Questo lavoro è sostenuto in parte A1064826 sovvenzioni NIH R01-01, U19 AI062627-01, NO1-HHSN26600500032C (a SM). Ringraziamo i nostri membri di laboratorio per la discussione e aiuto tecnico, Tina Heil per la revisione critica del manoscritto. Vorremmo ringraziare David Bina, Milwaukee Dipartimento di Sanità Laboratorio per la cultura virus e PCR.

<ol>
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Non abbiamo nulla da rivelare.

Lo scoppio recente epidemia di influenza aviaria nel Sud-Est asiatico e la paura globale della pandemia di influenza suina impongono enormi preoccupazioni per la salute e la sicurezza pubblica. Attenzione critica è stata dedicata nel generare vaccini per i ceppi esistenti e nuovi di virus influenzale. Disponibilità di rapide tecnologie high-throughput per la rilevazione precisa ed accurata calcoli titolo virale sarà migliorare enormemente il trattamento. Le tecniche più comunemente utilizzate per il calcolo impiegati titolo virale comprendono saggi emoagglutinazione la formazione della placca e l&#39;influenza. Il saggio la formazione della placca è stato inizialmente sviluppato per stimare i titoli batteriofagi ed è stato adottato da Renato Dulbecco per calcolare animali titoli virali 4. Per eseguire questo saggio, 10-diluizioni di archivio di influenza o di esemplari di animali, quali fluidi BAL sono preparati e 0,1 ml sono inoculate sul monostrato di cellule MDCK in 6-pozzetti. Il virus è permesso di adsorbire sulle cellule MDCK seguite da l&#39;annunciodizione di un mezzo nutriente e agarosio. Durante l&#39;incubazione, le celle originali infette rilasciare progenie virale che si diffuse solo per le cellule vicine. L&#39;effetto citopatico dell&#39;infezione influenzale virale produce una zona circolare di cellule infettate chiamato una targa. Ogni placca viene presumibilmente formata dopo infezione di una singola cella con una particella virus singolo seguito da replicazione del virus. Contrasto tra le cellule viventi e delle targhette possono essere arricchito da coloranti come la violetta cristallo. Un inconveniente principale di questo saggio è la mancanza di riproducibilità e di enormi variazioni all&#39;interno di esperimenti. Un&#39;altra dosaggio utilizzato per determinare il titolo virale influenzale è il dosaggio emoagglutinazione. La presente proteina emoagglutinina sulla superficie del virus influenzale si lega in modo efficiente per N-acetilneuraminico-proteine ​​contenenti su mammiferi e aviaria globuli rossi 1. Questa interazione tra il virus influenzale e gli eritrociti conduce al agglutinazione in forma di un reticolo. Il lEvel di agglutinazione viene utilizzato per stimare il titolo del virus dell&#39;influenza in campioni. Test di agglutinazione degli eritrociti viene utilizzata solo per determinare la titolazione di un virus noto e non può essere utilizzato a fini di identificazione estensimetri. Dal momento che questo test non fa differenza fra la vita e la morte dei virus, è difficile ottenere un calcolo preciso di titoli virali. Attuali diagnosi cliniche di infezioni influenzali si basano su test sierologici, reazione a catena della polimerasi, immunofluorescenza diretta del campione e la cultura delle cellule 1,6. Il nuovo metodo descritto qui ha anche clinico e di laboratorio potenziale diagnostico. Influenza rilevamento kit Directigen FLU-A (BD Biosciences, San Jose, CA) e BinaxNOW (Binax, Inc., Scarborough, ME) immunocromatografia test utilizzare per rilevare l&#39;antigene virale, come nucleoproteina 7. L&#39;utilizzo di questi kit, il rilevamento di virus possono essere raggiunti entro 15 minuti, tuttavia, tutti i campioni negativi devono essere ulteriormente screened dal metodo coltura cellulare. Diversi studi hanno anche riportato bassa sensibilità di questi kit, in particolare, quando l&#39;infezione era lieve o basso 8. Nel nostro metodo, abbiamo costantemente rilevare a partire da 100 PFU di virus. Questo suggerisce la nostra tecnica è utile per rilevare virus H1N1 in campioni clinici, anche quando l&#39;infezione è mite. Un metodo basato sulla fluorescenza per rilevare antigeni virali è stata riportata, in cui sia campioni di aspirato nasofaringeo sono stati analizzati direttamente o sono state inoculate su un monostrato di cellule sensibili alla moltiplicazione del virus e le analisi successive 9. Tuttavia, questi metodi sono limitati per scopi diagnostici e non sono adatti per calcoli titolo virale. Q-PCR aiuta a identificare la presenza di RNA virale e non stimare la infettività di virus vivi. Rispetto a questi saggi, IR dye-based sistema di analisi aiuterà nella ricerca e la conta titolo virale in campioni clinici e di laboratorio. In caso di focolaio di influenza, ècritico per diagnosticare migliaia di campioni in un periodo di tempo breve. Il nostro metodo basato su una piastra a 384-bene e scanner IR possibile eseguire la scansione 6-piastre