Ringraziamo Dibbits Bert per assistenza tecnica. L&#39;allevamento degli animali e il Gruppo Genomica, Università di Wageningen, Paesi Bassi, generosamente ci ha ospitato nel loro laboratorio. Il personale del Uccello Ottenby Observatory, in Svezia, si ringrazia per la cattura e il campionamento dei germani reali, in particolare Hellström Magnus, Marcus Danielsson, Christopher Magnusson e Stina Andersson. Ringraziamo Sanne Svensson, Jonatan Qvist e Per-Axel Gjöres per riprese a Ottenby, e Mano Camon per le riprese in laboratorio. Daniel Bengtson fornito fotografie anatra bello per la parte video di questa pubblicazione. Ulteriore materiale libero da la Biblioteca immagine CDC pubblica (PHIL; <a href="http://phil.cdc.gov/phil/">http://phil.cdc.gov/phil/</a> ) è stato utilizzato: il microscopio elettronico (n. 280; dal Dott. Erskine Palmer) e illustrazione (n. 11823; da Douglas Giordania) del virus dell&#39;influenza. Il sostegno finanziario è stato dato dal KNJV (Royal Paesi Bassi Hunters Association), il Ministero olandese dell&#39;Agricoltura, della Faunafonds e la Stichting de Trusts Eik (sia in Olanda), il Consiglio svedese della ricerca (Grant no. 2007-20774) e la CE -fondato Newflubird progetto. Prodotti chimici isolamento di RNA sono stati un dono generoso di Ambion, Inc, l&#39;azienda RNA. Questo è il contributo n. 245 dal Bird Ottenby Osservatorio.

