Matteo O&#39;Sullivan e Fei Zhou sono destinatari di Australian National Health and Medical Research Council Borse di studio post-laurea la ricerca medica.

Attenta considerazione deve essere data primer e di progettazione della sonda. Tutte le sequenze a disposizione degli obiettivi di interesse da database GenBank, come dovrebbe essere utilizzato per identificare le aree conservate che sono obiettivi adatti. Dove un gran numero di obiettivi vengono amplificate in un test di MPCR singole, ciascuna sequenza amplificata devono essere di lunghezza simile, e non deve superare i 300 paia di basi di evitare la concorrenza. Un&#39;applicazione alternativa del metodo è quello di amplificare un obiettivo più a lungo utilizzando primer contro le regioni conservate e di utilizzare più sonde per identificare variazione di sequenza nel amplicone. In questo caso, il prodotto amplificato PCR può essere più lungo. Temperature di ricottura fondo dovrebbero essere tutti simili, con condizioni di PCR adeguati di conseguenza. Primer che formano una forte struttura secondaria o dimero primer deve essere evitato. La Sigma Aldrich DNA calcolatrice ( <a href="http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp">http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp</a> ) può essere usata per predire in modo affidabile queste caratteristiche. Sonde di DNA deve essere progettato per avere ricottura temperature prossime a 60 ° C. Per massimizzare la specificità, due sonde per ogni target di interesse possono essere inclusi nel saggio, una ibridazione per il filamento di DNA in avanti adiacente al sito fondo inverso vincolante, e l&#39;altro al filone invertire adiacente al sito primer forward vincolanti. In questo caso, entrambi i primers avanti e indietro deve essere biotina-modificato. Se solo una sonda per bersaglio amplificato viene utilizzato, allora solo un innesco necessario biotina modificato. Nella progettazione di primer e sonde per la MPCR / RLB saggio è fortemente consigliato di utilizzare metodi in silico per prevedere i prodotti di PCR e ibridazione sonda correlati con i risultati in vitro. Idealmente questo viene fatto usando ceppi per i quali la sequenza del genoma completo è disponibile. Software come FastPCR (disponibile presso http://primerdigital.com/fastpcr.html) può essere utilizzato per questo scopo. Segnale della sonda debole o assente è possibile prevedere dove in analisi in silico indica discordanze coppia di basi con conseguente temperature basse sonda ricottura. Tecniche di estrazione del DNA varia a seconda dei campioni testati, e le condizioni di PCR sarà dipendente da disegno primer. I lettori si riferiscono a pubblicazioni su test individuali per ulteriori informazioni riguardanti l&#39;estrazione del DNA e reagenti PCR e le condizioni di 1-19. Ogni test viene eseguito con i controlli appropriati alle fornire almeno un segnale positivo e uno negativo per ciascuna sonda sonda sulla membrana, così come un DNA senza controllo. Inoltre è utile per includere una sonda nella parte superiore della membrana che dovrebbe essere positivo per tutti i campioni (per esempio: una specie o genere sonda specifica nel caso di un microrganismo). Questo serve come una sonda di controllo positivo, ma permette anche un facile orientamento dei risultati. 1. Preparazione di membrane <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni: <ul><li> 100ml NaHCO3 0,5 M (pH 8,4) </li><li> 100 ml 0.5M NaHCO 3 </li><li> 20 ml EDAC 16% </li><li> 250 ml di NaOH 0,1 M </li><li> 250 ml 2xSSPE </li><li> 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - posto a bagnomaria a 60 ° C </li><li> 250 ml di 20 mM EDTA. </li></ul></li><li> Preriscaldare il forno a 60 ° C. </li><li> Pulire il Miniblotter Immunetics con il 70% di etanolo. </li><li> Diluire le sonde oligonucleotidiche in 0,5 M NaHCO 3 a una concentrazione finale di 2 pmol / mL e un volume di 200 l. </li><li> Tagliare una membrana di nylon BiodyneC a cm 15x15. Usando una matita e righello, regola off di 0,5 cm di spazio in alto di membrana e scrivere dettagli qui. </li><li> Membrana di tenuta in sacchetto di plastica con 20 ml di soluzione EDAC appena fatto il 16% e il rock a temperatura ambiente per 10 minuti. </li><li> Lavare membrana in acqua deionizzata per 30 secondi. </li><li> Membrana posto in miniblotter con canali che attraversano la membrana (parallela alla linea di matita). Mettere cuscino di supporto al suo posto e carta assorbente vicino. Aspirare il liquido dai canali. </li><li> Compila corsie 1 e 45 con 150 microlitri 0,5 M NaHCO 3. Utilizzare 150 ml di ogni soluzione sonda a riempire corsie 2-44 in sequenza, facendo attenzione ad evitare bolle d&#39;aria. Se una bolla d&#39;aria è presente nel canale, mantenendo la pipetta in posizione, rapidamente aspirare la soluzione per consentire la bolla d&#39;aria a salire in cima alla pipetta, poi riprovare. