Desideriamo ringraziare M. Scullion e R. Crisp delle Tecnologie Idaho per il supporto tecnico e la USGS occidentale Centro di Ricerca Ecologica per il finanziamento (S. Schwarzbach) e assistenza (K. Spragens, T. Graham). Questa ricerca è stata effettuata sotto l&#39;egida del Centro per la Tecnologia Innovativa - Istituto per la Difesa e Sicurezza Nazionale (www.idhs.org), a sostegno del Dipartimento della Difesa e Air Force Research Laboratory. Trattamento degli animali seguiti protocolli approvati dalla cura degli animali e del Comitato utilizzo del Centro geologico degli Stati Uniti occidentali Survey Research ecologica e permette il Geological Survey degli Stati Uniti Uccello Banding laboratorio. Qualsiasi utilizzo di nomi commerciali, prodotti o società in questa pubblicazione è solo a fini descrittivi e non implica approvazione da parte del governo degli Stati Uniti.

1. La cattura di uccelli selvatici con reti mist <ol><li> Per la cattura shorebird, istituito reti nebbia in un sito attivo foraggiamento come una palude, litorale, o fango piatto. </li><li> Far scorrere la linea tramagli anelli di una delle estremità della rete nebbia attorno al palo e inserire palo verticalmente nel fango. </li><li> Stendi la rete, inserire il secondo polo attraverso cicli tramagli all&#39;altra estremità della rete di nebbia e verticalmente inserire palo in fango, assicurandosi che le linee tramaglio viene insegnato. </li><li> Una volta un uccello viene catturato, estrarre l&#39;uccello dalla rete e tornare alla stazione di bande. </li></ol> 2. Cloacali tampone di campionamento <ol><li> Raccogliere tamponi cloacali subito dopo la cattura </li><li> Individuare la cloaca e l&#39;uso punta delle dita per spingere indietro le piume circostanti </li><li> Scartare una sterile in dacron o in poliestere con punta tampone, gambo fine prima, e inumidire la punta con sterili mezzi di trasporto virale per una maggiore facilità di tampone. Dopo umidificazione, l&#39;intera testa del tampone viene delicatamente inserito nella cloaca. Tampone la circonferenza interna della cloaca lentamente twirling il tampone e rimuovere il tampone da cloaca. </li><li> Inserendo la punta del tampone direttamente nella fiala di trasporto campione virale media; ruotare l&#39;albero tampone tra il pollice e l&#39;indice, mentre il tampone è nella media. Sono un assistente completare la procedura di tirando la punta del bastoncino indietro dal fondo della fiala ~ 1 cm e tagliare l&#39;albero del tampone con un paio di forbici in modo da la punta del tampone rimane nel flaconcino e l&#39;albero non interferisce con tappo di chiusura. Cap fiala ermeticamente. Disinfettare le forbici con l&#39;alcol tra taglio alberi tampone. </li><li> Mettere le fiale in una scatola congelatore contenente ghiaccio secco o impacchi di ghiaccio. </li></ol> 3. Orofaringea tampone di campionamento <ol start="1"><li> Aprire delicatamente il becco in modo che la fessura delle coane è visibile </li><li> Scartare un tampone pulito dal pacchetto, gambo fine prima, e inumidire la punta con mezzi di trasporto virale per una maggiore facilità di tampone </li><li> Senza toccare la punta di altre superfici, inserirlo nella bocca e tamponare l&#39;apertura delle coane sul tetto della bocca e proseguire verso la regione orofaringea o della gola </li><li> Posizionare la punta del tampone direttamente nel flacone virale mezzi di trasporto. Ruotare l&#39;albero tampone tra il pollice e l&#39;indice, mentre il tampone è nella media. Come sopra, sono un assistente tirare la punta del bastoncino indietro dal fondo della fiala ~ 1 cm e tagliare l&#39;albero del tampone con un paio di forbici in modo da la punta del tampone rimane nel flaconcino e l&#39;albero non interferisce con cappuccio chiusura. Cap fiala ermeticamente. Disinfettare le forbici con l&#39;alcol tra taglio alberi tampone. </li><li> Mettere le fiale in una scatola congelatore contenente ghiaccio secco o impacchi di ghiaccio. </li></ol> 4. Uccello gestione e il rilascio <ol start="1"><li> Ritorno degli uccelli al sito di catturare e rilasciare in modo tempestivo (&lt;20 minuti). I gestori devono essere consapevoli dei principi di benessere degli animali e stare attenti per i segni di sofferenza durante il campionamento degli uccelli (per esempio abrasioni, la cattura miopatia e ipo-o ipertermia). Un kit di base di primo soccorso dovrebbe essere incluso nella lista allegata. </li></ol> 5. Collaudo impianti <ol start="1"><li> I campioni possono essere testati in uno spazio chiuso come un rimorchio di ricerca o