Vorremmo ringraziare l&#39;Advanced Optical Microscopy Struttura al Princess Margaret Hospital, in particolare James Jonkman per la loro assistenza nella configurazione iniziale dei canali sul microscopio 2Photon. Gli autori desiderano ringraziare il Targeting spazio-temporale e l&#39;amplificazione della risposta (STTARR) programma di radiazioni e le sue agenzie di finanziamento affiliate. Ringraziamo il Dott. Peter Tonge, Dr.Iacovos Michael e Dr.Andras Nagy per l&#39;alimentazione dei plasmidi VEGFTrap e per le loro correzioni manoscritte e feedback. Il continuo supporto e discussione da parte del personale al BTRC è stato prezioso e vorremmo per commemorare Dr.Abhijit Guha per il suo contributo scientifico. Il lavoro è stato finanziato da CIHR e sovvenzioni NIH.

OGNI INTERVENTO animale è stato effettuato nell&#39;ambito di un cura degli animali e COMITATO uso approvato PROTOCOLLO E effettuata nel rispetto di tutte le linee guida, regolamenti e le agenzie di regolamentazione. Per la tabella di riferimento sulla risoluzione dei problemi 2. 1. Midollo Osseo Ricostituzione (opzionale) Figura 1 (30 min di preparazione, 5 min per il mouse) Tutto l&#39;intervento chirurgico dovrebbe essere eseguito utilizzando rigorosa tecnica asettica con materiale sterile autoclavato. Un topo donatore ricostituire tre topi ospitanti. <ol><li> Anestetizzare destinatario topi e posizione NODscid, con il piombo per schermare la testa, all&#39;interno del centro del GAMMACELL 40 &#39;exactor&#39; irradiatore. </li><li> Irradiare topi NODscid con 2,5 Gy di irradiazione corporea totale (TBI). </li></ol> PUNTO CRITICO: Ottimizzazione della TBI può essere necessaria a causa della variazione nella dose necessaria per sufficiente ospite immunitario cedeplezione ll in differenti ceppi di topi. Punto Pausa: topi host possono essere irradiati in anticipo, ma deve essere utilizzato entro 24 ore di irradiazione. <ol start="3"><li> Euthanize topi donatori secondo le linee guida del comitato per la cura degli animali istituzionali. Pulire gli arti posteriori e rimuovere la tibia e il femore da entrambi, stripping tutti i tessuti in eccesso dalle ossa (figure 1AI, 1aii). </li></ol> PUNTO CRITICO: ossa perone non sono vitali per l&#39;uso a causa di lumen molto stretti. <ol start="4"><li> Rimuovere piastre terminali da entrambe le estremità quattro ossa estratte e stanarli utilizzando un ago G 22 e 1 ml di PBS sterile fino a quando sono bianchi in apparenza (Figura 1aiii). Tabella di riferimento 2. </li><li> Mescolare il midollo estratto osseo (BM) sospensione e prendere 300 ml in tre aghi 27 G tubercolina. Estratto BM dovrebbe contenere circa 2 x 10 7 cellule eè sufficiente per 3 ospitanti topi ricostituzioni. Tabella di riferimento 2. </li><li> Iniettare la sospensione nella vena caudale laterale di tre topi NODscid precedentemente irradiate dalla fase 1.1 (Figura 1b). Tabella di riferimento 2. </li></ol> ATTENZIONE: Per controllare la sterilità del BM iniettato consigliamo placcando il restante BM e cultura per 24 ore per verificare la presenza di infezione. Prima causa di morte, a questo punto è l&#39;infezione nei topi appena ricostituiti. 