immagini doppie side-by-side sulla telecamera. Una configurazione semplice per ottenere questo, utilizzando componenti ottici di base su una breadboard grado ottico, è illustrato in Figura 1. Si compone di: <ol class="ualpha"><li> Un filtro microscopio impostato con 440 ± 20 Eliminare filtro di eccitazione nm e 455 nm a lungo passare specchio dicroico. </li><li> Una maschera immagine inserita al piano dell&#39;immagine iniziale immediatamente al di fuori del microscopio porto di imaging (in cui il sensore CCD di solito sedersi). Questo limita il campo di vista tale che riempirà solo metà del sensore della telecamera. Ponendo questa maschera i primi risultati piano dell&#39;immagine in confini un&#39;immagine nitida e nessuna sovrapposizione quando le due immagini sono proiettate side-by-side. </li><li> L&#39;obiettivo primo relè impostare una lunghezza focale di distanza da tegli piano immagine iniziale tale che collima la luce. </li><li> Uno specchio dicroico, che divide la luce in due lunghezze d&#39;onda di imaging separati o canali che riflettono un colore (&gt; 515 nm, giallo) mentre l&#39;altra trasmissione (&lt;515 nm, ciano). </li><li> Filtri di emissione (filtri passa-banda) limitano ulteriormente la luce trasmessa alle lunghezze d&#39;onda di imaging specifiche (ciano a 485 ± 40 nm e gialli a 535 ± 30 nm), </li><li> Le lenti secondo relè (uno per ogni canale) collocati nei percorsi ottici tali che riorienta la luce ad un secondo piano dell&#39;immagine alla telecamera CCD. </li><li> Una coppia di specchi ed un secondo specchio dicroico dirige i percorsi ottici in modo tale che le due immagini ricombinati e sono proiettate side-by-side sul sensore CCD. Figura 4A illustra un esempio di immagine risultante. </li></ol></li><li> Iniziale ottica Allineamento: consente di avviare la configurazione e l&#39;allineamento delle ottiche con un imag alto contrastoe si utilizza un obiettivo a basso ingrandimento e trasmessi ad ampio campo di illuminazione della luce (un pennarello nero disegnato su un vetrino da microscopio funziona bene). Portare l&#39;immagine a fuoco attraverso gli oculari microscopio e poi passato alla porta microscopio da utilizzare. Con illuminazione a luce alta visualizzare le immagini su una scheda in corrispondenza del piano focale iniziale (pochi cm al di fuori del porto microscopio). Posizionare la prima lente relay (C) nel percorso del fascio tale che è una distanza focale dal piano focale iniziale e collima la luce mentre non deviare il percorso del raggio (cioè è direttamente centrato nel percorso del fascio). Posizionare la maschera in primo piano focale, regolata per mezzo limitare il campo di vista e produrre un pensionante acuto nell&#39;immagine. Posizionare gli specchi e filtri (D, E, G) tale che il percorso del fascio rimane parallela al piano del tavolo e viene eseguito in due percorsi paralleli side-by-side, come mostrato in figura 1B. Centro le lenti a relè secondo (F) nei loro rispettivi percorsi ottici espostarsi avanti e indietro lungo i percorsi di portare le immagini a concentrarsi su una scheda posta erano il sensore CCD sarà. Se fatto correttamente le due immagini devono essere parafocale con gli oculari del microscopio e le porte della fotocamera. Infine posizionare la fotocamera in posizione e mettere a punto l&#39;allineamento. </li><li> Regolazione allineamento ottico di precisione: Utilizzare la doppia immagine vista dalla telecamera CCD per regolare l&#39;allineamento ottico. Utilizzare un&#39;immagine ad alto contrasto e iniziare con minore ingrandimento, il passaggio a un ingrandimento maggiore per