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. </li><li> Aspirare soluzioni sonda, rimuovere membrane e lavare in 250 ml 0,1 M NaOH a temperatura ambiente per 9 minuti. </li><li> Lavare membrana in 250 ml 2xSSPE per 30 secondi. </li><li> Lavare membrana in 250 ml preriscaldata 2xSSPE/0.1% SDS in forno a 60 ° C per 5 minuti. </li><li> Se non viene utilizzato per l&#39;ibridazione immediatamente, lavare membrana in 240 ml di 20 mM EDTA a temperatura ambiente per 20 minuti (riservando 10ml rimanente), poi sigillare membrana in sacchetto di plastica con altri 10 ml di 20 mM EDTA e Store in frigo a 4 ° C. </li><li> Lavare con miniblotter Pyroneg detergente e pennello. Risciacquare e lasciare asciugare. </li></ol> 2. Ibridazione e rilevazione <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni: <ul><li> 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - conservare in bagno d&#39;acqua a 60 ° C. </li><li> 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - conservare in bagno d&#39;acqua a 60 ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - conservare in forno a 42 ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE - conservare a temperatura ambiente </li><li> 500 ml 1% SDS - conservare in bagno d&#39;acqua a 60 ° C inizialmente (per la fase 3) </li><li> 250 ml di 20 mM EDTA - conservare a temperatura ambiente (per la fase 3). </li></ul></li><li> Accendere un forno a 60 ° C e un forno a 42 ° C. Portare l&#39;acqua a bollire in un recipiente di grandi dimensioni su piastra. </li><li> Immunetics pulito Miniblotter con il 70% di etanolo. </li><li> Aliquota 10 ml di 2xSSPE/0.1% SDS in un piccolo contenitore. Aggiungere 20 ml di ciascun prodotto PCR di 150 microlitri SDS 2xSSPE/0.1% in provette numerate. </li><li> Fate bollire i prodotti di PCR per 10 minuti a 100 ° C utilizzando titolari polistirolo. Mettere in ghiaccio immediatamente per almeno 5 minuti. </li><li> Lavare membrana rimanenti 240 ml 2xSSPE/0.1% SDS a 60 ° C forno per 5 minuti. </li><li> Membrana posto in miniblotter con cuscino supporto. Orientare in modo da eseguire canali in senso verticale (perpendicolare alla linea di matita). </li><li> Aspirazione liquido in eccesso dai canali miniblotter. </li><li> Aggiungi restanti 150 microlitri SDS 2xSSPE/0.1% ai canali e cognome. Aggiungi bollito prodotti di PCR per i restanti canali (2-44) in sequenza, facendo attenzione ad evitare bolle d&#39;aria. </li><li> Luogo miniblotter appartamento in forno a 60 ° C per 1 ora per consentire ibridazione di prendere posto. </li><li> Aspirare il liquido da ogni canale quindi rimuovere membrana da miniblotter. </li><li> Lavare due volte in 250 ml preriscaldata 2xSSPE/0.5% SDS a 60 ° C forno per 10 minuti. </li><li> Inumidire maglia di nylon che separano con 2xSSPE/0.5% SDS a 42 ° C e utilizzarlo per rimboccarsi membrana. </li><li> Luogo arrotolato membrana nel tubo a rulli, e dispiegare per assicurare membrana confina con la superficie interna. Aggiungere 3 ml streptavidina-perossidasi coniugato (Roche Applied Science) a 15 ml 2xSSPE/0.5% SDS a 42 ° C e aggiungere al rullo avvolgitore. Tappo a vite su e incubare in forno a rulli a 42 ° C per 60 minuti. Assicurare la direzione di tiro è tale che membrana non stringe. Controllare periodicamente la tenuta. </li><li> Lavare miniblotter in Pyroneg acqua e detergente, risciacquare e lasciare asciugare. </li><li> Rimuovere membrana da rullo avvolgitore. Lavare due volte nella restante 2xSSPE/0.5% SDS a 42 ° C per 10 minuti. </li><li> Lavare due volte in 2xSSPE a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Girare forno fino a 80 ° C e luogo 500ml 1% SDS in forno pre-caldo. </li><li> Portare 15 ml soluzione di rilevamento Amersham ECL (7,5 ml di soluzione A e 7,5 ml di soluzione B). Gettare 2xSSPE e aggiungere la soluzione di rilevazione. Roccia delicatamente a mano per 2 minuti, garantendo una copertura completa di membrana con la soluzione. Scartare la soluzione chemiluminescente. </li><li> Tagliare due fogli di plastica trasparente per adattarsi cartuccia esposizione. Membrana tra i due fogli e cartucce in luogo di esposizione. </li><li> Procedere alla camera oscura. Sotto la luce rossa, aggiungere pellicola ECL rilevamento di cartuccia ed esporre per 5 minuti. Dog-ear nell&#39;angolo inferiore destro del film dopo la rimozione per consentire il corretto orientamento durante la visualizzazione. </li><li> Sviluppare la pellicola con lo sviluppatore automatizzati o bagni chimici come istruzioni del produttore per il. </li><li> Ripetere l&#39;esposizione con tempi di esposizione più o meno lungo, se necessario. </li></ol> 3. Rigenerazione della membrana <ol><li> Lavare membrana in 250 ml 1% SDS a 80 ° C per 30 minuti due volte. </li><li> Lavare membrana in 240 ml di 20 mM EDTA a temperatura ambiente per 15 minuti. </li><li> Membrana di tenuta in sacchetto di plastica con 10 ml di 20 mM EDTA e conservare in frigorifero a 4 ° C per il futuro riutilizzo. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: I risultati sono migliori viste mettendo il film su una griglia stampata, oppure la scansione l&#39;immagine e l&#39;importazione in un software come BioNumerics (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgio). Ogni risultato sonda dovrebbe essere interpretato con riferimento alle sonde di controllo positivo e negativo. I risultati sono migliori classificati come negativo, debolmente o positivo. Risultati positivi sono dove il segnale è forte come o più forte la sonda di controllo positivo. Risultati negativi sono dove il segnale è assente o uguale al controllo negativo (nel caso di segnale di fondo). I risultati sono deboli dove il segnale è più debole la sonda di controllo positivo, ma più forte rispetto al controllo negativo. Risultati debole può essere il risultato di mutazioni puntiformi che porta al legame della sonda deboli, o per non specifici segnali di formazione innesco dimero. Utilizzando due sonde per target di interesse in grado di migliorare la specificità, in cui un unico risultato debole può tranquillamente essere interpretato come non specifico segnale. Se qualche dubbio rimane, un unico complesso reazione di PCR può essere eseguita con gel a base di rilevazione e sequenziamento di qualsiasi amplificatorelified prodotto per determinare se il risultato è veramente positivo. Un risultato rappresentativo è mostrato in figura 2. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Il MPCR / RLB principi (P1) Punto 1.9. Amine sonde modificate sono legati covalentemente a una membrana di nylon. (P2) Passo 2.10. Biotina modificati prodotti di PCR sono ibridate alle sonde. (P3) Passo 2.14. Streptavidina, marcato con perossidasi, è incubato con la membrana e si lega alla biotina. (P4) Piazza di 2,19-2,21. Perossidasi catalizza una reazione nei reagenti di rilevazione ECL, producendo luce a cui la luce sensibilità di una pellicola esposta. La membrana viene poi lavata per il riutilizzo. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Rappresentante MPCR / RLB risultato. I campioni da 1 a 6 rappresentano i controlli positivo - tra di essi vi è almeno un segnale della sonda positivo per ciascuna delle 43 sonde. Ogni sequenza bersaglio (da A a U) viene rilevato con due sonde differenti per massimizzare la specificità. Sonde A1 e A2 rappresentano specie sonde specifiche che dovrebbero essere positivo per ogni campione e assistere orientare il film. Sonda A1 si ripete in fondo la membrana. I campioni 7 e 8 sono controlli negativi. Si noti che Q1 sonde, Q2, T1 e T2 hanno segnale nei controlli negativo, indicando probabile legame aspecifico dei primer o dimero prodotto primer. Ri-progettazione di queste sonde o primer sarebbe necessario. Sonde C1, D1 e F1 mostrare striature attraverso la membrana probabilmente a causa di alcuni non-specifico di assorbimento della streptavidina-perossidasi coniugato e substrato chemiluminescente, tuttavia questo è facilmente distinguibile dal vero i segnali positivi della sonda. Sonde D1 e D2 hanno segnale relativamente debole rispetto alle altre sonde, questo può essere dovuto al maggiore ampliconi che porta all&#39;amplificazione meno efficienti. Sonda J2 è negativo è diversi campioni (1, 3, 4, 6, 39) dove la sonda J1 è positivo. Questo molto probabilmente rappresenta una mutazione nel sito J2 vincolante per questi esempi.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il MPCR / RLB metodo permette la rilevazione simultanea di un gran numero di ampliconi della PCR. A causa della elevata sensibilità della sonda chemiluminescenza a base di rilevazione, una singola reazione di PCR multiplex con un gran numero di coppie di primer può essere utilizzato per amplificare il modello del DNA. Se nessun segnale della sonda si ottengono con uno o più campioni, eseguendo l&#39;elettroforesi su gel con tutti i prodotti rimanenti PCR può aiutare a distinguere se il problema è con l&#39;amplificazione PCR o ibridazione della sonda. Dove tutti i segnali della sonda sulla membrana sono deboli o assenti, ma elettroforesi su gel indica successo PCR, le possibilità sono problemi con l&#39;etichettatura della membrana, la rigenerazione non corretta della membrana dopo l&#39;uso precedente, le temperature non corretto durante l&#39;incubazione ibridazione o streptavidina, o difettoso streptavidina- perossidasi coniugato o reagenti di rilevamento. Se i campioni di controllo indicano che le sonde individuo può essere la produzione di falsi segnali negativi, PCR singola con gel a base di rilevazione e sequenziamento successive