2. Intracranica Finestra Generation - Figura 2 (30 min per il mouse) Tutto l&#39;intervento chirurgico dovrebbe essere eseguito utilizzando rigorosa tecnica asettica con materiale sterile in autoclave e sotto una lampada di calore per mantenere gli animali caldo (Figura 2A). <ol><li> Anestetizzare topi riceventi NODscid con IACUC approvato anestetico, Avertin iniezione IP a 0,5 mg / g e posizione, con il piombo per schermare la testa, all&#39;interno del centro delGAMMACELL 40 &#39;esattore&#39; irradiatore. Rimuovere i capelli dal cuoio capelluto. Inoltre applicare il gel lacrima per prevenire la disidratazione della cornea. </li><li> Prima con Betadine soluzione e poi pulita con alcool cuoio capelluto, quindi praticare un&#39;incisione dal punto medio delle orecchie a appena sopra gli occhi. Rimuovere cuoio capelluto 3 millimetri ai lati della prima incisione, esponendo il cranio e punti di riferimento della superficie del cranio (Figura 2BI). </li><li> Elevare il periostio iniettando lidocaina al 2%: soluzione epinefrina e sezionare lontano dalla superficie del cranio (Figura 2Bii). </li><li> Utilizzando 2,7 millimetri trapano trapano, indebolire un mm cerchio del cranio 2.7 sulla corteccia dell&#39;emisfero destro tra lambda e bregma. Non penetrano l&#39;osso con la fresa (Figura 2Biii). Tabella 2 Riferimento. </li></ol> PUNTO CRITICO: se punta passa attraverso il cranio, la superficie del cervello sarà danneggiato risultati influenzano con ulteriore TRAUMA. Inoltre si verificherà sanguinamento eccessivo impedendo una chiara finestra venga generato. <ol start="5"><li> Togliere il lembo osseo indebolito con pinzette dissezione e gancio dentale e forza intenzionale ma controllata (Figura 2Biii). </li><li> (Facoltativo) Se guardando patologia tumorale, iniettare linee cellulari tumorali scelti (con gene reporter fluorescente) al centro della finestra generato nel passo 2.5. <ol><li> Caricare 10 microlitri 30 G siringa Hamilton con la sospensione cellulare e ago di carico in un frame stereotassico. PUNTO CRITICO: numero di cellulare avrà bisogno di essere ottimizzato per le cellule tumorali in uso e la linea temporale della crescita necessaria. Per U87 culture usiamo 2 x 10 5 cellule in 10 microlitri per mouse. </li><li> Caricare il mouse sul telaio stereotassico digitale allineare l&#39;ago al punto della finestra generato centro. </li><li> Dell&#39;ago inferiore fino a che raggiunge la superficie corticale e reimpostare le coordinate digitale. </li><li> Bassoer l&#39;ago a 3,2 mm nel tessuto corticale e iniettare in profondità di 3 mm. </li><li> Ritrarre l&#39;ago lentamente poi togliere il mouse dal telaio. PUNTO CRITICO: Iniettare la soluzione per tutta la durata di 1 minuto e lasciare l&#39;ago in posizione dopo l&#39;iniezione per assicurare ridotto riflusso. PUNTO CRITICO: se si verifica emorragia minore irrigare con soluzione salina sterile per 1-5 minuti per fermare l&#39;emorragia superficiale. Procedere con i passi successivi. </li></ol></li><li> Inumidire superficie del cervello con una goccia di PBS sterile per mantenere il tessuto cerebrale irrigato. </li><li> Galleggiante da 3 mm coprioggetto sulla superficie del cervello per sigillare completamente intorno alla finestra mm 2.7 generato. Tabella di riferimento 2. </li><li> Secco cranio circostante osso quindi applicare Vetbond a tutta cranio esposto al tessuto del cuoio capelluto richiudere alle ossa del cranio e il vetrino in posizione. NON applicare un eccesso come vi saranno perdite sotto il vetro e diminuire il potenziale di imaging. </li><li> Mix fresco dentale polvere acrilica e la soluzione, circa il 30% (w / v), e applicare sopra la parte superiore del Vetbond. Per assicurare una buona tenuta si sovrappongono l&#39;acrilico leggermente sul bordo vetrino di vetro (Figura 2Biv). Tabella di riferimento 2. </li></ol> ATTENZIONE: Dental acrilico è estremamente pericolosa per cui si consiglia