1. Anatra trapping e tamponamento cloacali <ol><li> Trappola dabbling anatre del genere Anas (o di altri volatili) in una gabbia di attirarli con le anatre esca o cibo, e metterli in scatole di cartone individuale. Tempo di trasporto nella scatola dovrebbe essere ridotto al minimo, per esempio, con l&#39;installazione di una stazione di campo a breve distanza per la trappola. Circostanze logistiche possono variare in ogni studio. La consulenza e l&#39;approvazione del relativo animale comitato etico deve essere ricercata per ogni nuovo set-up. In alternativa, anche cacciatore di uccelli abbattuti si possono degustare. </li><li> Estrarre il anatra della scatola tenendo le ali stretto al suo corpo. Esempio di un dropping fresca, che sarà presente nella maggior parte dei casi, direttamente dalla parte inferiore della scatola. Raccoglierli con un tampone sterile e applicare il liquido ad una carta Whatman FTA. In caso contrario, eseguire tampone cloacale. </li><li> Accendere l&#39;anatra sulla sua schiena. Questo consente l&#39;accesso alla cloaca e facilita campionamento. La cloaca è una struttura sporgente situata sotto l&#39;addome, vicino alla base della coda. Una persona con esperienza poteva contenere l&#39;uccello e il campione, allo stesso tempo, oppure una seconda persona può aiutare. </li><li> Inserire con cautela il tampone sterile in plastica rayon (Copan, Italia) circa 1 cm e fare un dolce vortice della cloaca. Rotolare il tampone con i fluidi dalla cloaca sulla superficie di una carta Whatman FTA. Dopo il campionamento è stato effettuato l&#39;immediato rilascio degli animali è auspicabile. </li><li> Asciugare le carte FTA a temperatura ambiente per almeno 1 ora, quindi archiviare ogni campione singolarmente in sacchetti di carta (es. buste). Lo storage è possibile a temperatura ambiente, possibilmente con perline di silice nei climi umidi. L&#39;invio e la ricezione di biosicurezza istituzioni ufficiali &#39;può permettere di mandare le carte accordo di libero scambio per posta ordinaria, dal momento che i patogeni diventano inattivi a contatto con la superficie della carta FTA. </li></ol> 2. Isolamento di RNA virale <ol><li> Estrarre il materiale carta FTA tra cui feci / fluido cloaca. Punch tre dischi con un perforatore 2 millimetri Harris e luogo tutti coloro in un pozzo di una piastra di RNasi libero 96well. Tra ogni nuovo campione, pulire accuratamente il nemico con l&#39;alcol e una precisione Kim wipe (Kimtech). Usare sempre controlli positivi e negativi. Un controllo positivo può essere costituito da un ceppo di laboratorio appena applicato a una carta di accordo di libero scambio o di un campione naturale che è conosciuto per produrre un risultato positivo. Come controllo negativo, punch out dischi da una scheda vuota FTA. Inoltre, lasciare libero un altro pozzo per un controllo PCR dopo nel tuo esperimento (con l&#39;acqua come modello). </li><li> Aggiungere 70μl RNA soluzione di estrazione rapida (Ambion) e termosaldato la piastra (AbGene Thermo-Sealer). Incubare 5 minuti su un agitatore a temperatura ambiente con la velocità stabilito che non provoca spill-over (questo dipende dal modello di piastra utilizzata shaker; test in anticipo). </li><li> Carry isolamento virale RNA secondo protocolli del produttore con il MagMAX-96 Kit di isolamento virale RNA (Ambion). In breve: Aggiungere 130μl preparato lisi / soluzione vincolante (dal kit) in ogni pozzetto. Trasferire 50μl estratto materiale carta FTA in ciascun pozzetto. Agitare piastra per 1 minuto. </li><li> Aggiungere 20μl miscela preparata tallone (dal kit) per ogni campione e mescolare pipettando su e giù. Agitare sulla velocità determinato per 5 minuti. Molecole di RNA si legano al sfere magnetiche. </li><li> Spostare la piastra ad una magnetica a 96 pozzetti stand per catturare le sfere. A seconda del modello di supporto magnetico utilizzato, questo può richiedere più di 5 minuti. Quando la soluzione si è rivelata del tutto chiare, rimuovere e scartare il surnatante. Quindi rimuovere la piastra