l&#39;allineamento finale. Posizionare l&#39;immagine trasmessa (ciano canale in Figura 1B) per coprire una metà del campo visivo della telecamera di vista spostando la camera in posizione X e Y. l&#39;immagine riflessa (canale giallo in Figura 1B) per coprire l&#39;altra metà del campo di visualizzare regolando gli ultimi due specchi (G) nel suo percorso ottico. Ottimizzare fuoco muovendo la seconda lente relay per ogni canale avanti e indietro lungo il percorso del fascio. Se a sinistrainalterata la configurazione ottica devono essere stabili e richiedono solo rari regolazione fine tune. </li></ol> 2. Preparazione del campione e acquisizione dati. <ol><li> Acquisire gli animali che esprimono un fluorocromo sensibile di calcio nel neurone di interesse da parte della Genetica Caenorhabditis Center (CGC) o da altre fonti. Alternativamente animali transgenici possono essere costruiti utilizzando standard C. elegans tecniche. Espressione singola cellula non è necessaria (e talvolta non auspicabile neuroni multiple devono essere studiati, vedi 12) fintanto immagini e misurazioni da più celle possono essere facilmente separati. Se il transgene fluoroforo non è integrato nel genoma, variazione significativa dell&#39;espressione può avvenire da un animale all&#39;altro. In questo caso, la preselezione animali con livelli di espressione più alti usando un microscopio a fluorescenza dissezione aumenta il rapporto segnale-rumore e migliora le misurazioni. Fluoroforo livelli di espressione need essere sufficiente per essere prontamente ripreso con la telecamera sotto i parametri di acquisizione richiesti dall&#39;esperimento. </li><li> Rendere le pastiglie agarosio richiesti per la tecnica di immobilizzazione desiderata (vedere 2.3) premendo una piccola goccia di agarosio fuso tra due lastre di vetro distanziate da due pezzi di nastro laboratorio. Se necessario, pastiglie agarosio possono essere trasferiti ad un vetrino di vetro prima di montare gli animali. Vedere la Figura 2. </li><li> Immobilizzare C. elegans per imaging utilizzando una delle seguenti tecniche: <ol class="ualpha"><li> Paralisi farmacologica: Aggiungi il 0,05% al ​​2% Levamisole pad agarosio (mescolandolo nel agarosio fuso prima di prendere le pastiglie al punto 2.2). Scegli animali 5-10 sul tampone e coprire con un vetrino coprioggetti. Applicare piccole quantità di miscela di cera di paraffina calda (50% e 50% vaselina) angoli del vetrino per tenerlo in posizione. Lasciare 5-10 minuti per il Levamisole abbia effetto e gli animali a become completamente immobile. </li><li> Stiff agarosio Immobilizzazione: C. elegans può essere fisicamente immobilizzato utilizzando tamponi rigidi 10% agarosio e 0.05 micron di diametro nanoparticelle polistirolo. Rendere 10% agarosio pad (10% agarosio in tampone NGM in peso) come in 2,2. Aggiungere ~ 3 ml di soluzione di tallone (1:10 microsfere di polistirene in NGM in volume) al di sopra del platorello. Rapidamente, scegliere 5-10 C. elegans nella piscina di soluzione tallone sul pad e delicatamente coprire con un vetrino coprioggetti. Utilizzare cera fusa applicato angoli del vetrino per tenerlo in posizione. (Per ulteriori dettagli su questa tecnica vedi 7 così come un precedente articolo JoVE 8) </li><li> Incollaggio: C. elegans può essere incollata utilizzando piccole quantità di adesivo di grado veterinaria applicato su un lato dell&#39;animale. </li><li> Dispositivi microfluidici: Numerosi dispositivi microfluidici sono stati progettati per contenere fisicamente C. elegans in atto per l&#39;imaging. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Posizionare il vetrino preparato sul microscopio e mettere a fuoco il neurone desiderato. Spesso è più facile trovare il C. elegans con forte illuminazione campo e basso ingrandimento. Poi il passaggio a elevato ingrandimento e di imaging di fluorescenza di trovare e mettere a fuoco il neurone specifico. </li><li> Stimolo: Se una risposta neuronale ad uno specifico stimolo è desiderato (luce, campo elettrico, spunti gustative e olfattive, temperatura, ecc), l&#39;apparato stimolo deve essere progettato nella configurazione microscopio, tale che può essere somministrato agli animali nella preparazione del campione mentre imaging. </li><li> Acquisire immagini utilizzando la fotocamera CCD microscopio. Tempi di esposizione e la luce di eccitazione livello dipende dal segnale di base e il livello di espressione del fluoroforo, con segnali più deboli che richiedono tempi di esposizione più lunghi con risoluzione temporale concordantly meno. Si utilizzano in genere ~ 300 msec tempi di esposizione. </li><li> Acquisire le immagini singolarmente o come tiMi film accelerato. Perché C. elegans neuroni mostrano generalmente dinamiche lente di attivazione (cioè non hanno potenziali d&#39;azione a base di sodio), frame rate relativamente lenti ~ 1 sec sono spesso sufficienti per misurare la dinamica dei neuroni. Velocità di acquisizione fino a ~ 90 fotogrammi al secondo sono stati utilizzati anche se questi possono essere limitati dal tempo di integrazione necessario per fluorescenza debole. Film individuali di un singolo neurone può facilmente estendere per alcuni minuti (min ~ 5-10) o più a lungo se il preparato è stabile immobilizzazione e il frame rate relativamente lento. </li></ol> 3. Analisi dei dati <ol><li> Ci sono una serie di pacchetti di imaging diverse fluorescenti software disponibili con capacità di analisi dinamiche e raziometrico tra ImageJ e NIS-Elements. Usiamo un semplice personalizzato programma MATLAB che misura la media del segnale fluorescente su una regione selezionata di interesse. </li><li> Per le singole immagini (o filmati time-lapse che restanoperfettamente immobile) selezionare una regione di interesse (ROI) all&#39;interno del neurone con immagini e una regione separato nelle vicinanze per la misurazione del fondo. Per le immagini raziometrici selezionare ROI simile e regioni sfondo per ciascuna delle doppie immagini. </li><li> Leggero movimento del neurone con immagini in un time-lapse filmato richiede ulteriori analisi per selezionare automaticamente il ROI in ogni fotogramma, che può essere realizzato utilizzando numerosi sistemi di monitoraggio degli oggetti. Il programma visualizza una immagine compressa di tutte le immagini del film, da cui un confine ruvida (che comprende l&#39;oggetto di interessi in tutti i fotogrammi) è selezionate manualmente e una regione autonoma sfondo selezionato. Per il primo fotogramma, un ROI viene selezionato manualmente all&#39;interno della regione di confine. Per ogni frame successivo, il programma seleziona i pixel più luminosi dall&#39;interno della zona di confine per generare un ROI della dimensione corretta (cioè lo stesso numero di pixel del ROI manuale primo fotogramma). Per le immagini in cui l&#39;obiettivot di interesse è sufficientemente luminoso poi lo sfondo circostante all&#39;interno della regione di confine questo protocollo seleziona un ROI ragionevole per ogni fotogramma. </li><li> Il segnale fluorescente, F, per ogni frame viene calcolato come media delle intensità dei pixel nella ROI meno l&#39;intensità media della regione di sfondo. Valori raziometrici sono calcolati come