tenda, con un alimentatore (tensione regolata generatore di corrente) per eseguire l&#39;unità di PCR e computer collegato. </li></ol> 6. Estrazione di RNA <ol start="1"><li> Estrazione di RNA è stata effettuata con il kit RNeasy Mini con piccole modifiche alle istruzioni del produttore seguenti Spackman et al 1. </li><li> Vortex mezzo tampone per 3-5 s ed il trasferimento 350 microlitri di una provetta da 2 ml. Nota: tenere campione resto sul ghiaccio in caso di PCR-positivi i campioni devono essere ricontrollati, H5 o test deve essere eseguito. </li><li> Aggiungere 350 ml di tampone RLT (con β-me) e vortex per 5 s. </li><li> Aggiungere 350 ml di etanolo RNA grado 70%. </li><li> Centrifugare a 5000 xg per 5 min. </li><li> Aggiungere 600 ml di supernatante a una colonna di spin posto in un tubo di raccolta da 2 ml. Conservare il campione rimanente in rack provetta. </li><li> Centrifugare per 20 s a 10.000 xg ed eliminare flow-through. </li><li> Ripetere i passaggi 17-18 fino a tutto il campione è stato passato attraverso colonna. </li><li> Luogo Spin Column in un ambiente pulito 2 ml di tubo di raccolta. </li><li> Aggiungere 700 ml di tampone RW1 alla colonna e centrifugare rotazione 25 s a 10.000 x g. Gettare il flow-through. </li><li> Aggiungere 500 microlitri di buffer RPE alla colonna di spin e centrifugare per 25 s a 10.000 x g. Gettare il flow-through. </li><li> Ripetere il punto 22 per un totale di due lavaggi con tampone RPE. </li><li> Centrifugare la colonna girare per altri 2 minuti a 14.000 x g. Eliminare Collection Tube. </li><li> Posizionare la colonna girare in un ambiente pulito microcentrifuga 1,5 ml di tubo e aggiungere 50μl di acqua priva di nucleasi. Incubare a temperatura ambiente per 60 s. </li><li> Eluire RNA dal giro per 60 s a 10.000 XGFo 60 s. Luogo purificato campione sul ghiaccio. </li></ol> 7. Preparazione controlli negativi <ol start="1"><li> Reagenti liofilizzati sono stati predisposti per essere utilizzati nel test PCR in base alle istruzioni del Technologies Idaho Freeze-Dried kit reagenti di rilevamento per l&#39;influenza A sonde TaqMan Obiettivo 1 (Asay-ASY-0109). </li><li> Centrifuga fiala reagente di controllo negativo (rosso) per 3 s per assicurarsi pellet sono in fondo. </li><li> Togliere il tappo, visivamente fare pellet che sono in fondo. </li><li> Aggiungere 20 ml di tampone di ricostituzione X 2 e 20 l di acqua grado reagente. </li><li> Riassunto e vortex per 5 s alla massima velocità. </li><li> Centrifugare per 3 s per portare liquidi a fondo del flacone. </li><li> Controllare visivamente il pellet è reidratato, se non ripetere i passaggi 31-32. </li><li> Pipettare 19 ml di miscela idratata in un tubo capillare LightCycler, ripetere il passaggio in una pipetta capillare secondo per ottenere un duplicato. </li></ol> 8. Preparazione di campioni <ol start="1"><li> Centrifugare le provette sconosciuto reagente (blu) per 3 secondi per assicurare pellet sono in fondo. </li><li> Togliere il tappo, visivamente fare pellet che sono in fondo. </li><li> Aggiungere 40 ml di RNA purificato. </li><li> Riassunto e vortex per 5 s alla massima velocità. </li><li> Centrifugare per 3 s per portare liquidi a fondo del flacone. </li><li> Controllare visivamente il pellet è reidratato, se non ripetere i passaggi 38-39. </li><li> Pipettare 19 ml di miscela idratata in un tubo capillare LightCycler, ripetere il passaggio in una pipetta capillare secondo per ottenere un duplicato. </li></ol> 9. Preparazione di controlli positivi <ol start="1"><li> Centrifugare il positivo fiala reagente di controllo (verde) per 3 s per assicurarsi pellet sono in fondo. </li><li> Togliere il tappo, visivamente fare pellet che sono in fondo. </li><li> Aggiungere 20 ml di tampone di ricostituzione X 2 e 20 l di acqua grado reagente. </li><li> Riassunto e vortex per 5 s alla massima velocità. </li><li> Centrifugare per 3 s per portare liquidi a fondo del flacone. </li><li> Controllare visivamente il pellet è reidratato, se non ripetere i passaggi 45-46. </li><li> Pipettare 19 ml di miscela idratata in un tubo capillare LightCycler, ripetere il passaggio in una pipetta capillare secondo per ottenere un duplicato. </li></ol> 10. Centrifugazione dei tubi capillari <ol start="1"><li> Una volta che tutti i tubi capillari per la partita sono stati preparati caricarli nel mini-centrifuga dotati di adattatori capillare. </li><li> Centrifugare a valore più basso tenendo premuto il pulsante di impulsi verso il basso per 1 s. Questo trasferimento di liquido sul fondo, in preparazione per il test. </li></ol> 