l&#39;uso di guanti e maschera durante tutta la procedura. PUNTO CRITICO: Dental acrilico deve rimanere flessibile durante lo stampaggio per assicurare una buona tenuta e ridurre l&#39;eccesso. Accumulo di acrilico su la finestra si offuscare le immagini. <ol start="11"><li> Consentire topi di recuperare in una gabbia calda. </li></ol> 3. Stereotassica radiazioni (Opzionale) - Figura 3 (25 min per il mouse) Variazioni esisteranno nei diversi irradiatori usato e come sarà richiesto tale ottimizzazione. Abbiamo usato un irradiatore design su misura. <ol><li> Anestetizzare topiutilizzando Isoflurane al 4% per l&#39;induzione seguita da 1,5-2% in tutta la procedura con 0,5-1 litri di O 2 un minuto, e posto sul dispositivo di immobilizzazione testa personalizzata all&#39;interno del irradiatore stereotassica (Figura 3Ai). </li><li> Ottenere un fascio conico 360 ° TAC con il tubo radiogeno esecuzione a 40 kVp e 0,05 mA attraverso un filtro di alluminio da 2 mm. Usare l&#39;immagine per guidare il movimento della scena, dirigendo la radiazione isocentro all&#39;emisfero destro assicurando che sia centrale nella direzione ventrale dorsale. </li><li> Inserire il collimatore emisferico da 8 mm x 11 mm di blocco. </li></ol> PUNTO CRITICO: Collimatori possono essere progettati per molte configurazioni diverse, e così può essere migliorata per includere ed escludere le diverse parti del cervello. 8 millimetri x 11 mm definisce una superficie emisferica del cervello. <ol start="4"><li> Ottenere singole immagini CT ortogonali sia dall&#39;alto (AP) e inferiore (PA) attraverso il collimatore per migliorare ulteriormente il posizionamento del cervello, anatstrutture ossee omical possono essere utilizzati per la riproducibilità. </li><li> La sostituzione del filtro alluminio per un trattamento di rame 0,93 mm filtra e amministrare la metà della dose di radiazione desiderato con il tubo radiogeno esecuzione a 225 kVp e 13 mA dalla parte superiore in senso AP. </li><li> Cavalletto ritornare nella posizione inferiore e amministrare la seconda metà della dose di radiazione di nuovo con il tubo radiogeno funziona a 225 kVp e 13 mA forma il fondo in una direzione PA. </li></ol> PUNTO CRITICO: è essenziale per irradiare sia dalla parte superiore e la parte inferiore per ridurre il gradiente RT attraverso il tessuto cerebrale, aiuta anche con l&#39;allineamento del isocentro al centro del cervello. 4 In vivo a due fotoni del laser di Microscopia -. Figura 3 (1-3 ore per sessione) Variazioni esisteranno nei diversi microscopi usati e come sarà richiesto tale ottimizzazione. Abbiamo usato un Carl Zeiss LSM510 META Laser Scanning Confocal microscopio. <ol><li> Anestetizzare topi con IACUC approvato anestetico, Avertin iniezione IP a 0,5 mg / g e pulito finestra usando spruzzo di alcol. </li><li><ol class="ualpha"><li> (Opzionale) Iniettare tagged vascolare colorante 5-10 minuti prima di imaging, nella vena della coda prima di imaging. Alexa647-destrano usato a 0,35 mcg / g o CD31-APC utilizzato a 0,2 mcg / g. Vedere la Tabella 2. </li><li> (Facoltativo) Iniettare fluoresceina attraverso la vena della coda alla dose di 7,7 mg / kg, 5 min prima di imaging, per delineare tumore. Tabella di riferimento 2. </li></ol></li><li> I canali di installazione sul microscopio confocale come determinato dal fluorocromo utilizzato nel topo chimerico generato. Tabella 1 mostra i canali descritti in questo modello. </li><li> Capovolgere il mouse sul palco microscopio mobile e stabilizzare la testa in posizione con la plastilina modellabile. (Figura 3Aii) Tabella di riferimento 2. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; PUNTO CRITICO: La ICW deve essere perpendicolare al punto laser e come tale deve essere posizionato orizzontalmente per garantire l&#39;imaging è ottimale. <ol start="5"><li> Accendere il primo laser canale e utilizzare per posizionare al centro della ICW. </li><li> Usare lenti 5x e prendere una immagine dell&#39;intera finestra da utilizzare come mappa per ulteriori immagini a risoluzione superiore. </li><li> Imaging deve essere effettuata utilizzando 10X e lenti 20X &#39;lungo raggio&#39; per ottenere la migliore qualità di immagine. </li></ol> PUNTO CRITICO: I canali e gli obiettivi sul 2PLM deve essere impostato utilizzando cellule ingegnerizzate in vitro prima della rappresentazione di modelli murini per assicurarsi che evidenziano la corretta fluorocromo. <table border="1"><tbody><tr><td> Fluorocromo </td><td> CFP </td><td> GFP / fluoresceina / FITC </td><td> mCherry / RFP / DsRed </td><td> APC / Alexa647 </td><td> SHG autofluorescenza </td></tr><tr><td> Laser di eccitazione </td><td> 458 nm </td><td> 488 nm </td><td> 543 nm </td><td> 633 nm </td><td> Chameleon laser 820 nm </td></tr><tr><td> Collezione Filter </td><td> 480-520 nm </td><td> 500-550 nm </td><td> 565-615 nm </td><td> 650-710 nm </td><td> 390-465 nm </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Guide di configurazione fluorocromo. Per l&#39;utente per vedere il laser di eccitazione e collezionista spettri di emissione utilizzati per ciascuno dei canali disponibili nel modello.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I tre canali descritti in tutte le immagini finora sono intercambiabili per i tre marcatori di interesse di altri modelli e foglie ricercatori con una preziosa serie di strumenti per cercare una numerosi tipi di cellule e interazioni. È necessaria la pianificazione per garantire che tutti i marcatori e tipi di cellule hanno integrato con successo una fluorescenza molecola reporter in un canale distinto. Oltre ai normali tre canali usati qui abbiamo anche potuto integrare un canale PCP quarto (Figura 4A) e una base di collagene SHG canale 7 (Figura 4B). Ciò estende la possibilità di guardare interazioni cellulari in vivo e in aggiunta permette all&#39;utente di intraprendere popolazione miscelazione di studiare specifiche interazioni cellula-cellula, mantenendo due canali per altri marcatori. Per esempio, abbiamo preso in considerazione le cellule tumorali (RFP) e le cellule staminali del cancro (PCP) in un rapporto di 1:3 con un interesse per confrontare il loro intratuminterazioni orali (Figura 4A). Abbiamo osservato che sette giorni dopo l&#39;impianto della popolazione mista del rapporto è stata confermata ed entrambe le popolazioni cellulari potrebbe ancora essere visto. Il canale PCP fornisce problemi tecnici dovuti alla sovrapposizione con il canale GFP in entrambi gli spettri di eccitazione e di emissione e come tale richiede elaborazione post imaging per definire la vera PCP + cellule da quelle che sono effettivamente GFP +. Post-elaborazione di immagini può essere effettuata sui microscopi 2-fotoni costruiti nel software Zeiss LSM direttamente in base al quale, l&#39;immagine GFP viene sottratta dall&#39;immagine PCP conseguente le vere cellule PCP essere lasciati indietro (Figura 4A). La premessa per il rapporto di sottrazione dipende da immagini altrettanto brillanti ed è dovuto al laser CFP (458 nm) fluorescente sia CFP e di cellule GFP, mentre il laser GFP (488 nm) è troppo