rapporto tra i due segnali (YFP-YFP sfondo) / (CFP CFP-sfondo) -0,65. Il fattore di 0,65 compensa spurgo attraverso il canale PCP nel canale YFP, che dipenderà fluorofori così come l&#39;insieme particolare filtro utilizzato (questo valore è tipicamente ~ 0,6 per configurazioni cameleon). </li><li> Il livello di calcio relativo per ciascun frame viene calcolato come variazione percentuale di intensità normalizzata ad un valore basale iniziale misurato dal primo fotogramma (o serie di fotogrammi): Af / F = (F (t)-F o) / F o, dove F (t) è la fluorescenza al tempo t e F oè il valore di riferimento iniziale. </li><li> Un ROI selezionando corpo cellulare genera i segnali più forti più robusti, ma è anche possibile selezionare e misurare segnali da un ROI lungo i processi nervosi. </li></ol> 4. Risoluzione di problemi <ol><li> Sbiancamento: L&#39;esposizione alla luce di eccitazione può causare il deterioramento del fluoroforo ed è caratterizzato da una diminuzione costante del segnale che dipende dai livelli di esposizione. Misurazioni raziometriche aiuto per compensare questo. Tuttavia selettiva sbiancamento di una lunghezza d&#39;onda possono ancora verificarsi (tipicamente candeggianti PCP più veloce poi YFP). Se si verifica lo sbiancamento ridurre il livello di esposizione di luce, riducendo i tempi di esposizione e / o intensità di eccitazione (con filtri a densità neutra nella via di illuminazione). Se necessario, si può compensare sbianca eseguendo finti processi (con l&#39;esposizione di eccitazione stessa ma nessuno stimolo neuronale) e quantificare la costante di tempo di decadimento del segnale. </li><li><strong&gt; Immobilizzazione: Per l&#39;analisi semplice immagine qui descritto è fondamentale l&#39;animale rimane relativamente fermo per tutto il periodo di registrazione C.. elegans rispondere alla esposizione alla luce e stimoli sperimentali, che li rende più probabile di muoversi al momento della registrazione. Leggero movimento può introdurre rumore significativo nella misurazione soprattutto quando si misura dai processi di assoni. Analisi Raziometrico aiuta a mitigare questi effetti in qualche misura e le misure dal corpo cellulare sono più robusti. Attenta esecuzione e la raffinatezza delle procedure di immobilizzazione comporta completamente immobile animali. </li><li> Sfondo di selezione: L&#39;attenta selezione di una regione di fondo è necessario per l&#39;analisi delle immagini di successo. Regioni sfondo deve essere ragionevolmente uniformi e più scura poi il neurone creata l&#39;immagine. Deve essere sufficientemente rimosso per evitare luce diffusa (e quindi un segnale pickup) dal neurone imaged. Troviamo una regione uniforme 20-50 micron dal ROI funziona bene nella maggior parte dei casi. </li><li> Ottica raziometrici: Il corretto allineamento delle ottiche di imaging è fondamentale per la generazione di una chiara immagine doppia. Allegati microscopio commerciali per l&#39;imaging raziometrico sono disponibili. Una tecnica alternativa è quella di utilizzare immagini in sequenza rapida con una ruota veloce filtro per passare rapidamente tra le lunghezze d&#39;onda di emissione durante la registrazione di immagini separate per ciascuno. </li><li> Raziometrico Analisi: L&#39;analisi qui descritto è una tecnica relativamente semplice che genera segnali stabili in virtù di media su un ROI. Si richiede un oggetto riconoscibile luminoso per selezionare il ROI. Analisi più sofisticate raziometrico è possibile far avvicinare e mappando le doppie immagini tali che il rapporto fluorescente può essere calcolata pixel per pixel. </li></ol>

