Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dalla Filiale di riproduzione del National Institute of Child Health e lo Sviluppo Umano (NICHD - R21 HD059015) e dalla Charles H. Hood Fondazione Premio Giovani Bambino Investigator Research Salute (Boston, MA).

1. Mutagenesi sito-diretta di GC altamente ricca di sequenza genetica KISS1R <ol><li> Template: completa sequenza cDNA della KISS1R umano con un Myc-tag fuso al suo N-terminale. Questa sequenza è clonato nel vettore di espressione pCS2 +, che è compatibile con le linee cellulari di mammiferi successivamente utilizzati per trasfezioni. Questo vettore di espressione è qui denominati pCS2 + Myc KISS1R. </li><li> Primer design: primer sono destinati a trasportare le mutazioni si desidera, secondo le istruzioni del QuikChange mutagenesi sito-diretta kit (Stratagene). In sintesi: <ul><li> Entrambi (avanti e indietro) primer deve contenere la mutazione desiderata e annealing per la stessa sequenza di filamenti opposti del plasmide (ad esempio, in avanti e reverse primer sono complementari gli uni agli altri) <img src="/files/ftp_upload/2897/step1.jpg" alt="Fase 1" /></li><li> Primers dovrebbero essere 25-45 basi lungo e alla fine in uno o più C o basi G <img src="/files/ftp_upload/2897/step2.jpg" alt="Fase 2" /> <img src="files/ftp_upload/2897/step3.jpg" alt="Fase 3" /></li><li> Mutazione introdotta (s) deve essere al centro di primer e affiancato da ~ 10-15 basi della sequenza corretta da entrambe le parti </li><li> Temperatura di fusione (Tm) dei primer deve essere uguale o maggiore di 78 ° C. Utilizzare le seguenti formule per stimare Tm: <ul><li> Quando l&#39;introduzione di mutazioni: Tm = 81,5 + 0,41 (% GC) - 675 / N - mancata corrispondenza% (N è la lunghezza in fondo basi) </li><li> Quando l&#39;introduzione di inserzioni o delezioni: Tm = 81,5 + 0,41 (% GC) - 675 / N (N non include le basi che vengono inseriti o eliminati) </li><li> Usa primer dissalati (senza ulteriori purificazioni necessario). <img src="/files/ftp_upload/2897/step4.jpg" alt="Fase 4" /></li></ul></li></ul></li><li> Le migliori condizioni di amplificazione includono l&#39;aggiunta di PCRx Enhancer soluzione (Invitrogen) e DMSO. Almeno 2 concentrazioni di DMSO, come ad esempio il 4% e l&#39;8%, devono essere testati. Condizioni di PCR sono riportati nella tabella I e nella Figura 1, è mostrato e risultati di un rappresentante amplificazione PCR di pCS2 + MycKISS1R nella Figura 2. </li><li> Eliminare il DNA dei genitori sui prodotti di amplificazione dalla digestione del DNA metilato con DpnI per 1h 30min a 37 ° C: mescolare in una centrifuga 17.5μl tubo di prodotto PCR con 2μl di NEBuffer 10x 4 e 0.5μl di DpnI (10U; New England Biolabs). </li><li> Trasforma DpnI trattati con prodotti di PCR: 2μl mix di DpnI trattati DNA con 45μl di XL10-Gold Ultracompetent E. coli (Stratagene) nel pre-raffreddata tubo 15 ml di coltura cellulare. Aggiungi 2μl di β-mercaptoetanolo e seguire le istruzioni Stratagene. Piastra 100-400μl di batteri trasformati in LB-agar in piastre contenenti ampicillina 100μg/ml e incubare a 37 ° C. </li><li> Miniprep 2-4 singole colonie per isolare il DNA plasmidico. Confermare il successo delle mutazioni voluto dal sequenziamento e l&#39;analisi del DNA isolata. </li></ol> 2. Transitoria di MycKISS1R in cellule HEK-293 <ol><li> Gli esperimenti che seguono sono eseguiti in cellule di rene embrionale (HEK-293) coltivate in un incubatore CO 2 (5% CO 2) a 37 ° C in DMEM supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina. </li><li> Seme HEK-293 cellule a 2.5x10 5 cellule / ml in 6 pozzetti e farli crescere overnight a 37 ° C prima di trasfezione. NOTA: (i) utilizzare i pozzi tripla per ogni condizione sperimentale, (ii) confluenza delle cellule ideale al momento della transfezione è del 30% -50%. </li><li> Trasfezione delle cellule HEK-293 utilizzando il reagente Transfection GenePorter (Genlantis), secondo le istruzioni del produttore: la metà Mix del siero senza DMEM con 0.5μg pCS2 + MycKISS1R più controllo 0.5μg (vuoto) vettore