dal supporto magnetico. </li><li> Lavare le perle due volte con la soluzione di lavaggio 1 e due volte con soluzione di lavaggio 2 (dal kit). Per ognuna delle 4 fasi di lavaggio aggiungere 150μl soluzione preparata di lavaggio per ogni campione, agitare per 1 minuto a velocità determinata, spostare il piatto per il supporto magnetico, la cattura perline per circa 5 minuti (o fino a quando la soluzione è del tutto chiaro), rimuovere e scartare il surnatante. Quindi rimuovere la placca dalla base magnetica, aggiungere la soluzione successiva lavaggio, ed eseguire le fasi di lavaggio come in precedenza. Dopo la fase di lavaggio scorso, rimuovere soluzione di lavaggio per quanto possibile, e aria secca le perline a temperatura ambiente nello shaker piastra per 2 minuti. </li><li> Aggiungere 50μl di tampone di eluizione (dal kit) per liberare l&#39;RNA dalle perline e agitare per 4 minuti in agitatore. Cattura perle come descritto in precedenza. Il supernatante ora contiene l&#39;RNA isolato che è pronta per le applicazioni a valle. </li></ol> 3. RT-PCR di Matrix AIV Gene Effettuare PCR di trascrizione inversa (RT-PCR) con l&#39;accesso di uno stadio di RT-PCR system (Promega) in 25 microlitri reazioni (regolato da Kraus et al 18 e Fouchier et al 22..): <table border="1"><tbody><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 1.5μl </td></tr><tr><td> AMV / Tfl5 tampone </td&gt; <td> 5μl </td></tr><tr><td> dNTP </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> Primer M52C 22 (10 mM) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> Primer M253R 22 (10 mM) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> MgSO 4 (25 mM) </td><td> 7μl </td></tr><tr><td> AMV della trascrittasi inversa (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> Polimerasi TfL (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> RNA campione </td><td> 5μl </td></tr></tbody></table> Condizioni di PCR in un T1 Biometra termociclatore sono: la trascrizione inversa iniziale di 45 minuti a 45 ° C, seguito da 2 minuti denaturazione iniziale a 94 ° C e 40 cicli di: 94 ° C per 1 minuto, 56 ° C per 1 minuto, e 68 ° C per 2 minuti. Un allungamento altri 7 minuti a 68 ° C si conclude l&#39;amplificazione. 4. Screening per AI-I campioni positivi e Purificazione di frammenti mirate da Gel <ol><li> 2μl carico del prodotto della PCR mescolato con 2μl colorante carico 5x (BioRad) e l&#39;acqua 6μl su un 1% gel (Roche) colorato con bromuro di etidio 1% (2.5μl per 100 ml di gel) per un pre-screening. </li><li> Esegui il gel per 1 ora a 120V, con un formato standard di DNA (BioRad carico EZ 100 bp ladder), visualizzare con un sistema di documentazione del gel. Vedere un esempio in Figura 1. </li><li> Selezionare i campioni con frammenti amplificati nella gamma di dimensioni previste (tra 200 bp e 300 bp (frammento obiettivo è di 244 bp). Carico l&#39;intero volume di reazione di PCR (di cui ~ 23μl sono a sinistra) di questi candidati con 6μl colorante carico 5x su un 2 etidio bromuro% gel colorato e correre per 2 ore. </li><li> Posizionare il gel su un transilluminatore UV (Bioblock scientifico) e ispezionato visivamente. Vedere un esempio in Figura 2. Bande di accisa di dimensioni corrette da gel con un bisturi e posto in provette 1,5 ml individuali di reazione. Purificare frammenti di gel, per esempio con il Zymoclean Recovery Kit DNA Gel (Zymo Ricerca). </li></ol> 5. Sequenziamento ed identificazione dei prodotti PCR <ol><li> Effettuare Sanger sequenziamento dei frammenti di destinazione, ad esempio su un sequenziatore ABI 3730 capillare con ABI Big Dye 3,1 chimica (Applied Biosystems). Preparare reazioni di sequenziamento dei volumi 10μl contenente 10-20 ng gel purificato modello cDNA, buffer 1.75μl diluizione 5x, 0.5μl Big Dye premix V3.1, 1 fondo microlitri avanti (M52C 20, 10 mm) e ddH2O. Condizioni di ciclismo sono: 1 min denaturazione iniziale, seguita da 25 cicli di: 10 s a 96 ° C, 5 s a 45 ° C e 4 minuti a 60 ° C. Purificare e preparare la reazione di sequenziamento secondo i protocolli