11. Funzionamento del RAPID <ol start="1"><li> Creare un nuovo file. Etichetta di controllo positivo, controllo negativo, e campioni (per il loro numero ID). </li><li> Programma 1: Tenere campioni di RNA di preparazione <ol><li> Cicli = 1 </li><li> Modalità di analisi = Nessuno </li><li> Temperatura target = 40 </li><li> Tempo di incubazione = 30 min </li><li> Temperatura di transizione Rate = 20 ° C / s (default) </li><li> Obiettivo secondario di temperatura = 0 (default) </li><li> Step Size = 0 (default) </li><li> Ritardo passo = 0 (default) </li><li> Modalità di acquisizione = Nessuno (default) </li></ol></li><li> Programma 2: RNA Denaturazione <ol><li> Cicli = 1 </li><li> Modalità di analisi = Nessuno </li><li> Temperatura target = 94 </li><li> Tempo di incubazione = 120s </li><li> Temperatura di transizione Rate = 20 ° C / s (default) </li><li> Obiettivo secondario di temperatura = 0 (default) </li><li> Step Size = 0 (default) </li><li> Ritardo passo = 0 (default) </li><li> Modalità di acquisizione = Nessuno (default) </li></ol></li><li> Programma 3: Amplificazione dell&#39;RNA <ol><li> Cicli = 45 </li><li> Modalità di analisi = Auto Analisi </li><li> Obiettivo di temperatura, Segmento 1 = 94; Segmento 2 = 60 </li><li> Tempo di incubazione, Segmento 1 = 0 s, Segmento 2 = 20 s </li><li> Vota la temperatura di transizione, Seg 1 &amp; 2 = 20 ° C / s (default) </li><li> Temperatura target secondarie, Seg 1 &amp; 2 = 0 (default) </li><li> Dimensione passo, Seg 1 &amp; 2 = 0 (default) </li><li> Passo di ritardo, Seg 1 &amp; 2 = 0 (default) </li><li> Modalità di acquisizione, Segmento 1 = Nessuno; Segmento 2 = singolo </li></ol></li><li> Parametri fluorescenza <ol><li> Modalità di visualizzazione: fluorescenza canale 2 (CH2 / 1) Guadagni: <ol><li> Cap. 1 (F1) = 1 </li><li> Cap. 2 (F2) = 8 </li><li> Cap. 3 (F3) = 1 </li></ol></li><li> Per visualizzare i dati di fluorescenza in tempo reale per ogni campione, selezionare il campione di interesse e clicca sul pulsante &#39;Grafico Show&#39; nella parte inferiore dello schermo </li></ol></li><li> Per ogni capillare, i risultati sono i seguenti: <ul><li> # - Identifica la posizione carosello della giostra </li><li> Nome del campione - fornisce il nome del campione </li><li> Controllo - identifica il tipo di campione per ogni campione </li><li> Score - calcolato con il rapporto tra fluorescenza del campione e il livello di fluorescenza di fondo nel campione </li><li> Risultato - visualizza il risultato complessivo per il campione </li></ul></li></ol> 12. Rappresentante dei risultati: Presenti: Un rosso chiamata &#39;presente&#39; per un test / campione incognito indica che l&#39;obiettivo è stato identificato nel campione e che i controlli sono stati positivi. Non rilevato: un verde &#39;non rilevato&#39; appello per una prova / campione incognito indica che l&#39;obiettivo non è stato identificato nel campione e che i controlli di test hanno avuto successo. Si prega di ripetere: A &#39;ripetere&#39; indica che il controllo positivo o negativo non è riuscito. Un esempio di analisi di successo dal RAPID 7200 è mostrata in Figura 4. Il controllo positivo è amplificato e genera fluorescenza rilevabile (asse y) a circa 25 cicli (asse x). Un ciclo soglia (CT)&gt; 35 è il cut-off concordato per la maggior parte dei laboratori di riferimento AIV. Pertanto, i controlli positivi di questo metodo ha prodotto un segnale fluorescente entro il numero accettato di cicli (0-35) per il rilevamento AIV. Al contrario, il controllo negativo non genera un segnale fluorescente, anche dopo 45 cicli. Allo stesso modo, i dodici campioni raccolti da piovanelli occidentale non ha generato un segnale fluorescente che indica che gli uccelli sono risultati negativi per AIV. Follow-up test di tutti i campioni positivi in ​​un laboratorio tradizionale è incoraggiato a garantire che nessun falsi positivi sono erroneamente prodotte. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Shorebird la cattura con reti nebbia. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. La raccolta dei campioni cloacali e orofaringei almeno piovanelli. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Programmazione del RAPID 7200 per l&#39;amplificazione di RNA. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Fluorogram generati dal RAPID 7200 portatile rRT-PCR mostra come controlli positivi e negativi dovrebbe comparire in un test di successo. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2829/2829fig4large.jpg">Clicca qui per visualizzare l&#39;immagine full size</a>