di totalizzare 1μg di DNA / bene. Mescolare l&#39;altra metà con reagenti di trasfezione 10μl per mg di DNA transfettate. NOTA: Ideale concentrazione di DNA plasmidico può variare. </li></ol> 3. Trattamento con le cellule e lisi <ol><li> 24h dopo la transfezione, sostituire medio delle cellule con 1 ml di DMEM contenente 2,5% FBS (per diminuire il metabolismo cellulare). NOTA: Questa diminuzione nel siero possono facilitare e / o amplificare la rilevazione dei risultati. </li><li> Aggiungi inibitore lisosomi (100μg / pozzetto di leupeptina) direttamente in ciascun pozzetto di una intera 6-pozzetti. Incubare a 37 ° C per 6 o 16 ore (o di altri tempi desiderati) </li><li> Aggiungi fresco inibitore del proteasoma preparato (10μM / pozzetto di MG132) direttamente in tutti i pozzetti di due interi a 6 pozzetti. Incubare a 37 ° C per 2, 4, 6 o 16h (o momenti desiderati). Aggiungi veicolo a tutti i pozzetti del quarto a 6 pozzetti (0 time-point) e incubare a 37 ° C per 16h </li><li> Quando l&#39;incubazione è finita, spostare le piastre di ghiaccio e di eseguire questa procedura intera lisi sul ghiaccio per evitare la degradazione delle proteine: <ul><li> Per aumentare la resa di proteine, combinare la triplica il 6-pozzetti in un centr singoloifuge tubo </li><li> Aspirare celle medie e lavare una volta con 1 ml di ghiacciata tampone fosfato (PBS) </li><li> Aggiungere 100μl di ghiaccio-freddo buffer di lisi (HEPES 20 mM, pH 7.4, 1% NP-40, 150mm NaCl, 1mM EDTA, sodio desossicolato 0,25%) contenenti gli inibitori della proteasi (1x cocktail contenente 100mM AEBSF-HCl, 80μM aprotinina, bestatin 5mm, 1,5 E-64, 0.5M EDTA, 2mM leupeptina e 1mM pepstatina A, più 2mM PMSF) in ciascun pozzetto </li><li> Rimuovere le cellule con un raschietto cellula e cellula trasferimento lisati di centrifugare tubi </li><li> Passo cellule ~ 10 volte attraverso una 20-gauge. NOTA: Non sonicare campioni destinati per il rilevamento western blot di proteine ​​di membrana. Sonicazione porta all&#39;aggregazione delle proteine ​​di membrana, che non migrano correttamente durante l&#39;elettroforesi </li><li> Incubare lisati cellulari per 1h a 4 ° C su una piattaforma oscillante </li><li> Lisati cellulari centrifuga a 4 ° C per 10 min a 10.000 giri x surnatanti e trasferimento in nuovi tubi. NOTA: Non disturbare pellet durante questa fase </li><li> Determinare la concentrazione di proteine ​​in 10μl di sovranatante con il metodo BCA (Pierce) </li><li> Diluire lisati di 1mg/ml con buffer di lisi contenente inibitori della proteasi. </li></ul></li></ol> 4. Immunoprecipitazione e macchia occidentale di rilevamento MycKISS1R <ol><li> Eseguire la procedura seguente immunoprecipitazione su ghiaccio (oppure a 4 ° C): <ul><li> Lavare la giusta quantità di agarosio coniugata con anticorpi anti-myc (2.5μg / campione), due volte con PBS freddo ghiaccio e aggiungere a questo 400μg di lisato proteico. </li><li> Immunoprecipitato il MycKISS1R su lisati notte a 4 ° C in un oscillante e scuotendo con cautela. </li><li> Spin down perle agarosio per centrifugazione impulso a 4 ° C (fino a 10.000 x rpm) </li><li> Aspirare e scartare surnatanti (senza disturbare il pellet) </li><li> Lavare una volta con perline gelida tampone di lisi e due volte con PBS freddo ghiaccio. Invertire i tubi delicatamente prima filatura </li><li> Perline Ressuspend contenenti anticorpi legati MycKISS1R nel buffer 2x caricamento dei campioni contenenti 10% di β-mercaptoetanolo. </li></ul></li><li> Western Blot di immunocomplessi MycKISS1R: <ul><li> Campioni di calore per 30 minuti a 37 ° C. NOTA: non bollire campioni destinati per il rilevamento western blot di proteine ​​di membrana. Come sonicazione, bollente porta anche ad aggregazione di queste proteine </li><li> Spostare i tubi immediatamente in ghiaccio per 5 minuti </li><li> Proteine ​​separate mediante SDS-PAGE in un gel di pendenza 4-15%. </li><li> Trasferimento a Immobilon-FL membrana PVDF (per infrarossi di rilevamento) a 25V per 30 min in tampone di trasferimento (Tris 48 mm di base, glicina 