interni. </li><li> Identificare sequenze di cDNA risultante nei database nucleotidici come GenBank23, ad esempio strumenti web based come BLAST presso il Centro Nazionale for Biotechnology Information (NCBI, <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Germano reale (Anas platyrhynchos) sono state campionate in Ottenby Bird Observatory nel dicembre 2007. Da ogni germano reale su un campione FTA scheda è stato preso come descritto in questo protocollo. Dopo la spedizione, le carte FTA sono stati tenuti in un congelatore a -20 ° C per due anni. Lo stesso campione di carta FTA del laboratorio di isolare testato in Kraus et al. 18 è stato incluso come controllo positivo, così come nove dieci volte diluizioni seriali di esso. Due sono stati i controlli negativi) l&#39;estrazione da una scheda vuota accordo di libero scambio, per verificare se ci fosse riporto dal perforatore, e ii) RT-PCR, reazione in cui è stato utilizzato nucleasi acqua libera, come modello, per verificare se la contaminazione si è verificato durante o in preparazione della reazione PCR. 84 campioni sono stati analizzati. Una foto gel dei prodotti di PCR da questi 84 campioni possono essere trovati nella Figura 1. Da campioni naturali una moltitudine di bande non specifiche può essere osservato a causa della presenza di contaminazioni microbiche diverse nelle feci. Tuttavia, il frammento di destinazione della coppia di primer è di 244 bp lungo. L&#39;intera reazione PCR volume di un sottoinsieme dei campioni che hanno prodotto frammenti in circa la gamma di dimensioni corrette (tra 200 bp e 300 bp) è stato caricato su gel (Figura 1). Un esempio di quale delle bande sono state tagliate dal gel si possono trovare nella figura di complemento 1. In aggiunta al controllo positivo, due di questi campioni (69.899 e 69.912) sono risultati positivi dal nuovo protocollo. Una ricerca BLAST contro il database NCBI nucleotide rivelato la loro identità di AI matrice gene (Figura 3), mentre tutte le altre band assomigliava sequenze batteriche più da vicino, o non producono una sequenza leggibile a tutti. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig1.jpg" /> Figura 1. Immagine gel di uno screening preliminare dei prodotti di PCR. Microlitri 2 prodotto PCR di controllo positivo, sdiluizioni erial del controllo positivo, due controlli negativi e 84 campioni cloacali sono stati caricati. 48 campioni sono mostrati nel pannello in alto gel, e 48 campioni nel pannello inferiore. Frecce rosse indicano corsie gel utilizzato per 100 bp DNA di dimensioni standard. Per esempio, cerchi rossi mostrano bande nel range dimensioni previste. Cerchi blu indicano un amplicone aspecifica (in alto a sinistra) o di un manufatto dimero iniettore di sotto di 100 bp nel formato (in basso a destra). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig2.jpg" /> Figura 2. Selezione dei campioni con frammenti nell&#39;intervallo di grandezza corretto. Campioni con bande tra 200 bp e 300 bp (target frammento di 244 bp) sono stati scelti. La freccia verde indica il controllo positivo, le due frecce rosse indicano i campioni che sono stati confermati da AIV positiva mettendo a confronto le loro sequenze cDNA al database NCBI nucleotide. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig3.jpg" /> Figura 3. Cattura dello schermo di una ricerca BLAST rappresentante NCBI. Una delle sequenze cDNA ottenuto dai frammenti asportati è stato interrogato sul database nucleotide sul sito NCBI. Il campione viene correttamente identificate come frammento AI gene Matrix. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2832/2832fig3large.jpg">Per visualizzare la versione completa di dimensioni di questa immagine, clicca qui.</a> <img alt="Supplementare Figura 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832supfig1.jpg" /> Supplementare Figura S1. Bande di campioni selezionati escisse dal gel. Questa foto è stata scattata dal gel rappresentato in figura 1, dopo le bande candidato tra 200 bp e 300 bp sono stati tagliati fuori.