possono essere eseguite per verificare l&#39;amplificazione del prodotto PCR e per cercare variazione di sequenza nel sito di legame della sonda. Segnale della sonda debole o assente può essere dovuto alla dimensione amplicone di grandi dimensioni: se possibile, tutti ampliconi devono essere di lunghezza simile e meno di 300 bp. Le strutture secondarie del DNA di ampliconi può anche produrre vincolante poveri sonda, e potrebbe essere necessario ri-progettazione di primer. Primer o concentrazioni sonda può anche essere variata per ottimizzare la potenza del segnale. Falsi segnali positivi grazie alla sonda di legame del primer nonamplified o primer-dimero prodotto può essere indagato eseguendo singole PCR con gel a base di rilevazione e la sequenza successiva. In questo caso, riprogettazione delle sonde possono risultare necessarie. Mutazioni puntiformi nei siti di legame della sonda può portare a segnali deboli o assenti. Permettere due sonde per ogni prodotto amplificato rende questo facile da individuare. Questa caratteristica può essere sfruttata con primer e attenta progettazione della sonda per rilevare piccole variazioni di sequenza del DNA bersaglio. In sintesi, mentre ci sono molti metodi di prodotto reazioni PCR multiplex dopo la rilevazione disponibile, MPCR / RLB ha il vantaggio di essere high-throughput e poco costoso, con bassi costi di setup. La flessibilità del metodo ne consenta l&#39;uso in una vasta gamma di applicazioni.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> 5 &#39;ammina C6 modificato sonde oligonucleotidiche </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-8875 </td><td> 0,5 M soluzione di fatto fino a pH 8,4 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td> 0,1 M soluzione </td></tr><tr><td> 20xSSPE tampone </td><td> Amresco </td><td> 0810-4L </td><td></td></tr><tr><td> Di sodio dodecil solfato (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L-4390 </td><td> Make up soluzione madre al 10%, non in autoclave, devono essere conservati per un massimo di 1 settimana prima di utilizzare </td></tr><tr><td> Etilendiamminotetraacetico acido (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td> Portare la soluzione 0,5 M a pH 8.0 e autoclave </td></tr><tr><td> N-(3-dimetilamminopropil)-N &#39;-ethylcarbodiimide cloridrato (EDAC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7750 </td><td> Portare a 20 ml di soluzione al 16% al momento dell&#39;uso con 3,2 g EDAC e 18 ml di acqua Millipore </td></tr><tr><td> BiodyneC 0,45 micron a membrana in nylon 20x20 centimetri </td><td> PALL scienze della vita </td><td> 74480C </td><td></td></tr><tr><td> Deionizzata, acqua depurata </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pyroneg detersivo liquido </td><td> Johnson Diversey </td><td> HH12291 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidina-perossidasi coniugato </td><td> Roche </td><td> 11 089 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL rilevamento reagenti </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL rilevamento reagenti </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Pellicole per lucidi OHP </td><td> Corporate Express </td><td> EXP 504 OHP </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL hyperfilm ad alte prestazioni film di chemiluminescenza 18x24 cm </td><td> GE Healthcare </td><td> 28906837 </td><td></td></tr><tr><td> Ghiaccio </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Materiali di consumo utilizzati nel MPCR / RLB test. <table border="1"><tbody><tr><th> Attrezzatura </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Forni Shake&#39;n&#39;Stack Hybaid (2) bottiglia di rotolamento e nylon mesh separazione </td><td> Thermo Scientific </td><td> HBSNSRS220 </td><td> Metodo può essere eseguito con un singolo forno fino a quando non vi è impianto per il mantenimento di soluzioni a 42 ° C e 60 ° C prima dell&#39;uso </td></tr><tr><td> La Danzatrice del ventre oscillante </td><td> Stovall scienze della vita </td><td> Euro BDbo </td><td></td></tr><tr><td> Miniblotter </td><td> Immunetics </td><td> Mn100-45 </td><td></td></tr><tr><td> Bagnomaria </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Aspirazione </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Placca di cottura </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> L&#39;esposizione della cartuccia </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z36 ,009-0 </td><td></td></tr><tr><td> X-ray film sviluppatore </td><td></td><td></td><td> È anche possibile utilizzare sviluppo, fissaggio e acqua in vaschette in una stanza buia, invece di automazionesviluppatore. Lumino-imager può anche essere usato al posto della pellicola Xray </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Apparecchiature necessarie per il MPCR / RLB test.