39mm, 1,2 mm SDS, 20% metanolo, pH 9.2) con il Bio-Rad Semi-Dry trasferimento apparato </li><li> Lavare le membrane per 5 minuti a temperatura ambiente con Tris-Buffered Saline (TBS) e blocco per 1 ora a temperatura ambiente con Odissea Licor blocco su una piattaforma oscillante (in alternativa, 5% latte in TBS può essere utilizzato per bloccare legame non specifico). </li><li> Le membrane incubare una notte a 4 ° C con coniglio anti-myc anticorpi (1:500) in soluzione di blocco contenente 0,1% Tween-20 </li><li> Rimuovere l&#39;anticorpo primario e lavare le membrane 3 volte su 5 minuti ciascuno con TBS contenente 0,1% di Tween-20 (TBST) </li><li> Incubare membrane per 1h a temperatura ambiente con caprino Infra-RedDye ® 800CW marcato anti-IgG di coniglio (1:10.000) in tampone bloccante contenente 0,1% di Tween-20 e 0,01% SDS </li><li> Rimuovere l&#39;anticorpo secondario, lavare le membrane 3 volte su 5 minuti ciascuno con TBST e l&#39;ultima volta con TBS solo (per rimuovere rimanenti Tween-20) </li></ul></li><li> Imaging e quantificazione dei MycKISS1R utilizzando il LI-COR Odyssey Infra-Red Imager: <ul><li> Il MycKISS1R sulle membrane sarà ripreso con il LI-COR Odyssey Infra-Red Imager. Per iniziare, posto sulla membrana in basso a sinistra dello scanner Odyssey, allineandolo con la rete. Coprire con il tappetino in gomma, appianare le bolle con rullo e chiudere il coperchio </li><li> Creare un nuovo file di progetto sul computer. Nome del file, fare clic su &quot;fatto&quot;, quindi inserire il login scanner su &quot;scan&quot;. Dimensioni della finestra di console di scanner per soddisfare le vostre membrana, e poi scegliere la risoluzione 169μm e qualità d&#39;immagine media </li><li> Scegliere le impostazioni di intensità per 700 (rosso) e 800 (verde) i canali in base alla forza atteso di ciascun segnale. Sia a scopo solo la visualizzazione del segnale e non influenza quantificazione. Fare clic su &quot;inizio scansione&quot; </li><li> Nome e salvare la scansione, quindi fare clic su &quot;OK&quot; per aprirlo in una nuova finestra per la quantificazione. Monomeri MycKISS1R dovrebbe essere visibile a circa 43kD </li><li> Usando lo strumento &quot;scatola&quot; (sulla barra laterale sinistra), disegnare un riquadro attorno alla prima band. Trascinare la casella intorno per assicurarsi che tutte le bande di adattarsi, poi &quot;copia&quot; e &quot;incolla&quot; la scatola tutte le bande </li><li> Selezionare tutte le caselle con &quot;Ctrl + A&quot;, e quindi selezionare l&#39;opzione per sottrarre sfondo mediana. Fare clic su &quot;report&quot; nel menu in alto e un foglio di calcolo con i valori quantificazione apparirà. Risultati rappresentativi riportati sono represented come fold-aumento rispetto cellule non trattate (tempo zero) </li></ul></li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: <ol><li> Mutagenesi sito-diretta di sequenze altamente KISS1R GC ricchi gene: Tabella 1. Mostra la combinazione di reagenti per migliorare l&#39;efficienza di amplificazione KISS1R. Questa combinazione è stata utilizzata con successo per introdurre mutazioni diverse diretto contro le regioni distinte della sequenza KISS1R cDNA, così come per l&#39;amplificazione di questo gene altamente GC-ricchi. La figura 1 mostra le condizioni di ciclismo e di amplificazione per la mutagenesi di KISS1R. Queste condizioni sono state modificate dal QuikChange mutagenesi sito-diretta kit (Stratagene). Figura 2. Evidenzia un risultato rappresentativo utilizzando questo protocollo ottimizzato. L&#39;aggiunta del 4% o 8% DMSO combinata con la Enhancer PCRx migliora in modo significativo resa di amplificazione del GC ricchi KISS1R cDNA contenenti plasmide. In questo esperimento di rappresentanza, 4% DMSO fornito le condizioni di amplificazione leggermente migliore rispetto a 8% DMSO. Trasformazione di DpnI trattati con prodotti di amplificazione ultracompetent E. coli produce tipicamente da 100 a oltre 1.000 colonie, e il tasso di successo dell&#39;introduzione mutazioni desiderato 80-90% come