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	<li>Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+real-time+reverse+transcriptase+PCR+assay+for+type+A+influenza+virus+and+the+avian+H5+and+H7+hemagglutinin+subtypes.">Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes.</a> J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).</li><li>Takekawa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+detection+of+avian+influenza+virus+in+wild+birds:+evaluation+of+a+portable+rRT-PCR+system+and+freeze-dried+reagents.">Field detection of avian influenza virus in wild birds: evaluation of a portable rRT-PCR system and freeze-dried reagents.</a> J Virol Methods. 166, 92-97 (2010).</li><li>Das, A., Spackman, E., Senne, D., Pedersen, J., Suarez, D. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+inter-species+transmission+and+geographic+subdivision+in+avian+influenza+viruses+from+wild+birds.+Virology.">Frequent inter-species transmission and geographic subdivision in avian influenza viruses from wild birds. Virology.</a> , 383-3156 (2009).</li><li>Macken, C. A., Webby, R. J., Bruno, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype+turnover+by+reassortment+of+replication+complex+genes+from+avian+influenza+A+virus.">Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus.</a> J Gen Virol. 87, 2803-2815 (2006).</li><li>Dugan, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+genetics+and+emergence+of+avian+influenza+viruses+in+wild+birds.">The evolutionary genetics and emergence of avian influenza viruses in wild birds.</a> PLoS Pathog.. 4, e1000076-e1000076 (2008).</li><li>Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+analyses+of+type+A+influenza+genes+in+natural+reservoir+species+in+North+America+reveals+genetic+variation.">Phylogenetic analyses of type A influenza genes in natural reservoir species in North America reveals genetic variation.</a> Virus Res. 114, 89-100 (2005).</li><li>Pasick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+molecular+based+techniques+for+the+diagnosis+and+characterization+of+avian+influenza+virus+infections..">Advances in the molecular based techniques for the diagnosis and characterization of avian influenza virus infections..</a> Transbound Emerg Dis. 55, 329-338 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OIE+Manual+of+diagnostics+tests+and+vaccines+for+terrestrial+animals+(mammals,+birds+and+bees).">OIE Manual of diagnostics tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees).</a> 1, 258-269 (2004).</li><li>Weber, T. P., Stilianakis, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecologic+immunology+of+avian+influenza+(H5N1)+in+migratory+birds.">Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds.</a> Emerg. Infect. Dis. 13, 1139-1143 (2007).</li><li>Kim, J. -. K., Negovetich, N. J., Forrest, H. L., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ducks:+the+"Trojan+Horses"+of+H5N1+influenza.">Ducks: the "Trojan Horses" of H5N1 influenza.</a> Influenza and Other Respiratory Viruses. , 121-128 (2009).</li><li>Gilbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flying+over+an+infected+landscape:+distribution+of+highly+pathogenic+avian+influenza+H5N1+risk+in+South+Asia+and+satellite+tracking+of+wild+waterfowl.">Flying over an infected landscape: distribution of highly pathogenic avian influenza H5N1 risk in South Asia and satellite tracking of wild waterfowl.</a> Ecohealth. , (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo di diagnosi rapida qui presentati facilita test rapido ed accurato di campioni di uccelli selvatici per la sorveglianza di AIV. Il tanto meno severi requisiti campione di storage portatili rRT-PCR sono adatti per le situazioni in cui la manutenzione a distanza di una catena del freddo può essere impraticabile se spedizionieri azoto liquido o ghiaccio secco non è disponibile. Inoltre, abbiamo riscontrato che l&#39;analisi del campione con i reagenti liofilizzati era abbastanza semplici per essere eseguite da ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> RNeasy mini rotazione della colonna </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Incluso nel kit RNeasy Mini </td></tr><tr><td> Provette di raccolta (1,5 e 2 ml) </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Incluso nel kit RNeasy Mini </td></tr><tr><td> Buffer RLT </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Incluso nel kit RNeasy Mini </td></tr><tr><td> Buffer RW1 </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Incluso nel kit RNeasy Mini </td></tr><tr><td> Buffer RPE </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Incluso nel kit RNeasy Mini </td></tr><tr><td> RNasi-free acqua </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Incluso nel kit RNeasy Mini </td></tr><tr><td> 14,3 M β-mercaptoetanolo soluzione </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP176100 </td><td></td></tr><tr><td> 100% di etanolo </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9602322 </td><td></td></tr><tr><td> Vortex Genie 2, 120V </td><td> Settori scientifico </td><td> SI-0236 </td><td></td></tr><tr><td> Taqman Influenza A Obiettivo 1 (Sonda idrolisi) </td><td> Idaho Technologies </td><td> Asay-ASY-0109 </td><td></td></tr><tr><td> LightCycler tubi capillari 20ml </td><td> Roche Applied Science </td><td> 04929292001 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-centrifuga con rotore per 2 ml provette </td><td> Idaho Technologies </td><td></td><td> Incluso nel kit RAPID </td></tr><tr><td> Ruggedized Advanced Device identificazione dei patogeni (RAPID) 7200 </td><td> Idaho Technologies </td><td></td><td> Incluso nel kit RAPID </td></tr><tr><td> Pentium portatile con Windows XP Professional </td><td> Idaho Technologies </td><td></td><td> Incluso nel kit RAPID </td></tr><tr><td> LightCycler Analisi dei dati del software </td><td> Idaho Technologies </td><td></td><td> Incluso nel kit RAPID </td></tr></tbody></table>