multiplex pcr and reverse line blot hybridization assay (mpcr/rlb)

Multiplex PCR / Reverse Blot test Linea ibridazione permette di rilevare fino a 43 bersagli molecolari in 43 campioni con una reazione multiplex PCR seguita da ibridazione sonda su una membrana di nylon, che è riutilizzabile. Le sonde sono 5 &#39;amina modificato per consentire la fissazione alla membrana. Primer sono 5 &#39;biotina modificato che permette di individuare i prodotti di PCR ibridato con streptavidina-perossidasi e di un substrato chemiluminescente tramite pellicola fotosensibile. Con l&#39;installazione e bassi costi di consumo, questa tecnica è poco costoso (circa US $ 2 per esempio), ad alto rendimento (membrane multiple possono essere trattati contemporaneamente) e ha un breve periodo di tempo di risposta (circa 10 ore). La tecnica può essere utilizzata in diversi modi. Sonde multiple possono essere progettati per rilevare variazione di sequenza all&#39;interno di un singolo prodotto amplificato, o più prodotti possono essere amplificati simultaneamente, con uno (o più) sonde per il rilevamento successive. Una combinazione di entrambi gli approcci possono essere utilizzati anche all&#39;interno di un singolo test. La possibilità di includere sonde multiple per una sequenza bersaglio unico rende il test altamente specifici. Applicazioni pubblicate su MPCR / RLB comprendono il rilevamento di 1,2 geni di resistenza agli antibiotici, la digitazione di Staphylococcus aureus resistente alla meticillina 3-5 e Salmonella sp 6, sierotipizzazione molecolare di 7,8 Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae 9 e enterovirus 10,11, identificazione di Mycobacterium sp 12, il rilevamento di 13-15 genitale e le vie respiratorie 16 e altri 17 agenti patogeni e la rilevazione e l&#39;identificazione delle Mollicutes 18. Tuttavia, la versatilità della tecnica significa che le applicazioni sono praticamente illimitate e non limitato ad analisi molecolare di microrganismi. I cinque passi in MPCR / RLB sono: a) Primer e il design della sonda, b) estrazione del DNA e PCR amplificazione c) Preparazione della membrana, d), ibridazione e rilevazione, ed e) La rigenerazione della membrana.