determinato dal sequenziamento del DNA. </li><li> L&#39;uso di costrutti MycKISS1R a studiare fisiologia del recettore: In questo esperimento rappresentativo, di tipo selvatico pCS2 + MycKISS1R amplificato secondo il protocollo ottimizzato qui descritto è usato per studiare in vivo KISS1 degradazione del recettore in una linea cellulare rilevante (HEK-293) transitoriamente esprimere MycKISS1R. Dopo aver trattato la trasfezione delle cellule HEK-293 con lisosomi (leupeptina) o proteasoma (MG132 inibitori) secondo il protocollo descritto nei metodi, le cellule sono lisate e trattati per western blot. Il pannello superiore della figura 3 mostra la scansione di monomeri MycKISS1R mentre il pannello in basso mostra la quantificazione delle bande visualizzato sul pannello superiore. Quantificazione delle bande indica che né né 6h 16h di trattamento leupeptina colpite livelli di proteine ​​MycKISS1R. Al contrario, il trattamento con MG132 portato ad un tempo-dipendente aumento della proteina MycKISS1R in queste cellule, che culmina a 45 volte l&#39;accumulo del recettore dopo 16h di incubazione con MG132. Queste osservazioni indicano che, a differenza della maggior parte dei G recettori accoppiati alla proteina, KISS1R è degradato dal proteasoma (piuttosto che i lisosomi). </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td> DMSO </td><td></td></tr><tr><td> Reagenti </td><td> 0 </td><td> 4% </td><td> 8% </td></tr><tr><td> Acqua </td><td> 35 </td><td> 33 </td><td> 31 </td></tr><tr><td> Pfu 10x Ultra Taq buffer di </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> dNTP mix (10mm) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Primer senso (25pmol/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Primer antisenso (25pmol/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 10x PCRx Enhancer Solution </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Pfu Ultra Taq polimerasi (2.5U/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DNA plasmidico (20ng/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Combinazione di reagenti utilizzati con successo per mutare e amplificare il GC-ricchi KISS1R <img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Condizioni di ciclismo di mutagenesi successo e amplificazione di GC ricchi KISS1R: Un inizio 2min a caldo è stata seguita da 18 cicli di 30 sec di fusione a 95 ° C, 1 min annealing a 55 ° C min estensione e 6 a 68 ° C. Un ulteriore 10 min estensione a 68 ° C è stata aggiunta alla fine del ciclo. Queste impostazioni sono stati adeguati dal protocollo di mutagenesi originale del II QuikChange XL-mutagenesi sito-diretta kit (Stratagene). <img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Visualizzazione di GC ricchi pCS2 + Myc KISS1R amplificato in presenza o in assenza di DMSO: Cinque aliquote l di pCS2 + KISS1R Myc amplificato in presenza di 0, 4 o 8% DMSO sono stati caricati in questa rappresentativa 1% gel colorati con etidio bromuro e visualizzati utilizzando raggi UV. Le bande di plasmide 6Kb sono visibili su entrambe le corsie di carico di prodotti della PCR amplificati in presenza del 4% e l&#39;8% DMSO, ma non sulla corsia di prima, che è stato caricato con una PCRprodotto amplificato in assenza di DMSO. <img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Effetto della leupeptina o MG132 sui livelli di proteina Myc KISS1R in cellule HEK-293: HEK-293 cellule che esprimono Myc KISS1R sono stati trattati con 100μg/ml leupeptina o 10μM MG132 a 37 ° C per i tempi designato. Myc KISS1R su 400μg di lisato cellulare è stata immunoprecipitati con 2.5μg di agarosio coniugata con anticorpi anti-myc e analizzati mediante western blot. (A) LI-COR rilevazione Odissea di KISS1R Myc dopo incubazione di immunoblot con coniglio anti-Myc-tag anticorpi seguito da incubazione con IRDye 800CW marcato anti-coniglio; (B) Quantificazione delle bande KISS1R Myc mostrato in (A) utilizzando il LI-COR Odissea software di quantificazione. I risultati sono rappresentati come fold-aumento rispetto cellule non trattate (tempo 0).