rapid diagnosis of avian influenza virus in wild birds: use of a portable rrt-pcr and freeze-dried reagents in the field

Gli uccelli selvatici sono stati implicati nella diffusione dell&#39;influenza aviaria altamente patogena (HPAI) del sottotipo H5N1, spingendo la sorveglianza lungo le rotte migratorie. Campionamento degli uccelli selvatici di virus dell&#39;influenza aviaria (AIV) è spesso condotto in regioni remote, ma i risultati sono spesso in ritardo a causa della necessità di trasportare i campioni a un laboratorio attrezzato per i test molecolari. In tempo reale della trascrittasi inversa reazione a catena della polimerasi (RRT-PCR) è una tecnica molecolare che offre uno dei metodi più accurati e sensibili per la diagnosi di AIV. I protocolli di laboratorio precedentemente indispensabile per rRT-PCR sono ora adattato per il campo. Sviluppo di reagenti liofilizzati (liofilizzato) che non richiedono catena del freddo, con sensibilità a livello di reagenti bagnato ha portato il collaudo in loco remoto ad un obiettivo pratico. Qui vi presentiamo un metodo per la diagnosi rapida di AIV nei volatili selvatici utilizzando un rRT-PCR unità (Ruggedized Advanced Device identificazione dei patogeni o RAPID, Tecnologie Idaho, Salt Lake City, UT), che impiega reagenti liofilizzati (Influenza A Obiettivo 1 Taqman; Asay -ASY-0109, Tecnologie Idaho). I reagenti contengono tutti i componenti necessari per il test a concentrazioni appropriate in un unico tubo: primer, sonde, enzimi, tamponi interni e controlli positivi, eliminando gli errori associati alla conservazione impropria o la manipolazione di reagenti bagnato. L&#39;unità portatile esegue uno schermo per l&#39;influenza A colpire il gene matrice rendimenti e dei risultati in 2-3 ore. Tipizzazione genetica è possibile anche con innesco H5 e H7 fissa che colpiscono il gene emoagglutinina. Il sistema è adatto per l&#39;uso su campioni cloacali e orofaringeo raccolti da uccelli selvatici, come dimostrato qui sulla specie migratrice shorebird, il piro-piro occidentale (Calidrus mauri) catturato nel nord della California. Trattamento degli animali seguiti protocolli approvati dalla cura degli animali e del Comitato utilizzo del Centro geologico degli Stati Uniti occidentali Survey Research ecologica e permette il Geological Survey degli Stati Uniti Uccello Banding laboratorio. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di accelerare la diagnosi degli uccelli selvatici, aumentando le probabilità di contenere un focolaio in una postazione remota. Sul posto la diagnosi sarebbe rivelarsi utile anche per individuare e studiare gli individui infetti nelle popolazioni selvatiche. La possibilità di raccogliere informazioni sulla biologia dell&#39;ospite (risposta immunologica e fisiologica alle infezioni) e l&#39;ecologia spaziale (prestazioni migratorie degli uccelli infetti) fornirà intuizioni sulla misura in cui gli uccelli selvatici possono fungere da vettori per AIV su lunghe distanze.