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Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

Un poco costoso, metodo throughput elevato per il rilevamento simultaneo di fino a 43 bersagli molecolari è descritto. Applicazioni di MPCR / RLB comprendono digitando microbica e la rilevazione di agenti patogeni multipli da campioni clinici.

PCR multiplex e Reverse Blot Assay Linea Hybridization (MPCR / RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

multiplex-pcr-and-reverse-line-blot-hybridization-assay-mpcrrlb

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

43.3K Views.  University of Sydney. Un poco costoso, metodo throughput elevato per il rilevamento simultaneo di fino a 43 bersagli molecolari è descritto. Applicazioni di MPCR / RLB comprendono digitando microbica e la rilevazione di agenti patogeni multipli da campioni clinici.

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Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based medicine and/or its carrier may elicit cellular toxicity. For assessment of such cytotoxicity, a common methodology is largely dependent upon utilization of the 3-(4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay which has been widely used as a colorimetric approach based on the activity of mitochondrial dehydrogenase enzymes in cells. In this current investigation, MCF-7 cells were inoculated in 96-well plate and at 50% confluency they were treated with different nanopolyplexes and subjected to MTT assay after 24 hours. Water soluble yellow MTT is metabolized by the metabolically active cells to the water insoluble purple formazan, which is further dissolved in dimethylsulfoxide and Sornson s buffer pH 10.5. The resultant product can be quantified by spectrophotometry using a plate reader at 570 nm.

The MTT assay is an easy and reproducible colorimetric assay for evaluation of cell viability based on reduction of yellow MTT and production of water insoluble purple formazan. Here, the viability of MCF-7 cells upon treatment of nanogenomedicine has been evaluated.