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	<li>Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. 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Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Indicatori calcio geneticamente codificati sono stati ampiamente utilizzati in C. elegans neurobiologia. Numerosi gruppi hanno utilizzato queste tecniche per studiare la risposta dei neuroni sensitivi primari a stimoli esterni come dimostrato qui con la risposta ASJ ad un campo elettrico. Esempi più evidenti riguardano sensazione del tatto meccanici, prodotti chimici specifici, la temperatura e un campo elettrico 12, 16-19. Attività di interneuroni e cellule muscolari sono stati monitorati sia in r...

Qui vi presentiamo metodi pratici per imaging in vivo di calcio in C. elegans neuroni. Lo sviluppo di geneticamente codificati calcio-sensibili fluorofori con elevato rapporto segnale-rumore rende C. elegans un sistema relativamente semplice e conveniente per la misurazione di neurofisiologia e di attività. La nostra immagine è fatta con un microscopio standard con largo campo imaging di fluorescenza dei fluorofori comunemente disponibili. Vi presentiamo diverse tecniche che impiegano fluorofori diversi e preparati di campionamento diverse, discutendo i punti di forza e di debolezza di ciascuno. I dati vengono quindi presentato da due esperimenti di esempio. Una risorsa eccellente aggiuntiva sulle tecniche descritte qui possono essere trovati in WormBook, &quot;Imaging l&#39;attività dei neuroni e dei muscoli&quot; di R. Kerr, ( <a href="http://www.wormbook.org" target="_blank">http://www.wormbook.org</a> ) 3. Due classi principali di geneticamenteautomaticamente codificati reporter calcio fluorescenti sono comunemente usati in C. elegans: GCaMP singolo canale e FRET-based cameleon. Noi descrivere i metodi e mostrare esempi di dati generati da ciascuna. GCaMP si basa su una modifica proteina fluorescente verde (GFP), che è sensibile alla concentrazione di calcio circostante. Questo viene realizzato per fusione GFP e la elevata affinità calmodulina calcio proteina, in modo tale che il legame del calcio da calmodulina porta la molecola di GFP in una conferma efficiente fluorescente 2. I recenti progressi in questi fluorofori generano dimensioni eccezionali del segnale fino a 500% di aumento di intensità di fluorescenza in un range fisiologico dei livelli di calcio e cinetica ragionevolmente veloci di ~ 95 msec tempo di salita e tempo di decadimento ~ 650 msec 4. In periodi di tempo relativamente brevi (minuti), questi segnali di grandi dimensioni può consentire l&#39;imaging risoluzione più bassa (inferiore ingrandimento) e, dato un bravo initmisurazione di riferimento ial, negare la necessità di base continuo o misurazioni comparative. Cameleon ha il vantaggio di essere un FRET-based fluoroforo che genera una misurazione raziometrica confrontando due canali indipendenti o lunghezze d&#39;onda 1. Si compone di due fluorofori distinti (proteine ​​fluorescenti-ciano e giallo-emissione, CFP e YFP) collegati da una proteina calmodulina. Il complesso è illuminata con luce blu (440 nm) che eccita la PCP. Il legame di calcio porta i fluorofori più vicini, aumentando Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) dal CFP (donatore) alla YFP (accettore) e causando l&#39;emissione PCP (480 nm) per diminuire l&#39;emissione e YFP (535 nm) per aumentare . Relativi livelli di calcio sono misurati come rapporto della YFP / CFP intensità. Cinetica Cameleon sono lento di quello di GCaMP, misurata in vivo per avere un tempo di salita di ~ 1 sec ed un tempo di decadimento di ~ 3 sec 5. Tuttavia,il rapporto dei segnali contrapposti mobili aumenta la dimensione del segnale e compensa una serie di possibili artefatti dovuti ai cambiamenti nella concentrazione fluoroforo, movimento o deriva fuoco e candeggio. Geneticamente codificati reporter fluorescenti negare gran parte della preparazione del campione richiesto con esogena sonde amministrati e C. elegans piccolo corpo trasparente permette l&#39;imaging nel intatta di un animale con semplice fluorescenza ampio campo. La principale sfida tecnica nella preparazione del campione è quindi sicuro per immobilizzare gli animali. Ci sono un certo numero di differenti tecniche comunemente utilizzate ciascuno con vantaggi e svantaggi. Utilizzando un agente farmacologico di paralizzare gli animali è facile da implementare e permette il montaggio di animali multiple su una preparazione (Levamisole, un agonista colinergico che causa tessuto muscolare cogliere viene tipicamente usato 6). C. elegans può anche essere fisicamente immobilizzato da montarliil rigida 10% agarosio 7, 8. Questo impatto minimizza sulla fisiologia degli animali, consente a lungo termine di imaging (ore) e il