Il nostro protocollo faciliterebbe lo studio delle strutture neuronali dal circuito alle scale dei componenti, che è essenziale per una migliore comprensione delle funzioni cerebrali. La nostra tecnica di compensazione, ScaleSF, esercita una potente capacità di compensazione, nonché un alto livello di conservazione dei tessuti che è necessario per la visualizzazione simultanea di strutture su larga e piccola scala. Il nostro protocollo è particolarmente efficace nel cervello dove le cellule neuronali mostrano processi elaborati, collegamenti tremendi e organizzano strutture subcellulari fini specializzate.
Prima di iniziare l'esperimento, preparare le soluzioni Sca/eS come mostrato in questa tabella e coprire i campioni con un foglio. Iniziare la procedura aggiungendo otto millilitri ciascuno di soluzioni ScaleS0 e ScaleS4 a due pozzetti separati di una piastra di coltura cellulare a sei pozzi e preriscaldare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore. Trasferire le fette di cervello nella soluzione ScaleS0 preriscaldata con una spatola e incubare le fette per due ore a 37 gradi Celsius in un incubatore vibrante a 90 RPM.
Quindi, trasferire le fette di cervello permeabilizzate in otto millilitri di PBS meno in una piastra di coltura cellulare a sei pozzetti e lavare per 15 minuti mantenendo uno shaker orbitale a 40-60 RPM. Ripetere questo passaggio due volte. Quindi, trasferire le fette di cervello in otto millilitri di soluzione ScaleS4 preriscaldata e incubare per otto-12 ore a 90 RPM a 37 gradi Celsius.
Per la preparazione della camera, stampa in 3D il telaio della camera e gli adattatori dello stadio del microscopio. Fissare il telaio della camera a una slitta di copertura utilizzando un adesivo sensibile alla pressione. Preparare l'1,5% di agarosio in soluzione ScaleS4D25(0).
Mescolare la soluzione e microonde fino a quando l'agarosio è completamente sciolto. Quindi lasciare raffreddare la soluzione a 37 gradi Celsius. Montare la fetta di cervello cancellata sul coperchio inferiore della camera di imaging con una spatola.
Rimuovere la soluzione in eccesso dalla fetta eliminata utilizzando un fazzoletto pulito. Aggiungere il gel ScaleS4 alla fetta di cervello utilizzando una micropipetta per riempire la camera di imaging. Posiziona un altro coperchio sopra con una pinza seguita da un pezzo di carta velina e un vetrino.
Trasferire la camera di imaging in un frigorifero a quattro gradi Celsius. Posizionare i pesi metallici sul vetrino e lasciarli per 30 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere il materiale dalla camera di imaging e rimuovere il gel in eccesso.
Posizionare la camera di imaging in una capsula di Petri di vetro da 60 millimetri e fissare il bordo della camera di imaging in più punti alla parabola con un adesivo sensibile alla pressione. Versare la soluzione ScaleS4 nel piatto e agitare delicatamente per un'ora a 40-60 RPM a 20-25 gradi Celsius. Sostituire con soluzione fresca e rimuovere le bolle d'aria sulla superficie del gel raschiando delicatamente la superficie utilizzando una punta di pipetta.
Montare la camera di imaging su uno stadio del microscopio. Preparare un microscopio a scansione laser confocale dotato di una lente obiettivo multi-immersione di 2,5 millimetri di distanza di lavoro, ingrandimento 16x e apertura numerica 0,60. Accendi tutte le apparecchiature di imaging pertinenti, come la workstation, il microscopio, lo scanner, i laser, la lampada al mercurio e avvia un software di imaging.
Impostare il collare di correzione dell'obiettivo multi-immersione su 1,47. Immergere l'obiettivo nella soluzione e lasciarlo avvicinare lentamente alla fetta. Rimuovere tutte le bolle d'aria intrappolate sulla punta della lente dell'obiettivo.
Trova le regioni di interesse nei tessuti eliminati usando l'epifluorescenza. Per impostare i parametri di acquisizione dell'immagine, in primo luogo, determinare la profondità di bit per l'acquisizione dell'immagine man mano che la dimensione dell'immagine aumenta con il bit. Quindi impostare la lunghezza d'onda di rilevamento in base allo spettro di emissione.
Impostare la risoluzione XY, la velocità di scansione e le dimensioni del foro stenopeico. Regolare anche la potenza del laser, il guadagno dell'amplificatore del rilevatore e l'offset fino a ottenere un'immagine adatta. Determinare la dimensione del titolo in base alle dimensioni del ROI, assicurando che l'intera lunghezza e larghezza del ROI vengano acquisite.
Naviga attraverso il tessuto in tutti i piani e imposta l'inizio e gli endpoint dello stack. Impostare la dimensione del gradino Z, in base alla risoluzione Z desiderata. Raccogli le immagini ed elaborale utilizzando un software di analisi delle immagini.
Utilizzando questo protocollo, è stata ottenuta la compensazione ottica di una fetta di cervello di topo di un millimetro di spessore. L'espressione di EGFP nella corteccia cerebrale dei topi PV-FGL ha mostrato che la fluorescenza e l'integrità strutturale dei tessuti sono state preservate. Le aberrazioni indotte dalla mancata corrispondenza dell'indice di rifrazione hanno causato una notevole perdita di luminosità dell'immagine e risoluzione dei neuroni positivi EGFP.
Questi neuroni sono stati chiaramente visualizzati con il microscopio a scansione laser confocale quando il collare di correzione è stato regolato per adattarsi a questa soluzione ScaleS4. La ricostruzione 3D dei neuroni marcati EGFP nella corteccia somatosensoriale primaria del topo è stata eseguita in una fetta di cervello spessa un millimetro. Singoli pergole dendritiche decorate con spine dendritiche sono state viste a un ingrandimento più elevato.
Anche l'arborizzazione terminale degli assoni e i bouton assonali sono stati osservati nelle fette. La corrispondenza dell'indice riflettente tra il fluido di imaging e la lente dell'oggetto è fondamentale per l'imaging 3D nei tessuti disboscati. La nostra tecnica faciliterebbe l'integrazione della struttura dei neuroni dal circuito alle scale dei componenti, fornendo approfondimenti sui meccanismi neuronali, informazioni sull'elaborazione nel cervello.