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+FTA+cards+as+a+laboratory+and+field+sampling+device+for+the+detection+of+foot-and-mouth+disease+virus+and+serotyping+by+RT-PCR+and+real-time+RT-PCR.">Evaluation of FTA cards as a laboratory and field sampling device for the detection of foot-and-mouth disease virus and serotyping by RT-PCR and real-time RT-PCR.</a> J. Virol. Methods. 151, 311-316 (2008).</li><li>Perozo, F., Villegas, P., Estevez, C., Alvarado, I., Purvis, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FTA+filter+paper+for+the+molecular+detection+of+Newcastle+disease+virus.">Use of FTA filter paper for the molecular detection of Newcastle disease virus.</a> Avian Pathol. 35, 93-98 (2006).</li></ol>

Cattura, manipolazione e degustazione di uccelli sono stati fatti a seguito della legislazione nazionale e sono stati approvati dal Consiglio svedese per l&#39;Agricoltura e l&#39;animale comitato di ricerca etica.

Il protocollo qui descritto fornisce un metodo supplementare per lo screening dei campioni fecali o simili per la presenza di AIV. E &#39;stato appositamente studiato per rendere la raccolta del campione rapido e facile. Questo rende possibile per le persone meno allenati, come cacciatori o gestori della fauna selvatica, per contribuire alla sorveglianza AI. Nessuna catena fresco devono essere applicate, anche se il congelamento dei campioni è consigliabile, ove possibile. Pochi giorni di temperatura ambiente, per esempio durante il trasporto al laboratorio, non erano un problema per le molecole di RNA su schede FTA, fino a quando le carte sono rimasti a secco. Altri non raffreddato sistemi di storage che sono attualmente valutati dalla comunità di ricerca, come l&#39;alcool 15 o guanidina 16, richiedono particolari modalità di spedizione a causa della loro natura pericolosa. Al contrario, il metodo della carta FTA non richiede spedizione di materiali pericolosi. Tuttavia, un altro supporto di memorizzazione interessante a questo riguardo è RNAlater ™ che non è pericoloso, sia 17. Analisi dei campioni può essere effettuata in qualsiasi standard di laboratorio molecolare. Nessuna attrezzatura speciale diverso dal solito per reazioni di PCR e il sequenziamento capillare era necessario. Tutte le fasi potrebbe essere effettuata senza un livello di biosicurezza perché già al momento della raccolta dei campioni di agenti patogeni potenziali sono stati inattivati ​​dalla attività antibatterica e antivirale della carta FTA. Contaminazione incrociata e successive campioni falsi positivi non sono stati osservati nelle nostre prove con campioni di uccelli selvatici. Tuttavia, quando si lavora con l&#39;RNA e PCR è sempre consigliabile prestare particolare attenzione per la pulizia dei luoghi di lavoro e stanze separate per le fasi pre-e post-PCR. Lavorare in una cappa aspirante diminuisce il rischio di contaminazione da aerosol in laboratorio. Pipettaggio deve essere effettuata con puntali con filtro. Da uno studio precedente su campioni prelevati simultaneamente dal anatre stessa sappiamo che sei dei 84 campioni sono risultati positivi con il tradizionale RealTime RT-PCR 24 e i valori di Ct da RealTime RT-PCR sono noti. I due campioni positivi rilevati dal nostro staminali metodo di anatre che erano i valori Ct &lt;30 (che indica una alta concentrazione di RNA virale). Gli altri quattro campioni sono risultati positivi con il protocollo tradizionale aveva valori Ct&gt; 30 (meno concentrato) e non potrebbe essere rilevato dal nostro protocollo. Campioni solo con titoli di virus relativamente alta sono risultati positivi nel nostro test ed è probabile che la sensibilità del metodo è stata la fonte di mancato riconoscimento di tutti i campioni positivi. Inoltre, la dimensione del campione in questo studio era molto bassa e il metodo può essere completamente sviluppato e valutato se gli esperimenti più controllata e rigorosa vengono effettuate. Tuttavia, se questi campioni sarebbero stati raccolti da una zona remota, l&#39;analisi tradizionali non sarebbe stato possibile a tutti. Inoltre, questi primi risultati derivano da esperimenti pilota che hanno bisogno di un&#39;ulteriore ottimizzazione. Un periodo di due anni in un deposito regolare congelatore -20 ° C dopo la raccolta del campione, probabilmente influenzato anche la qualità del RNA virale. Questa degradazione dell&#39;RNA possibile è una questione importante quando si tratta di stoccaggio a temperatura ambiente di virus inattivati. Campioni conservati nei liquidi alternativa come detto sopra soffrono di un notevole degrado che incide di più si estende l&#39;analisi del genoma virale 16. Anche se non testati nel nostro studio, le carte FTA hanno dimostrato di essere adatto a preservare intatto molecole di RNA in altri sistemi di RNA che sono molto simili ai virus dell&#39;influenza aviaria, 25, 26.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente o strumento </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Plastica rayon tampone a secco </td><td> Copan, Italia </td><td> 167KS01 </td><td></td></tr><tr><td> FTA card </td><td> Whatman </td><td></td><td> diverse opzioni </td></tr><tr><td> Harris micro perforazione 2mm con tappetino </td><td> Whatman </td><td> 1154409 </td><td></td></tr><tr><td> RNasi libero 96well piatto </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 652290 </td><td> o assimilabili </td></tr><tr><td> Kim precisione salviette </td><td> KIMTECH </td><td> 75512 </td><td></td></tr><tr><td> RNA estrazione rapida soluzione </td><td> Ambion </td><td> AM9775 </td><td></td></tr><tr><td> MagMAX-96 kit di isolamento virale </td><td> Ambion </td><td> AM1836 </td><td></td></tr><tr><td> One-Step accesso RT-PCR sistema </td><td> Promega </td><td> A1250 </td><td> o assimilabili </td></tr><tr><td> Agarosio MP </td><td> Roche </td><td> 1388991001 </td><td> multiuso agarosio </td></tr><tr><td> Di caricamento del buffer 5x </td><td> BioRad </td><td></td><td> consegnato con scaletta del DNA </td></tr><tr><td> EZ carico di 100 bp ladder </td><td> BioRad </td><td> 170-8353 </td><td> o assimilabili </td></tr><tr><td> Etidio bromuro 1% </td><td> Fluka </td><td> 46067 </td><td> o assimilabili </td></tr><tr><td> Provette 1,5 ml </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> o assimilabili </td></tr><tr><td> Zymoclean Gel DNA recupero kit </td><td> Zymo ricerca </td><td> D4001 </td><td> o assimilabili </td></tr><tr><td> ABI grande colorante 3,1 chimica </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td> o assimilabili </td></tr></tbody></table>