recupero di animali di più, ma è tecnicamente più difficile. Entrambe queste tecniche limitare l&#39;accesso fisico agli animali (che sono sotto un coprioggetto) e può quindi essere utilizzata solo con determinati stimoli sperimentali (come luce, temperatura, campo elettrico o danni laser). Per stimoli in cui è necessario l&#39;accesso fisico, come il tatto o la somministrazione di prodotti chimici, molti studi hanno successo incollato C. elegans in atto (con colla veterinario grado) 9. Questo è tecnicamente più impegnativo, è una preparazione singolo animale e non consente il recupero degli animali. Infine, numerosi dispositivi microfluidici sono stati impiegati che fisicamente trattenere C. elegans, preservando fisiologia animale, permettendo l&#39;esposizione alla maggior parte di stimoli (a seconda del modello del dispositivo) e può permettere lo scambio rapido e recupero degli animali <sup&gt; 10, 11. Tuttavia microfluidica richiedono ulteriori competenze tecniche e capacità nella progettazione, fabbricazione e realizzazione. In immobilizzato attività animali e stimolo risposta può generalmente essere misurato in sensoriale e interneuroni. Attività dei neuroni motori richiede tecniche più sofisticate per immagini negli animali in movimento. Qui presenteremo metodi dettagliati che impiegano i due tecniche più semplici di paralisi farmacologica e immobilizzazione rigida con agarosio. I metodi presentati qui possono essere usati per misurare l&#39;attività neuronale e fisiologia cellulare in C. elegans. Diamo un esempio di ciascuna: utilizzando GCaMP per misurare la risposta sensoriale del neurone ASJ ad un campo elettrico esterno, e utilizzando cameleon per misurare la risposta fisiologica di calcio al danno laser di un neurone. Questi esempi mostrano i vantaggi e gli inconvenienti dei due tipi di fluorofori e illustrare cosa è possibile con il sistema.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eclipse Ti-U inverted 
 microscope</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Intensilight HG Illuminator</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>C-HGFI</td>
 <td>Fluorescent light source</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CFI Plan Apo VC 60X Oil</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical table or 3'X3' optical 
 grade breadboard</td>
 <td>Thor Labs</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>If an optical table is not used an 
 optical grade breadboard on a 
 solid laboratory bench should 
 suffice.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clara Interline Camera</td>
 <td>Andor 
 Technology</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>High-sensitivity CCD camera</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>wtGFP Longpass Emission</td>
 <td>Chroma Technology 
 Corp.</td>
 <td>41015</td>
 <td>GFP filter set for imaging GCaMP</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter 440 +/- 10 nm</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>D440/20x EX</td>
 <td>excitation filter for cameleon</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichroic mirror &gt; 455 nm 
 longpass</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>455DCLP BS</td>
 <td>microscope dichroic for cameleon 
 imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichroic mirror &gt; 515 nm 
 longpass</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>515DCLP BS</td>
 <td>dichroic mirror for cameleon 
 imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter 535 +/- 15 nm</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>D535/30m EM</td>
 <td>YFP emission filter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter 480 +/- 20 nm</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>D485/40m EM</td>
 <td>CFP emission filter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lens, 200 mm, Achromat</td>
 <td>Thor Labs</td>
 <td>AC508-200-A1</td>
 <td>Relay lens for FRET optics (3)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silver broadband mirror</td>
 <td>Thor Labs</td>
 <td>ME2S-P01</td>
 <td>FRET optics (2)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NGM buffer</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Levamisole</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polybead Microspheres</td>
 <td>Polysciences, Inc.</td>
 <td>08691-10, 2.5% by 
 volume, 50 nm 
 diameter</td>
 <td>polystyrene nanoparticles for C. 
 elegans immobilization</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transgenic strain, Strain 
 gpa-9::GCaMP3(in pha-1; 
 him-5 bkg) </td>
 <td>Sternberg Lab</td>
 <td>Strain PS6388</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transgenic strain, mec- 
 4::YC3.60</td>
 <td>Gabel Lab</td>
 <td>Strain CG1B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