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Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Questo studio descrive la diagnosi dell&#39;influenza aviaria nei volatili selvatici utilizzando un portatile rRT-PCR sistema. Il metodo si avvale di liofilizzati reagenti per lo screening degli uccelli selvatici in un non-laboratorio di impostazione, tipica di uno scenario di un&#39;epidemia. L&#39;uso di strumenti molecolari fornisce alternative accurata e sensibile per la diagnosi rapida.

La diagnosi rapida del virus dell&#39;influenza aviaria nei volatili selvatici: l&#39;uso di un Portable rRT-PCR e liofilizzato reagenti nel campo

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

rapid-diagnosis-avian-influenza-virus-wild-birds-use-portable-rrt-pcr

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.6K Views.  USGS Western Ecological Research Center. Questo studio descrive la diagnosi dell'influenza aviaria nei volatili selvatici utilizzando un portatile rRT-PCR sistema. Il metodo si avvale di liofilizzati reagenti per lo screening degli uccelli selvatici in un non-laboratorio di impostazione, tipica di uno scenario di un'epidemia. L'uso di strumenti molecolari fornisce alternative accurata e sensibile per la diagnosi rapida.

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Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utilizzando Imaging Bioluminescent per Indagare il sinergismo tra Streptococcus pneumoniae E Influenza A virus in topi neonati

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

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Immunologia e infezioni

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.

A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

Sorveglianza dell&#39;influenza aviaria con FTA Carte: metodi per i campi, Biosicurezza, e problemi di trasporto Risolto

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

Forno a microonde Assist diagnosi rapida di malattie virali piante da microscopia elettronica a trasmissione

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Influenza Virus Propagazione in embrionate di pollo Uova

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-immunoprecipitazione della proteina mouse Mx1 con il virus nucleoproteina Influenza A

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Panni nasale per l&#39;influenza A rilevazione antivirus e isolamento da Suina

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrofili Isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro Smontaggio del virus influenzale A capsids per centrifugazione in gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Valutazione della efficacia e la tossicità degli RNA targeting HIV-1 Produzione per l&#39;uso in gene terapia farmacologica

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.