Tossicità cellulare di Nanogenomedicine in MCF-7 Linea Cell: saggio MTT

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Ricerca

Biologia

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitativa Real-Time PCR utilizzando il Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable concentration level. But the design of conventional PCR thermocycling hardware, predominantly based on massive metal heating blocks whose temperature is regulated by thermoelectric heaters, severely limits the achievable reaction speed1. Considerable electrical power is also required to repeatedly heat and cool the reagent mixture, limiting the ability to deploy these instruments in a portable format.
Thermal convection has emerged as a promising alternative thermocycling approach that has the potential to overcome these limitations2-9. Convective flows are an everyday occurrence in a diverse array of settings ranging from the Earth's atmosphere, oceans, and interior, to decorative and colorful lava lamps. Fluid motion is initiated in the same way in each case: a buoyancy driven instability arises when a confined volume of fluid is subjected to a spatial temperature gradient. These same phenomena offer an attractive way to perform PCR thermocycling. By applying a static temperature gradient across an appropriately designed reactor geometry, a continuous circulatory flow can be established that will repeatedly transport PCR reagents through temperature zones associated with the denaturing, annealing, and extension stages of the reaction (Figure 1). Thermocycling can therefore be actuated in a pseudo-isothermal manner by simply holding two opposing surfaces at fixed temperatures, completely eliminating the need to repeatedly heat and cool the instrument.
One of the main challenges facing design of convective thermocyclers is the need to precisely control the spatial velocity and temperature distributions within the reactor to ensure that the reagents sequentially occupy the correct temperature zones for a sufficient period of time10,11. Here we describe results of our efforts to probe the full 3-D velocity and temperature distributions in microscale convective thermocyclers12. Unexpectedly, we have discovered a subset of complex flow trajectories that are highly favorable for PCR due to a synergistic combination of (1) continuous exchange among flow paths that provides an enhanced opportunity for reagents to sample the full range of optimal temperature profiles, and (2) increased time spent within the extension temperature zone the rate limiting step of PCR. Extremely rapid DNA amplification times (under 10 min) are achievable in reactors designed to generate these flows.

We describe a novel method to perform DNA replication via the polymerase chain reaction (PCR). Thermal convection is harnessed to continuously shuttle reagents between denaturing, annealing, and extension conditions by maintaining opposing surfaces of the reactor at constant temperature. This inherently simple design promises to make rapid PCR more accessible.

Rapido PCR termici utilizzando microscala convezione termica

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

DNA microarray: Esempio di controllo della qualità, ibridazione e scansione di array

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

Conversione di un ELISA Capture ad un saggio Luminex xMAP utilizzando un anticorpo Multiplex metodo di screening

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Un test per Lateral Rigenerazione Line in Zebrafish adulti

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Analisi qPCRTag - A High Throughput, Real Time PCR Assay per Sc2.0 genotipizzazione

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus biology. In the latter respect, the recent discovery of a non-structural AAV protein, termed assembly-activating protein (AAP), has shed new light on the processes involved in assembly of the viral capsid VP proteins into a capsid. Although many AAV serotypes require AAP for assembly, we have recently reported that AAV4, 5, and 11 are exceptions to this rule. Furthermore, we demonstrated that AAPs and assembled capsids of different serotypes localize to different subcellular compartments. This unexpected heterogeneity in the biological properties and functional roles of AAPs among different AAV serotypes underscores the importance of studies on AAPs derived from diverse serotypes. This manuscript details a straightforward dot blot assay for AAV quantitation and its application to assess AAP dependency and serotype specificity in capsid assembly. To demonstrate the utility of this dot blot assay, we set out to characterize capsid assembly and AAP dependency of Snake AAV, a previously uncharacterized reptile AAV, as well as AAV5 and AAV9, which have previously been shown to be AAP-independent and AAP-dependent serotypes, respectively. The assay revealed that Snake AAV capsid assembly requires Snake AAP and cannot be promoted by AAPs from AAV5 and AAV9. The assay also showed that, unlike many of the common serotype AAPs that promote heterologous capsid assembly by cross-complementation, Snake AAP does not promote assembly of AAV9 capsids. In addition, we show that the choice of nuclease significantly affects the readout of the dot blot assay, and thus, choosing an optimal enzyme is critical for successful assessment of AAV titers.

