Per caratterizzare completamente un fenotipo microgliale, è importante affrontare la motilità sia basale che direzionale. Questo protocollo può essere utilizzato per testare la motilità direzionale delle microglia mediante imaging a due fotoni nelle fette cerebrali dei topi, utilizzando un'interfaccia di stampa 3D personalizzata e camere di perfusione. A dimostrare la procedura saranno Fanny Etienne, dottorando, e Vincenzo Mastriolia, ricercatore post-dottorato, entrambi dei nostri laboratori.
Almeno 30 minuti prima della dissezione, iniziare a gorgogliare 70 millilitri di liquido cerebrospinale artificiale colina, o colina aCSF, sul ghiaccio. Aggiungere 150 millilitri di colina aCSF a 32 gradi Celsius, con carbogeno. Mettere un piatto cristallizzante da 200 millilitri con un magnete a barre in una scatola alimentare sigillata e aggiungere 200 millilitri di aCSF al piatto.
Posizionare un supporto per fette di interfaccia stampato in 3D sopra il piatto e rimuovere il liquido in eccesso dalla piastra cristallizzante, fino a quando rimane solo una sottile pellicola di soluzione che copre la rete del supporto della diapositiva dell'interfaccia. Aggiungere alcuni millimetri di aCSF nella parte inferiore della scatola alimentare e iniziare a gorgogliare il fluido con carbogeno. Quindi, chiudere la scatola sigillata mantenendo una carburazione costante per creare una camera di interfaccia umidificata, 95% ossigeno e 5% ricca di anidride carbonica.
Dopo la raccolta, posizionare il cervello su un pezzo di carta filtrante imbevuta di ACSF e sezionare la regione di interesse, in base all'angolo di affettamento preferito. Per le fette coronali, posizionare e incollare la faccia caudale del cervello su una piastra di Petri di 10 centimetri attaccata al blocco di taglio di un filtro affettatrice vibrante e posizionare il blocco nella camera del serbatoio dell'affettatrice vibrante all'interno di una grande camera piena di ghiaccio. Riempire il piatto con colina ghiacciata aCSF e utilizzare l'affettatrice per ottenere fette cerebrali spesse 300 micrometri, utilizzando una pipetta di trasferimento monouso di quattro millimetri di diametro dopo ogni passaggio della lama per raccogliere ogni fetta.
Lasciare che ogni fetta si riprenda nella colina aCSF aCSF di 32 gradi Celsius per circa 10 minuti dopo che è stata ottenuta, prima di trasferire le fette su pezzi di carta per la pulizia delle lenti, condita con una goccia di colina aCSF. Quindi aspirare l'eccesso di colina aCSF e utilizzare una spatola per trasferire le fette sulla mesh della camera di interfaccia, consentendo alle fette di recuperare in questo ambiente per almeno 30 minuti. 30 minuti prima di iniziare la registrazione, collegare la pompa peristaltica a una camera di registrazione personalizzata con perfusione superiore e inferiore per ottimizzare l'ossigenazione e la vitalità delle fette di tessuto e pulire l'intero sistema di perfusione con 50 millilitri di acqua ultrapura.
Al termine del ciclo di pulizia, avviare la perfusione della camera di registrazione con 50 millilitri di aCSF in un bicchiere di vetro sotto costante carbogenazione e utilizzare una pipetta monouso a trasferimento a bocca larga per trasferire la prima fetta da imageizzare sul becher per rimuovere la carta dell'obiettivo. Quando la sezione è affondata nella parte inferiore del becher, trasferire la sezione nella camera di registrazione e posizionare il supporto della fetta sulla fetta per ridurre al minimo il movimento indotto dal flusso di perfusione. Usa l'illuminazione a campo luminoso per indirizzare la regione cerebrale di interesse con un ingrandimento da cinque a 10x.
Quindi, utilizzare un obiettivo 25x con un obiettivo ad immersione in acqua 0,35x per regolare la posizione del campo visivo. Utilizzare l'illuminazione a fluorescenza per localizzare le celle microgliali fluorescenti e riempire la pipetta con 10 microlitri di aCSF contenenti il composto di interesse alla sua concentrazione finale. Puntare la punta verso il basso con delicati scuotimenti per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate nella punta e montare la pipetta riempita in un supporto per pipette collegato a una siringa da cinque millilitri con lo stantuffo posizionato in posizione di cinque millilitri e montato su un micromanipolatore a tre assi.
Abbassare delicatamente la pipetta verso la fetta, controllando e regolando l'obiettivo contemporaneamente, fino a quando la punta della pipetta tocca leggermente la superficie della fetta. Ora sintonizza il laser e passa il microscopio alla modalità multifotono. Assicurarsi che la camera sia schermata da qualsiasi sorgente luminosa e accendere i rilevatori non descanned.
Imposta il guadagno e usa una tabella di ricerca con un limite superiore codificato a colori per evitare di saturare i pixel nell'immagine. Quindi, iniziare a registrare per una durata totale di almeno 30 minuti, deprimendo lentamente lo stantuffo della siringa dalla posizione da cinque a un millilitro, dopo cinque minuti, per un periodo di cinque secondi, per applicare il composto alla sezione. Per l'analisi delle immagini, eseguire prima la proiezione z e la correzione della deriva con ImageJ sul file di interesse.
Quindi, aprire il file modificato in Icy e disegnare una regione circolare di diametro di 35 micrometri di interesse, centrata sul sito di iniezione. Esegui di nuovo il film con il ROI, per assicurarti che sia ben posizionato. Quindi, utilizzare il plug-in di evoluzione dell'intensità dell'intensità dell'area di interesse per misurare l'intensità media nel tempo nell'area di interesse e salvare i risultati come file xls.
Questo protocollo consente di misurare le risposte indotte da diversi composti, come l'ATP o la serotonina. Sebbene l'iniezione di ATP suscite un aumento della fluorescenza, dopo la maggior parte delle iniezioni di ATP, c'è una diminuzione immediata e leggera della fluorescenza a causa della distorsione tissutale che torna dopo pochi minuti. La dimensione della regione di interesse influisce anche sulla quantificazione, poiché l'aumento del diametro riduce la variabilità tra gli esperimenti, ma diminuisce l'accuratezza e l'entità della risposta rilevata.
La valutazione della risposta microgliale in un determinato momento può essere utile per il confronto statistico di diversi composti o per testare gli effetti di specifici antagonisti aggiunti alla soluzione di perfusione. Per quantificare la motilità in tre dimensioni, sappiate che potrebbe essere necessario modificare l'intervallo z-step e la frequenza di campionamento dell'acquisizione per adattarla ai requisiti di analisi.