alto a fluorescenza delle cellule della PCP. Oltre al PCP siamo stati anche in grado di utilizzare le configurazioni precedentemente pubblicati per guardare il SHGlivelli e così raffigurare le fibre di collagene che compongono la membrana basale che circonda vascolare, (Figura 4B). Altro adattamento di questo modello ha sfruttato un piccolo irradiatore personalizzato costruito animale che ha la capacità di utilizzare radiazioni stereotassica guidata per irradiare le parti di tessuto piccolo come 2 mm di diametro. Di mira la finestra con irradiazione è possibile osservare la radiazione ha effetto sul tessuto sottostante. Abbiamo recentemente pubblicato uno studio guardando la radiazione effetto ha sul tessuto cerebrale normale rispetto al reclutamento di BMDCs alla vascolarizzazione, guardando in particolare al loro ruolo nei cambiamenti del tessuto post-radiazioni. Abbiamo scoperto che il reclutamento dei BMDCs era tempo e dose dipendente in tessuto normale 11. E &#39;fattibile per studiare i meccanismi di fornitura e integrazione di terapie che forniscono il farmaco viene etichettato con un marcatore fluorescente. Durantela nostra ricerca siamo stati in grado di monitorare la produzione di VEGFTrap, un farmaco anti-angiogenico che blocca tutte le segnalazioni VEGF nella zona di produzione 25. Modificando geneticamente le cellule tumorali per esprimere il gene VEGFtrap accoppiato con un IRES per EGFP (Figura 4CI) e l&#39;utilizzo di RFP &#39;donatore&#39; BM siamo riusciti a immagine della EGFP: produzione VEGFtrap, interazione BMDC e vascolare contemporaneamente (Figura 4Cii). Ciò ha dimostrato la versatilità del modello e canali disponibili. E &#39;anche possibile esaminare la cinetica del farmaco a causa della promessa di risoluzione di una singola cellula. Fluoresceina (GFP +) viene utilizzato per delineare i tumori in chirurgia per assicurare resezione massimali si ottengono 26. Iniettando per via endovenosa, mentre l&#39;imaging è possibile dimostrare che la delimitazione NON avviene attraverso l&#39;assorbimento attivo della fluoresceina nelle cellule tumorali stesse, ma invece attraverso la raccolta del farmaco nella zona stromale con time, visto dalla mancanza di co-localizzazione 10 min dopo l&#39;iniezione della fluoresceina (Figura 4D). Complessiva nostra strategia combina nuove tecniche e attuale per realizzare una piattaforma sperimentale unico, che è vantaggioso per lo studio di interazioni dinamiche cellulari. Questa strategia ha dimostrato di essere un metodo prezioso per l&#39;esame di alta risoluzione evoluzione dinamica singole cellule BMDC, tumorale e normale vascolarizzazione cerebrale in risposta alla terapia, intracranially. Intravitale di imaging in grado di fornire una migliore comprensione dei regolatori molecolari di BMDC reclutamento, la migrazione e la differenziazione in intracranica vascolare del tumore al cervello, così come molti altri processi dinamici adattabili ad altri campi di ricerca. Putativi fattori inibenti che regolano BMDC in combinazione con altre strategie terapeutiche possono aiutare l&#39;identificazione della tempistica precisa delle terapie combinatorie. Inoltre, questa strategia può essere adattato a molti futuri progetti che utilizza non solo nel vivo intravitale coloranti colorazione, ma anche piccoli inibitori molecolari e nanoparticelle che vengono etichettati con colori fluorescenti che consente ai ricercatori di tracciare la distribuzione e modelli migratori di terapie più mirate e guardare longitudinalmente alla loro cinetica.