This manuscript details a straightforward dot blot assay for quantitation of adeno-associated virus (AAV) titers and its application to study the role of assembly-activating proteins (AAPs), a novel class of non-structural viral proteins found in all AAV serotypes, in promoting the assembly of capsids derived from cognate and heterologous AAV serotypes.

Una quantitativa Dot Blot Assay AAV titolazione e suo uso per la valutazione funzionale di Virus Adeno-associato Assembly-attivazione proteine

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This approach is appropriate for examining physiological changes in target gene expression levels. However, absolute quantification using better statistical analysis is preferable for a comprehensive assessment of gene expression levels. Absolute quantification is still not in common use. This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using RT-qPCR with or without pre-amplification.
A fixed volume (200 &#181;L) of EDTA-plasma was prepared from the blood collected from the femoral vein of conscious cynomolgus monkeys (n = 50). Total RNA was extracted using commercially available system. Plasma miRNAs were quantified by probe-based RT-qPCR assays which contains miRNA-specific forward/reverse PCR primer and probe. Standard curves for absolute quantification were generated using commercially available synthetic RNA oligonucleotides. A synthetic cel-miR-238 was used as an external control for normalization and quality assessment. The miRNAs that showed quantification cycle (Cq) values above 35 were pre-amplified prior to the qPCR step.
Among the 8 miRNAs examined, miR-122, miR-133a, and miR-192 were detectable without pre-amplification, whereas miR-1, miR-206, and miR-499a required pre-amplification because of their low expression levels. MiR-208a and miR-208b were not detectable even after pre-amplification. Sample processing efficiency was evaluated by the Cq values of the spiked cel-miR-238. In this assay method, technical variation was estimated to be less than 3-fold and the lower limit of quantification (LLOQ) was 102 copy/&#181;L, for most of the examined miRNAs.
This protocol provides a better estimate of the quantity of plasma miRNAs, and allows quality assessment of corresponding data from different studies. Considering the low number of miRNAs in body fluids, pre-amplification is useful to enhance detection of poorly expressed miRNAs.

This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using quantitative real-time reverse transcription PCR with or without pre-amplification. This protocol affords better understanding of the quantity of plasma miRNAs and allows qualitative assessment of corresponding data from different studies or laboratories.

Quantificazione assoluta dei livelli di MicroRNA del Plasma nella scimmia cynomolgus, mediante trascrizione d'inversione quantitativa Real-Time PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust technologies that measure RNA biomarkers in situ in clinical specimens. While grind-and-bind assays like RNAseq and quantitative RT-PCR enable highly sensitive gene expression measurements, they also require RNA extraction and thus prevent valuable expression analysis within the morphological tissue context. The in situ hybridization (ISH) assay described here can detect RNA target sequences as short as 50 nucleotides at single-nucleotide resolution and at the single-cell level. This assay is complementary to the previously developed commercial assay and enables sensitive and specific in situ detection of splice variants, short targets, and point mutations within the tissue. In this protocol, probes were designed to target unique exon junctions for two clinically important splice variants, EGFRvIII and MET&#916;14. The detection of short target sequences was demonstrated by the specific detection of CDR3 sequences of T-cell receptors &#945; and &#946; in the Jurkat T-cell line. Also shown is the utility of this ISH assay for the distinction of RNA target sequences at single-nucleotide resolution (point mutations) through the visualization of EGFR L858R and KRAS G12A single-nucleotide variations in cell lines using automated staining platforms. In summary, the protocol shows a specialized RNA ISH assay that enables the detection of splice variants, short sequences, and mutations in situ for manual performance and on automated stainers.

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Here, we describe an in situ hybridization assay which enables sensitive and specific detection of sequences as short as 50 nucleotides with single-nucleotide resolution at the single-cell level. The assay, which can be performed manually or automatically, can enable visualization of splice variants, short sequences, and mutations within the tissue context.

Visualizzazione di varianti genetiche, gli obiettivi di brevi e mutazioni puntiformi nel contesto morfologico del tessuto con una determinazione del RNA In Situ di ibridazione