alla volta (&gt; 2.000 campioni), offrendo pertanto un vantaggio maggiore rispetto ad altri metodi diretti fluorescenti. Fattibilità di un trattamento rapido di migliaia di campioni clinici potrebbero ridurre la variabilità di prova, la durata del tempo di saggio e di costi. L&#39;uso di un M2-specifico anticorpo offre il vantaggio di essere indipendente di differenze di ceppi in proteine ​​H e N. La proteina M2 è relativamente conservata nella maggior parte dei ceppi influenzali che infettano gli esseri umani. Se gli anticorpi specifici per macchie circolanti sono combinati con il nostro sistema uno può misurare sia il titolo di virus e identificare il ceppo. Tuttavia, poiché M2 è l&#39;obiettivo per i farmaci come amantadina, i mutanti possono nascere che potrebbe cambiare il sito di legame per l&#39;anticorpo monoclonale usato qui. Questo rappresenta una potenziale limitazione di questo sistema negli individui che vengono trattati con questi farmaci. Multiplosaggi vengono utilizzati per enumerare i titoli influenzali nei campioni di prova. Per calcolare virus titolo, 50% della dose coltura tissutale infettiva (TCID 50) e uova allantoici fluido-saggi basati sono ampiamente utilizzati 1,10. Tuttavia, i requisiti di più giorni rendono questi metodi meno affidabile. Inoltre, in questi metodi calcoli basati sulla variazione 50% nel il numero di placche fornire titolazioni virali teoriche ma non accurate. La formazione della placca analisi può essere eseguita entro 96 ore, tuttavia, la mancanza di riproducibilità è un problema importante nei calcoli titolo virale. La presente tecnica descritta qui ha diversi vantaggi. In primo luogo, essa è una tecnica altamente riproducibile con esiti coerenti. In secondo luogo, i calcoli titolo virale si basano sulla quantificazione semplice intensità di fluorescenza che vengono confrontati con le curve standard definiti. Terzo, due o più anticorpi primari può essere utilizzato per diagnosticare sierotipi multipli in un dato campione. Inoltre, IR dye-anticorpi coniugati sono minimal autofluorescenza e sono stati utilizzati per cella l&#39;imaging 11. UV o visivo radiazioni (300-600 nM) risultati in alta autofluorescenza cellulare dovuta alla presenza di elevati quantistica fluorofori rendimento endogene. Questi includono gli amminoacidi aromatici, lipo-pigmenti, nucleotidi pyridinic (NADPH), elastina, collagene e coenzimi Flavin. Questa proprietà intrinseca di cellule rende difficile utilizzare queste fonti di radiazioni come sonde per quantificare l&#39;espressione di proteine ​​specifiche. Al contrario, near-IR coloranti emozionare ed emettono tra i 670-1000 nm. Molte molecole host cellulari e gli idrocarburi policiclici aromatici non eccitano a questa lunghezza d&#39;onda e grazie alla riduzione della dispersione della luce, emettono fluorescenza di fondo estremamente basso. Inoltre, la finestra tra lo sfondo e rilevazione specifico è molto migliorato a causa di un coefficiente elevato di estinzione delle vicino-IR fluorofori. Fotostabilità, superiore rapporto segnale-rumore, è estremamente rilevante nella quantificazione dei titoli virali. Uso di microflcamere uidic automatizza il processo di screening attraverso controlli robotici, e potrebbe consentire di testare campioni clinici altamente contagiose con facilità. Così, l&#39;utilizzo di vicino-IR coloranti in questi metodi è ideale e altamente affidabile per enumerare titoli virali in campioni di tessuto.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Bovina albumina sierica </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11750 </td><td></td></tr><tr><td> PR8 virus </td><td></td><td></td><td> Dal Dr Thomas Moran M </td></tr><tr><td> Capra anti-topo IRDye @ 800 </td><td> LI-COR bioscienze </td><td> 926-32210 </td><td> 1:200 diluizione </td></tr><tr><td> LI-COR Odyssey IR scanner </td><td> LI-COR-bioscienze </td><td> 9201-01 </td><td></td></tr><tr><td> 384 pozzetti della piastra di fondo piatto </td><td> Nalge Nunc internazionale </td><td> 164730 </td><td></td></tr><tr><td> 96-pozzetti della piastra di fondo piatto </td><td> Nalge Nunc internazionale </td><td> 165305 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM media </td><td> Invitrplasminogeno </td><td> 11965126 </td><td></td></tr><tr><td> Medium RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 11875135 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato di sodio </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutammina 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Trypson-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> R001100 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio Piruvato </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-M-2 anticorpo </td><td></td><td></td><td> Dal Dr Thomas Moran M </td></tr><tr><td> Anti-NP mAb </td><td> CDC </td><td> V2S2208 </td><td> Ottenuto con un MTA </td></tr></tbody></table>