in vivo neuronal calcium imaging in c. elegans

Il verme nematode C. elegans è un organismo modello ideale per relativamente semplice, a basso costo di imaging neuronale in vivo. Suo piccolo corpo trasparente e semplice, ben caratterizzato sistema nervoso consente l&#39;identificazione e l&#39;imaging di fluorescenza di ogni neurone all&#39;interno dell&#39;animale intatto. Tecniche di immobilizzazione semplici con un impatto minimo sulla fisiologia dell&#39;animale consentono esteso time-lapse imaging. Lo sviluppo di geneticamente codificati fluorofori calcio sensibili come cameleon 1 e 2 permettono GCaMP immagini in vivo di calcio neuronale relative sia fisiologia cellulare e l&#39;attività neuronale. Numerosi ceppi transgenici che esprimono questi fluorofori in neuroni specifici sono prontamente disponibili o possono essere costruiti utilizzando tecniche ben consolidate. Qui si descrivono le modalità dettagliate per la misura della dinamica del calcio all&#39;interno di un singolo neurone in vivo usando sia GCaMP e cameleon. Discutiamo vantaggi e disadvantetà di entrambi, nonché vari metodi di preparazione del campione (immobilizzazione animale) e analisi di immagine. Infine, vengono presentati i risultati di due esperimenti: 1) Uso GCaMP per misurare la risposta sensoriale di un neurone specifico ad un campo elettrico esterno e 2) Uso cameleon misurare la risposta fisiologica di calcio di un neurone laser a danni traumatici. Tecniche di imaging di calcio come questi sono ampiamente utilizzati in C. elegans e sono stati estesi alle misure in animali liberi di muoversi, i neuroni contemporaneamente e confronto tra background genetico. C. elegans presenta un sistema robusto e flessibile per imaging in vivo neuronale con vantaggi rispetto ad altri sistemi modello semplicità tecnica e costo.

Qui vi presentiamo i risultati di due esperimenti separati. Il primo impiega GCaMP misurare la risposta di un neurone specifico a uno stimolo sensoriale definito esterno, dando un buon esempio di come reporter di calcio fluorescenti può essere utilizzato per monitorare l&#39;attività neuronale in otticamente intatta C. elegans. Il secondo impiega cameleon misurare il calcio intracellulare transiente attivato entro un neurone in risposta al danno laser specifico, illustrando così come fisiologia calcio può e...

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In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Con il suo piccolo corpo trasparente, ben documentato neuroanatomia e una serie di tecniche genetiche suscettibili e reagenti,<em&gt; C. elegans</em&gt; Rende un organismo modello ideale per<em&gt; In vivo</em&gt; Di imaging neuronale utilizzando relativamente semplici, tecniche a basso costo. Qui si descrive l&#39;imaging singolo neurone in animali adulti intatti usando geneticamente codificati indicatori di calcio fluorescenti.

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

24.8K Views.  Boston University School of Medicine. Con il suo piccolo corpo trasparente, ben documentato neuroanatomia e una serie di tecniche genetiche suscettibili e reagenti, C. elegans Rende un organismo modello ideale per In vivo Di imaging neuronale utilizzando relativamente semplici, tecniche a basso costo. Qui si descrive l'imaging singolo neurone in animali adulti intatti usando geneticamente codificati indicatori di calcio fluorescenti.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Ricerca

Neuroscienze

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

In vivo Laser assotomia in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Le risposte di imaging neuronale in preparazione Fetta di organo vomeronasale Esprimere un sensore di calcio geneticamente codificato

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and medical applications. Strengths of fluorescence include its sensitivity, specificity, and compatibility with live imaging. Unfortunately, conventional forms of fluorescence microscopy suffer from one major weakness, diffraction-limited resolution in the imaging plane, which hampers studies of structures with dimensions smaller than ~250 nm. Recently, this limitation has been overcome with the introduction of super-resolution fluorescence microscopy techniques, such as photoactivated localization microscopy (PALM). Unlike its conventional counterparts, PALM can produce images with a lateral resolution of tens of nanometers. It is thus now possible to use fluorescence, with its myriad strengths, to elucidate a spectrum of previously inaccessible attributes of cellular structure and organization.
Unfortunately, PALM is not trivial to implement, and successful strategies often must be tailored to the type of system under study. In this article, we show how to implement single-color PALM studies of vesicular structures in fixed, cultured neurons. PALM is ideally suited to the study of vesicles, which have dimensions that typically range from ~50-250 nm. Key steps in our approach include labeling neurons with photoconvertible (green to red) chimeras of vesicle cargo, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a high-resolution PALM image. We also demonstrate the efficacy of our approach by presenting exceptionally well-resolved images of dense-core vesicles (DCVs) in cultured hippocampal neurons, which refute the hypothesis that extrasynaptic trafficking of DCVs is mediated largely by DCV clusters.