avian influenza surveillance with fta  cards: field methods, biosafety, and transportation issues solved

I virus dell&#39;influenza aviaria (AIVs) infettare molti mammiferi, compresi gli esseri umani 1. Queste AIVs sono diversi nei loro ospiti naturali, l&#39;ospitare quasi tutti i possibili sottotipi virali 2. Pandemie influenzali umani di origine derivano da AIVs 3. Molti casi mortali umani durante la focolai di H5N1 negli ultimi anni sono stati segnalati. Ultimamente, un nuovo ceppo AIV relativi attraversò la popolazione umana, causando 4 il &#39;epidemia di influenza suina&#39;. Anche se di trading e dell&#39;attività umana trasporto sembra essere responsabile della diffusione di ceppi altamente patogeni 5, la dispersione può anche essere in parte attribuito a uccelli selvatici 6, 7. Tuttavia, la riserva reale di tutti i ceppi AIV è uccelli selvatici. In reazione a questo e di fronte alle gravi perdite commerciali nel settore del pollame, i programmi di sorveglianza di grandi dimensioni sono stati implementati a livello globale per raccogliere informazioni sull&#39;ecologia di AIVs, e di installare sistemi di allarme rapido per rilevare alcuni ceppi altamente patogeni 8-12. I metodi tradizionali di virus virologica richiedono di essere integro e coltivato prima dell&#39;analisi. Ciò richiede rigorosa catena del freddo con congelatori e pesanti le procedure di biosicurezza essere a posto durante il trasporto. A lungo termine di sorveglianza è quindi di solito limitata ad una delle stazioni di campo di alcuni stretti ai laboratori ben attrezzati. Aree remote non possono essere oggetto di campionamento a meno che le procedure logisticamente complicato l&#39;attuazione. Questi problemi sono stati riconosciuti 13, 14 e l&#39;utilizzo dello stoccaggio e strategie alternative di trasporto indagato (alcoli o guanidina) 15-17. Recentemente, Kraus et al. 18 ha introdotto un metodo per raccogliere, immagazzinare e trasportare campioni di AIV, basato su una carta speciale filtro. FTA 19 carte preservare l&#39;RNA su una base di stoccaggio a secco 20 e rendere inattivi gli agenti patogeni a contatto 21. Questo studio ha dimostrato che le carte FTA può essere utilizzato per rilevare AIV RNA in PCR di trascrizione inversa e che il cDNA risultante potrebbe essere sequenziato i geni del virus e determinato. Nello studio di Kraus et al. 18 un laboratorio isolato di AIV è stato utilizzato, ei campioni sono stati trattati singolarmente. Nella estensione qui presentata, campioni di feci di volatili selvatici dalla trappola d&#39;anatra al Uccello Ottenby Observatory (SE Svezia) sono stati testati direttamente per illustrare l&#39;utilità dei metodi in condizioni reali. Cattura di anatre e raccolta dei campioni da tamponi cloacali è dimostrata. Il protocollo attuale prevede up-scaling del flusso di lavoro dalla gestione singolo tubo di un design a 96 pozzetti. Anche se meno sensibili rispetto ai metodi tradizionali, il metodo di FTA carte offre un ottimo complemento ai sistemi di sorveglianza di grandi dimensioni. Esso consente la raccolta e l&#39;analisi di campioni provenienti da ogni parte del mondo, senza la necessità di mantenimento di una catena fredda o norme di sicurezza rispetto alla spedizione di reagenti pericolosi, come l&#39;alcool o guanidina.

