Quantificazione del virus della rabbia in varie strutture cerebrali bovine. Il Messico è un paese con un notevole potenziale zootecnico. Gli stati con la più alta produzione di bestiame contengono sia regioni tropicali umide che regioni secche che sono a rischio di focolai di rabbia a causa della presenza del pipistrello vampiro, Desmodus rotundus, il principale trasmettitore della rabbia.
Il rilevamento del gene nucleoproteina N del virus della rabbia viene utilizzato principalmente per la diagnosi della rabbia mediante test molecolari. Utilizzando approcci basati su PCR, quantità minime di un agente infettivo possono essere rilevate in un campione clinico attraverso l'amplificazione selettiva e ripetitiva di una sequenza nucleotidica del DNA. qRT-PCR si basa sul rilevamento e la quantificazione di una molecola in cui gli aumenti del segnale di fluorescenza sono in proporzione diretta alla quantità di prodotto PCR in una singola reazione.
Con l'aumentare del numero di copie del bersaglio dell'acido nucleico, aumenta anche la fluorescenza. Sulla base di ciò, lo scopo dello studio era quello di utilizzare qRT-PCR quantitativo per determinare il numero di particelle virali in diverse strutture anatomiche del cervello bovino, dopo la morte, a causa dell'infezione da rabbia. L'RNA totale è stato estratto direttamente dal cervello dei bovini utilizzando un metodo di estrazione organica secondo il seguente protocollo.
Utilizzare 100 milligrammi di tessuto cerebrale da ogni struttura anatomica per estrarre l'RNA totale utilizzando un reagente disponibile in commercio contenente isotiocianato di guanidinio. Omogeneizzare manualmente un totale di 100 milligrammi di tessuto da ogni struttura in un millilitro del reagente isotiocianato di guanidinium vortice utilizzando un omogeneizzatore Dounce con un piccolo pestello all'interno del microtubo per 15 secondi alla massima velocità. Incubare i campioni sul ghiaccio per cinque minuti, quindi aggiungere 200 microlitri di cloroformio.
Mescolare vigorosamente i campioni per 15 secondi. Incubare sul ghiaccio per due o tre minuti, quindi centrifugare a 12.000 x g per 15 minuti a quattro gradi centigradi. Trasferire la fase acquosa in un tubo pulito e aggiungere 500 microlitri di alcol isopropile.
Incubare i campioni per 15 minuti a 21 gradi centigradi. Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 10 minuti a quattro gradi centigradi. Aspirare il supernatante acquoso pipettando.
L'RNA isolato sarà presente come pellet nel tubo. Quindi, lavare il pellet di RNA con un millilitro di 75% di etanolo pipettando e centrifugando a 7,500 x g per cinque minuti a quattro gradi centigradi. Decantare il supernatante e asciugare all'aria il pellet di RNA a temperatura ambiente, 21 gradi centigradi.
Successivamente, diluire il pellet in 50 microlitri di acqua priva di nucleasi. Determinare la concentrazione e la qualità dell'RNA a 260 nanometri utilizzando uno spettrofotometro. La trascrizione in vitro genera mRNA di un gene bersaglio.
Utilizzare una coppia di primer che amplifica il gene RABV N completo e una che viene utilizzata come controllo positivo per il test qRT-PCR. Questi primer sono progettati per amplificare il gene RABV N completo e per aggiungere un promotore che riconosca la T7 polimerasi. Per amplificare l'intero gene N RABV, utilizzare i primer trans e RAB avanti e indietro e un kit PCR ad alta fedeltà.
Per ogni reazione, preparare un mix master PCR aggiungendo a un tampone di reazione del tubo PCR pulito con 10 micromolari di ogni primer e 0,5 unità di polimerasi ad alta fedeltà. Per utilizzare il prodotto PCR come modello per la sintesi in vitro e per rimuovere i componenti della reazione enzimatica, purificare il prodotto PCR utilizzando un kit concentratore a colonna, secondo le istruzioni del produttore. E poi quantificare usando uno spettrofotometro.
Per la sintesi dell'RNA, utilizzare un kit di trascrizione in vitro con la seguente miscela di reazione:cinque microlitri T7 trascrizione 5X buffer, 1,9 microlitri di ogni nucleotide trifosfato, 10 microgrammi di DNA RABV N purificato e 2,5 microlitri della miscela enzimatica. Successivamente, incubare la miscela a 37 gradi centigradi per quattro ore. Quindi, aggiungere un microliter di un'unità per microgrammo di DNA privo di Rnasi alla miscela di reazione e incubare per 15 minuti a 37 gradi centigradi per eliminare la contaminazione da DNA.
Purificare l'RNA trascritto in vitro e quindi concentrarlo usando fenolo:cloroformio:alcol isoamile ad un rapporto di 25:24:1. Resostipendare il pellet di RNA purificato in 70 microlitri di te buffer, quindi conservarlo a 80 gradi centigradi fino all'uso. Ripetere il protocollo PCR fino a ottenere circa cinque microgrammi di prodotto PCR.
Dopo la purificazione e la concentrazione, l'mRNA genico N trascritto in vitro sarà presente ad una concentrazione di 4.711 microgrammi per microlitro. Confermare che l'mRNA trascritto in vitro corrisponde al gene N dopo il quinto passo di questo protocollo, e utilizzarlo come controllo positivo per la reazione a catena della polimerasi di trascrizione in tempo reale, qRT-PCR. Per la reazione a catena della polimerasi di trascrizione in tempo reale in tempo reale, utilizzare una trascrizione in vitro dell'mRNA nella codifica del gene N completo come controllo positivo.