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Mutagenesi sito-diretta è stata utilizzata per studiare la funzione delle proteine ​​con l&#39;introduzione di cambiamenti nucleotide nella sequenza codificante del gene targeting per oltre tre decenni. La tecnica originale è stata descritta nel 1978 dal chimico britannico-canadese e Premio Nobel Michael Smith 10. Michael Smith condiviso il Premio Nobel 1993 per la chimica Kary Mullis, con il biochimico americano che ha inventato la reazione a catena della polimerasi (PCR) 11. Il metodo origi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> 10x PCRx Enhancer Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 52391 </td></tr><tr><td> PfuUltra ad alta fedeltà DNA polimerasi detergente alternativo </td><td> Stratagene </td><td> 600385 </td></tr><tr><td> DPN-I </td><td> New England Biolabs </td><td> R0176 </td></tr><tr><td> XL10-Gold E. Ultracompetent coli cellule </td><td> Stratagene </td><td> 200314 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Geneporter Transfection Reagent </td><td> Genlantis </td><td> T201007 </td></tr><tr><td> Leupeptina </td><td> Calbiochem </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> MG132 </td><td> Calbiochem </td><td> 47491 </td></tr><tr><td> 10xPBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td></tr><tr><td> Inibitori della proteasi cocktail e PMSF </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> Sc-24948 </td></tr><tr><td> Pierce BCA Protein Assay Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td></tr><tr><td> anti-Myc tag (clone 4A6) agarosio coniugato </td><td> Millipore </td><td> 16-219 </td></tr><tr><td> 2x tampone di caricamento </td><td> BioRad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Criterio di Tris-HCl prefabbricati gel, 4-15% di pendenza </td><td> BioRad </td><td> 345-0028 </td></tr><tr><td> Immobilon-FL membrana PVDF </td><td> Millipore </td><td> IPFL00010 </td></tr><tr><td> Odissea tampone di bloccaggio </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 927-40000 </td></tr><tr><td> 10xTBS </td><td> BioRad </td><td> 170-6435 </td></tr><tr><td> Coniglio anti-myc anticorpi </td><td> Segnalazione cellulare </td><td> 2272 </td></tr><tr><td> Capra anti-coniglio IRDye 800CW </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32211 </td></tr><tr><td> Odissea Imaging System infrarossi </td><td> LI-COR Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> Halt inibitore della proteasi Cocktail (100x) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78430 </td></tr></tbody></table>