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Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Un metodo per preservare, rilevare e sequenza di RNA da virus dell&#39;influenza aviaria è stato convalidato ed esteso usando naturale campioni di feci di uccelli. Questa tecnica elimina la necessità di mantenere una catena del freddo e la manipolazione di virus infettivo e può essere applicato in un 96-e high-throughput di setup.

Sorveglianza dell&#39;influenza aviaria con FTA Carte: metodi per i campi, Biosicurezza, e problemi di trasporto Risolto

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.1K Views.  Wageningen University. Un metodo per preservare, rilevare e sequenza di RNA da virus dell'influenza aviaria è stato convalidato ed esteso usando naturale campioni di feci di uccelli. Questa tecnica elimina la necessità di mantenere una catena del freddo e la manipolazione di virus infettivo e può essere applicato in un 96-e high-throughput di setup.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Generazione di influenza da virus ricombinante del DNA plasmidi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory flyways. Sampling of wild birds for avian influenza virus (AIV) is often conducted in remote regions, but results are often delayed because of the need to transport samples to a laboratory equipped for molecular testing. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR) is a molecular technique that offers one of the most accurate and sensitive methods for diagnosis of AIV. The previously strict lab protocols needed for rRT-PCR are now being adapted for the field. Development of freeze-dried (lyophilized) reagents that do not require cold chain, with sensitivity at the level of wet reagents has brought on-site remote testing to a practical goal.
Here we present a method for the rapid diagnosis of AIV in wild birds using an rRT-PCR unit (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device or RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) that employs lyophilized reagents (Influenza A Target 1 Taqman; ASAY-ASY-0109, Idaho Technologies). The reagents contain all of the necessary components for testing at appropriate concentrations in a single tube: primers, probes, enzymes, buffers and internal positive controls, eliminating errors associated with improper storage or handling of wet reagents. The portable unit performs a screen for Influenza A by targeting the matrix gene and yields results in 2-3 hours. Genetic subtyping is also possible with H5 and H7 primer sets that target the hemagglutinin gene.
The system is suitable for use on cloacal and oropharyngeal samples collected from wild birds, as demonstrated here on the migratory shorebird species, the western sandpiper (Calidrus mauri) captured in Northern California. Animal handling followed protocols approved by the Animal Care and Use Committee of the U.S. Geological Survey Western Ecological Research Center and permits of the U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory. The primary advantage of this technique is to expedite diagnosis of wild birds, increasing the chances of containing an outbreak in a remote location. On-site diagnosis would also prove useful for identifying and studying infected individuals in wild populations. The opportunity to collect information on host biology (immunological and physiological response to infection) and spatial ecology (migratory performance of infected birds) will provide insights into the extent to which wild birds can act as vectors for AIV over long distances.

This study describes diagnosis of avian influenza in wild birds using a portable rRT-PCR system. The method takes advantage of freeze-dried reagents to screen wild birds in a non-laboratory setting, typical of an outbreak scenario. Use of molecular tools provides accurate and sensitive alternatives for rapid diagnosis.

La diagnosi rapida del virus dell&#39;influenza aviaria nei volatili selvatici: l&#39;uso di un Portable rRT-PCR e liofilizzato reagenti nel campo

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

Modellazione il ciclo di vita Ebola Virus Sotto livello di biosicurezza 2 condizioni con particelle virus-simili contenenti Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Influenza Virus Propagazione in embrionate di pollo Uova

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-immunoprecipitazione della proteina mouse Mx1 con il virus nucleoproteina Influenza A

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

L&#39;analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello del Sangue-Cervello umano Barriera

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Basato sulla fluorescenza neuraminidasi Inibizione Assay per valutare la suscettibilità dei virus influenzali di neuraminidasi Inhibitor classe di antivirali

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Neutralizzando le risposte dell'anticorpo al virus A(H3N2) in sieri umani di Microneutralization l'Influenza di misurazione analisi utilizzando cellule MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.