We describe how to implement photoactivated localization microscopy (PALM)-based studies of vesicles in fixed, cultured neurons. Key components of our protocol include labeling vesicles with photoconvertible chimeras, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a super-resolution image.

Super-Resolution Imaging di vescicole neuronali Dense-core

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

In Vivo Imaging di Dauer-specifica neuronale ritocca in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

In Vivo cervello Imaging funzionale approccio basato sul calcio bioluminescente Indicatore GFP-equorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its completely mapped nervous system and transparent anatomy, presents an ideal model for understanding real-time neural dynamics using calcium indicators. In combination with microfluidic technologies and experimental designs, calcium-imaging studies using these indicators are performed in both free-moving and trapped animals. However, most previous studies utilizing trapping devices, such as the olfactory chip described in Chronis et al., have devices designed for use in the more common hermaphrodite, as the less common male is both morphologically and structurally dissimilar. An adapted olfactory chip was designed and fabricated for increased efficiency in male neuronal imaging with using young adult animals. A turn was incorporated into the worm loading port to rotate the animals and to allow for the separation of the individual neurons within a bilateral pair in 2D imaging. Worms are exposed to a controlled flow of odorant within the microfluidic device, as described in previous hermaphrodite studies. Calcium transients are then analyzed using the open-source software ImageJ. The procedure described herein should allow for an increased amount of male-based C. elegans calcium imaging studies, deepening our understanding of the mechanisms of sex-specific neuronal signaling.

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of an adapted &#34;olfactory chip&#34; for the efficient calcium imaging of C. elegans males is described here. Studies of male exposure to glycerol and a pheromone are also shown.

Tramite un Chip olfattiva di microfluidica adattato per l'Imaging dell'attività neuronale in risposta ai feromoni in neuroni di testa maschio C. Elegans

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Raziometrici calcio Imaging di singoli neuroni nel comportarsi Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and neurodegenerative disease across species. Although these neurotoxic challenges have long been considered to be cell-intrinsic, considerable evidence now supports that misfolded human disease proteins originating in one neuron can appear in neighboring cells, a phenomenon proposed to promote pathology spread in human neurodegenerative disease.
C. elegans adult neurons that express aggregating proteins can extrude large (~4 &#181;m) membrane-surrounded vesicles that can include the aggregated protein, mitochondria, and lysosomes. These large vesicles are called &#8220;exophers&#8221; and are distinct from exosomes (which are about 100x smaller and have different biogenesis). Throwing out cellular debris in exophers may occur by a conserved mechanism that constitutes a fundamental, but formerly unrecognized, branch of neuronal proteostasis and mitochondrial quality control, relevant to processes by which aggregates spread in human neurodegenerative diseases.
While exophers have been mostly studied in animals that express high copy transgenic mCherry within touch neurons, these protocols are equally useful in the study of exophergenesis using fluorescently tagged organelles or other proteins of interest in various classes of neurons.
Described here are the physical features of C. elegans exophers, strategies for their detection, identification criteria, optimal timing for quantitation, and animal growth protocols that control for stresses that can modulate exopher production levels. Together, details of protocols outlined here should serve to establish a standard for quantitative analysis of exophers across laboratories. This document seeks to serve as a resource in the field for laboratories seeking to elaborate molecular mechanisms by which exophers are produced and by which exophers are reacted to by neighboring and distant cells.

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

This protocol describes approaches for detection and quantitation of large aggregate and/or organelle extrusions (~4 &#181;m) produced by C. elegans cells in the form of membrane-bound exophers. We describe strains, growth conditions, scoring criteria, timing, and microscopy considerations needed to facilitate dissection of this debris expulsion mechanism.