high-throughput detection method for influenza virus

Il virus influenzale è un patogeno respiratorio che provoca un elevato livello di morbilità e mortalità ogni anno in più parti del mondo. Pertanto, la diagnosi precisa del ceppo infettante e rapida high-throughput screening di un gran numero di campioni clinici è fondamentale per controllare la diffusione delle infezioni pandemiche. Attuali diagnosi cliniche di infezioni influenzali si basano su test sierologici, reazione a catena della polimerasi, immunofluorescenza diretta del campione e la cultura delle cellule 1,2. Qui, segnaliamo lo sviluppo di una nuova tecnica diagnostica utilizzata per rilevare virus influenzali vivi. Abbiamo usato il mouse adattato umana A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 per testare l&#39;efficacia di questa tecnica utilizzando cellule MDCK 4. Cellule MDCK (10 4 o 5 x 10 3 per pozzetto) sono state coltivate in 96 - o piastre da 384 pozzetti, infettati con PR8 e proteine ​​virali sono stati rilevati utilizzando anti-M2 seguita da uno IR colorante-coniugato secanticorpale secondaria. M2 5 e emoagglutinina 1 sono due proteine ​​marker principali usati in molti diversi saggi diagnostici. Che impiegano anticorpi secondari IR-dye-coniugati minimizzato l&#39;autofluorescenza associata ad altri coloranti fluorescenti. L&#39;uso di anti-M2 anticorpo ci ha permesso di utilizzare l&#39;antigene-specifica intensità di fluorescenza come una metrica diretta di quantità virale. Per enumerare l&#39;intensità di fluorescenza, abbiamo usato il LI-COR Odyssey scanner basato su IR. Questo sistema utilizza due canali laser basati su rilevamenti a raggi infrarossi per identificare fluorofori e differenziarli dal rumore di fondo. Il primo canale eccita a 680 nm ed emette a 700 nm per contribuire a quantificare lo sfondo. Il secondo canale rileva fluorofori che eccitano a 780 nm ed emette a 800 nm. Scansione delle cellule MDCK PR8-infetti nello scanner IR indicato un titolo virale-dipendente fluorescenza. Una correlazione positiva di intensità di fluorescenza a titolo virale a partire dal 10 2 -10 5 PFU potrebbe essere conconsistentemente osservato. Positività Minimal ma rilevabile sempre visto con 10 2 -10 3 PFU PR8 titoli virali dimostrato l&#39;elevata sensibilità delle near-IR coloranti. Il rapporto segnale-rumore è stata determinata confrontando i mock-infettate o cellule MDCK anticorpi isotipo-trattati. Utilizzando le intensità di fluorescenza da 96 - o formati piastra da 384 pozzetti, abbiamo costruito curve di titolazione standard. In questi calcoli, la prima variabile è il titolo virale mentre la seconda variabile è l&#39;intensità di fluorescenza. Pertanto, abbiamo usato la distribuzione esponenziale per generare una curva-fit per determinare la relazione polinomiale tra i titoli virali e intensità fluorescenza. Collettivamente, possiamo concludere che IR dye-based sistema di rilevazione delle proteine ​​può aiutare a diagnosticare infettare i ceppi virali e precisamente enumerare il titolo degli agenti patogeni infettanti.

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Questo metodo descrive l&#39;utilizzo di Infrared sistema colorante di imaging based per il rilevamento di H1N1 in bronchioalveolar lavaggio (BAL) fluido di topi infettati ad una sensibilità elevata. Questa metodologia può essere eseguita in uno 96 - o 384-bene piastra, richiede &lt;10 volume pl di materiale di prova e ha il potenziale per lo screening concomitante di agenti patogeni multipli.

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

26.0K Views.  Blood Research Institute. Questo metodo descrive l'utilizzo di Infrared sistema colorante di imaging based per il rilevamento di H1N1 in bronchioalveolar lavaggio (BAL) fluido di topi infettati ad una sensibilità elevata. Questa metodologia può essere eseguita in uno 96 - o 384-bene piastra, richiede 