Insieme a un kit qRT-PCR commerciale in un solo passaggio, utilizzando sonde di ibridazione secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare la sonda nei primer descritti da Coronado e dal collega 2010 per rilevare una regione conservata del RABV utilizzando le seguenti condizioni di ciclo termico. Eseguire diluizioni seriali dell'mRNA trascritto in vitro pipettando serialmente un microgrammo per microlitro di mRNA in tubi fino a ottenere sei diluizioni disaccoppiate.
Preparare tubi a un volume di 100 microliter in triplice copia per l'uso nella creazione della curva standard. Eseguire qRT-PCR come descritto in precedenza. Eseguire qRT-PCR in un ciclore termico con un rotore elaborando i vari campioni cerebrali contemporaneamente alle reazioni di corsa per creare una curva standard e utilizzando controlli positivi, controlli negativi e supernanti isolati dalla coltura cellulare.
Per valutare il limite di rilevamento, efficacia del test e sensibilità del test, utilizzare una curva standard in triplice copia nelle stesse condizioni. Per il rilevamento del gene RABV N, utilizzare l'RNA da campioni di campo, controlli positivi, controlli negativi e supernanti di coltura cellulare per eseguire qRT-PCR utilizzando il kit PCR descritto in precedenza. Per determinare il numero di copie del genoma RABV presenti nei campioni cerebrali bovini, ottenere dati TC dalla curva standard e campioni biologici e da quelli interpolati dall'equazione della curva di taratura Questa cifra mostra i tessuti cerebrali bovini che mostrano una colorazione positiva secondo l'immunofluorescenza diretta.
I risultati mostrano rispettivamente positività al 100%100%83,3%66% e al 50% per RABV in corteccia, talamo, midollo, pons e corno. Questi risultati confermano i risultati precedenti, e almeno tre delle strutture sezionate da ogni cervello erano positive per rabv. D'altra parte, l'equazione della curva standard mostra la relazione tra la quantità di contenuto genetico RABV nel campione e la dimensione del frammento amplificato PCR.
La quantità di contenuto genetico RABV nei nanogrammi è stata dedotta dall'interpolazione dei valori TC nella curva di calibrazione utilizzando l'equazione presentata in questa figura. Usando questa equazione, il limite di rilevamento di uno per 10 al quinto microgrammo per microlitro di RNA virale è stato trovato corrispondere a 36 copie del genoma RABV. Questi risultati dimostrano che il saggio è sensibile e può essere utilizzato per rilevare il virus in campioni che contengono un basso numero di copie del gene RABV N.
L'efficienza del saggio è stata calcolata utilizzando la pendenza della curva standard, che era 3.28. I campioni utilizzati per qRT-PCR hanno mostrato l'amplificazione del gene RABV N. Per determinare il numero di copie virali presenti, i valori CT per ciascun campione sono stati interpolati utilizzando l'equazione della curva di calibrazione.
I risultati ottenuti in nanogrammi sono stati sostituiti nella formula qui descritta. Questa tabella mostra i risultati comparativi tra qRT-PCR e DFA. I risultati dei test qRT-PCR sono stati coerenti con quelli ottenuti utilizzando DFA.
Secondo i risultati ottenuti nel test qRT-PCR nei casi C e D, il talamo è la struttura che possiede il maggior numero di copie del gene RABV N. Ciò suggerisce che l'infezione precoce dei neuroni ipotalamici e talamici è importante nello sviluppo della malattia, dato che questi neuroni controllano le funzioni vegetative di un animale. I numeri di copia del gene RABV N rilevati in ogni struttura di ogni campione sono: la sensibilità e la specificità del test qRT-PCR siamo entrambi al 100% poiché tutti i campioni erano positivi.
Questo risultato è coerente con le diagnosi iniziali dei campioni. qRT-PCR è una tecnica altamente sensibile. Alcuni dei passaggi sono fondamentali per ottenere i migliori risultati.
Uno di questi è la corretta gestione dei campioni per l'estrazione dell'RNA. Questo passaggio è cruciale in quanto l'RNA è facilmente degradabile e i risultati potrebbero quindi essere influenzati. Prendere in considerazione la possibilità di mantenere il campione in condizioni di freddo, circa quattro gradi centigradi durante il processo.
Inoltre, si consideri che diversi cicli di applicazione PCR vengono eseguiti come menzionato nella trascrizione in vitro. Il saggio qRT-PCR condotto in questo studio potrebbe rilevare fino a 36,3 copie del gene RABV N per milligrammo di tessuto. Le strutture cerebrali più adatte per qRT-PCR includevano la corteccia e il talamo.
Ciò si basa sulle osservazioni secondo cui concentrazioni più elevate del gene RABV N sono state rilevate in queste strutture e che sono state anche trovate positive utilizzando il test di riferimento RABV. Il test è stato in grado di rilevare concentrazioni molto basse, 0,00023 per 10 alla nona copia del virus in vari campioni. Oltre a quantificare le particelle virali nel campione, il test sembra fornire un buon strumento diagnostico e di ricerca alternativo per l'individuazione del RABV qui presentato.