mutagenesis and analysis of genetic mutations in the gc-rich kiss1 receptor sequence identified in humans with reproductive disorders

Il recettore kisspeptina (KISS1R) è una proteina G-recettore accoppiato riconosciuto come il grilletto della pubertà e un regolatore di competenza riproduttiva in età adulta 1,2,3. Mutazioni inattivanti in KISS1R identificate nei pazienti sono stati associati con iodiopathic ipogonadismo ipogonadotropo (IHH) 1,2 e la pubertà precoce 4. Studi funzionali di questi mutanti sono cruciali per la nostra comprensione dei meccanismi alla base della regolazione della riproduzione di questo recettore così come quelli plasmare gli esiti della malattia, che derivano da segnalazione KISS1R anormale e funzione. Tuttavia, la sequenza altamente GC-ricchi del gene KISS1R rende piuttosto difficile introdurre mutazioni o amplificare il gene che codifica per il recettore mediante PCR. Qui si descrive un metodo per introdurre mutazioni di interesse in questa sequenza altamente GC-ricco che è stato usato con successo per generare più di un dozzina di mutanti KISS1R nel nostro laboratorio. Abbiamo ottimizzato le condizioni di PCR per facilitare l&#39;amplificazione di una serie di mutanti KISS1R che includono sostituzioni, cancellazioni o inserimenti nella sequenza KISS1R. L&#39;aggiunta di una soluzione di PCR enhancer, oltre che di una piccola percentuale di DMSO sono stati particolarmente utili per migliorare l&#39;amplificazione. Questa procedura ottimizzata può essere utile per altri modelli GC ricchi pure. Il vettore di espressione che codifica per il KISS1R è stato utilizzato per caratterizzare la segnalazione e la funzione di questo recettore al fine di comprendere come le mutazioni possono cambiare KISS1R funzione e portano alla fenotipi associati riproduttivo. Di conseguenza, le potenziali applicazioni di mutanti KISS1R generato dalla mutagenesi sito-specifica può essere illustrato da molti studi 1,4,5,6,7,8. A titolo di esempio, il guadagno di funzione mutazione nel KISS1R (Arg386Pro), che è associato con pubertà precoce, ha dimostrato di prolungare la risposta del recettore per la stimolazione ligando 4, nonché di modificare la velocità di degradazione di KISS1R 9 . È interessante notare che i nostri studi indicano che KISS1R è degradato dal proteasoma, in contrapposizione al degrado classico lisosomiale descritto per la maggior parte G recettori accoppiati alla proteina 9. Nell&#39;esempio qui presentato, il degrado del KISS1R è studiato in cellule renali embrionali umane (HEK-293) transitoriamente esprimere Myc-tag KISS1R (MycKISS1R) e trattati con inibitori del proteosoma o lisosomi. Lisati cellulari sono immunoprecipitati utilizzando un agarosio coniugata con anticorpi anti-myc seguita da analisi Western Blot. Individuare e quantificare le MycKISS1R su macchine viene eseguita utilizzando il LI-COR sistema a infrarossi Odyssey. Questo approccio può essere utile nello studio della degradazione di altre proteine ​​di interesse pure.

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Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

Le mutazioni nel recettore kisspeptina (KISS1R) sono associati a disordini riproduttivi nei pazienti. Qui si descrive come introdurre mutazioni di interesse per il GC-ricca sequenza di KISS1R così come l&#39;uso di costrutti KISS1R per caratterizzare il percorso di degradazione del recettore di immunoprecipitazione e western blot

Mutagenesi e analisi delle mutazioni genetiche in GC-ricchi Sequenza Receptor KISS1 identificati nell&#39;uomo con disturbi dell&#39;apparato riproduttivo

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in ...

mutagenesis-analysis-genetic-mutations-gc-rich-kiss1-receptor

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K Views.  University of Miami Miller School of Medicine. Le mutazioni nel recettore kisspeptina (KISS1R) sono associati a disordini riproduttivi nei pazienti. Qui si descrive come introdurre mutazioni di interesse per il GC-ricca sequenza di KISS1R così come l'uso di costrutti KISS1R per caratterizzare il percorso di degradazione del recettore di immunoprecipitazione e western blot

Video: Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Test di induzione neurale nell&#39;embrione Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Ricerca

Biologia

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Cultura primaria e elettroporazione plasmidi dell&#39;Organo murini di Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Rapida analisi genetica di epitelio-mesenchimale segnalazione durante la rigenerazione dei capelli

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Le colture per pluripotenti umane alternative staminali produzione di celle, manutenzione e analisi genetica

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Approcci genetici e biochimici per<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; La valutazione di proteine ​​Oligomerizzazione: Il rianodina Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Analisi singola particella open-source per Super-risoluzione Microscopia con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust technologies that measure RNA biomarkers in situ in clinical specimens. While grind-and-bind assays like RNAseq and quantitative RT-PCR enable highly sensitive gene expression measurements, they also require RNA extraction and thus prevent valuable expression analysis within the morphological tissue context. The in situ hybridization (ISH) assay described here can detect RNA target sequences as short as 50 nucleotides at single-nucleotide resolution and at the single-cell level. This assay is complementary to the previously developed commercial assay and enables sensitive and specific in situ detection of splice variants, short targets, and point mutations within the tissue. In this protocol, probes were designed to target unique exon junctions for two clinically important splice variants, EGFRvIII and MET&#916;14. The detection of short target sequences was demonstrated by the specific detection of CDR3 sequences of T-cell receptors &#945; and &#946; in the Jurkat T-cell line. Also shown is the utility of this ISH assay for the distinction of RNA target sequences at single-nucleotide resolution (point mutations) through the visualization of EGFR L858R and KRAS G12A single-nucleotide variations in cell lines using automated staining platforms. In summary, the protocol shows a specialized RNA ISH assay that enables the detection of splice variants, short sequences, and mutations in situ for manual performance and on automated stainers.

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Here, we describe an in situ hybridization assay which enables sensitive and specific detection of sequences as short as 50 nucleotides with single-nucleotide resolution at the single-cell level. The assay, which can be performed manually or automatically, can enable visualization of splice variants, short sequences, and mutations within the tissue context.

Visualizzazione di varianti genetiche, gli obiettivi di brevi e mutazioni puntiformi nel contesto morfologico del tessuto con una determinazione del RNA In Situ di ibridazione