Una migliore comprensione dei cambiamenti strutturali e biologiche che sorgono nel cervello in risposta a varie patologie, ed interventi terapeutici è critico per migliorare le strategie di trattamento. Tuttavia, una delle sfide attuali in studio di questi cambiamenti strutturali e biologiche, in particolare per quanto riguarda le patologie intracraniche, è l&#39;inaccessibilità del tessuto e l&#39;incapacità di studiare l&#39;evoluzione temporale e progressione dinamica dei cambiamenti in un ambiente in vivo. La generazione della tecnologia &quot;finestra&quot; ha già avuto successo in esame i cambiamenti dei tessuti molli attraverso lo sviluppo del tumore 5-7. Sviluppo di modelli ICW dimostra di essere più tecnicamente difficile, a causa della necessità di rimuovere l&#39;osso cranio senza danneggiare il istigare infezione del tessuto cerebrale sottostante. Precedenti lavori hanno tentato di assottigliare il cranio per visualizzare le 8-10 tessuto tuttavia, per la produzione di alta risoluzione chiara imè richiesta piena età rimozione dell&#39;osso cranio 11. Ripetere a lungo termine di imaging (30 giorni +) solo recentemente è divenuta un&#39;opzione fattibile attraverso l&#39;imaging 1,11, precedentemente tempi più brevi sono stati studiati 5. Negli ultimi dieci anni un importante obiettivo è stato quello di chiarire l&#39;origine di neo-vascolarizzazione seguenti stimoli patologici, in particolare in risposta alla formazione del tumore e la progressione, per fornire nuovi bersagli terapeutici per il trattamento dei tumori. Molte controversie rimane attorno alla fonte di nuova vascolarizzazione nel cervello durante lo sviluppo del tumore o radiazioni seguente. Tradizionalmente vascolarizzazione è stata considerata avvenire attraverso l&#39;angiogenesi, un processo mediante il quale i nuovi vasi formano dalla germinazione dei vasi pre-esistenti 12. Studi più recenti tuttavia, suggeriscono che il processo embrionale precedenti ipotesi di vasculogenesi può giocare un ruolo più rilevante nella formazione di vascolarizzazione patologica. Vasculogenesis comporta l&#39;assunzione delle controparti angioblast adulte dal midollo osseo, che a loro volta sono poi direttamente coinvolta nella formazione di nuovi vasi endotelio 12-14. Accumulando evidenza indica che le cellule precursori endoteliali sono mobilitate dal midollo osseo di avviare ex novo la formazione dei vasi in risposta a mediatori oncogeni 15-17. Tuttavia, questi studi forniscono prove contraddittorie per il contributo diretto di queste cellule derivate del midollo osseo (BMDCs) a vaso endotelio con contributo percentuale variabile con il tipo di stimolo patologico e la risposta al trattamento 18-21. Pertanto, stabilire metodi sperimentali riproducibili che consentono ad alta risoluzione di immagini intravitale per ripetute studio a lungo termine del processo di integrazione BMDC in vasi tumorali e in risposta alla terapia è inestimabile. Tecniche istologiche standard non riescono a fornire le infor dinamicamazioni necessaria per determinare la sopravvivenza a lungo termine, differenziazione e integrazione delle cellule che danno origine a neovascolarizzazione e quindi non possono dimostrare definitivamente i meccanismi di interazione cellulare. Abbiamo dimostrato utilizzando il nostro approccio sperimentale che c&#39;è un grado variabile di assunzione BMDC seguendo sia radiazioni ionizzanti intracranica e la crescita tumorale, un reclutamento che è tuttavia patologia luogo specifico e non un invasione di tutto il tessuto intracranico 11,22. Abbiamo dimostrato che l&#39;assunzione segue un modello sensibile tempo dimostrato dalla rappresentazione ripetuta di un singolo animale 11,22. Allo stesso modo, imaging in vivo può anche fornire informazioni preziose in mimetismo delle cellule tumorali per cui le cellule tumorali fluorescente tag possono essere esposte e monitorati con un intra-CD31 anticorpi vitali per le cellule endoteliali per evidenziare la possibilità di transdifferenziazione delle cellule tumorali di formare direttamente il proprio endotelio. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; La versatilità del modello è esaltata dalla capacità di immagine 4 canali fluorescenti, fornendo un numero esauriente di combinazioni per lo studio di variare processo cellulare e biologici. Siamo in grado di intravitally immagine CFP (azzurro), GFP (verde), Cherry / RFP (rossa), e Alexa647/APC (rosso lontano), contemporaneamente in un singolo campo più volte nel corso del tempo. Ricercatori possono modificare le cellule geneticamente per esprimere fluorocromi per ciascuno dei canali e coloranti acquisto e anticorpi per evidenziare cambiamenti strutturali di particolare interesse. Ad oggi coloranti e anticorpi comunemente utilizzati negli studi includono CD31 e destrano cui entrambi evidenziare il microcircolo e le sue variazioni di tessuto 1,11,23,24, sebbene abbiamo utilizzato il canale rosso lontano per questo scopo entrambi sono disponibili per l&#39;uso in altri canali citati. Allo stesso modo, altri coloranti compresi Sytox Arancione, che metterà in evidenza le aree di apoptosi, e marcatori come quelli della società Visen, sono stati specifically progettato per l&#39;uso in vivo. Ulteriormente ai quattro canali fluorescenti comunemente utilizzati citate, una generazione di seconda armonica (SHG) canale può essere aggiunto e ottimizzato per le fibre di collagene immagine endogene del modello 7, visualizzando la membrana basale vascolare circostante. Per dimostrare la capacità di adattamento del nostro modello, così come le interazioni cellula-cellula menzionati sopra, abbiamo potuto studiare interazioni farmaco-cellula. Abbiamo esaminato gli inibitori della droga come AMD3100, un inibitore SDF-1, e il suo ruolo nelle reti coinvolte nel reclutamento BMDC 11 segnalazione. Allo stesso modo abbiamo geneticamente fuori U87 glioma cellule xenotrapianti di esprimere VEGFTrap, un inibitore VEGF 25, in combinato disposto con un IRES ad una molecola di GFP. Utilizzando RFP + BM siamo in grado di studiare il ruolo di VEGF ha sul reclutamento di BMDCs alla vascolarizzazione. Più di recente abbiamo utilizzato il modello per studiare la cinetica dei farmaci guardando il mechanism dietro il tumore-delineando farmaco fluoresceina 26, a livello cellulare. Attraverso l&#39;uso di una misura costruito in casa piccoli animali irradiatore siamo stati in grado di integrare stereotassica radiazioni somministrata per valutare la risposta del tumore e sia BMDCs al trattamento. Attraverso l&#39;uso dei nostri nuovi intravitale ricercatori metodo di imaging sarà ottenere informazioni sui monocellulari tempo reale i cambiamenti che si verificano in varie patologie e dei sistemi, favorendo la delucidazione di molte caratteristiche funzionali e biologiche dei cambiamenti del tessuto.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NODSCID mice</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>001303</td>
			<td>8 week old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B5/EGFP Mice</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>003516</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTB/DsRED mice</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>005441</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tear Gel</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>T296/2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Lidocaine-Epinephrine</td>
			<td>Bimeda MTC</td>
			<td>25SP</td>
			<td>Use neat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self curing acrylic kit</td>
			<td>Bosworth</td>
			<td>166260</td>
			<td>Use ~30% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10K MW Dextran-Alexa647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D22914</td>
			<td>Use @ 0.6 mg/kg in Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-APC</td>
			<td>BDPharmingen</td>
			<td>551262</td>
			<td>Use @ 0.3 mg/kg in Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AK-fluor (Fluorescein) 10%</td>
			<td>AKORN inc.</td>
			<td>NDC 17478-253-10</td>
			<td>Use @ 7.7 mg/kg in Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution</td>
			<td>Purdue Products</td>
			<td>NDC 67618-150</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Tweezers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-402</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Dissection Scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25870-002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305156</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G 0.5 ml TB syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305620</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld Micro-Drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-17</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.7 mm Trephine drillbit</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18004-27</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l 30G Hamilton syringe</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>20909-U</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip 3 mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0720 CS-3R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence goggles</td>
			<td>BLS</td>
			<td>FHS/T01</td>
			<td>Basic head frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>stoelting</td>
			<td>51950</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer for IV injection</td>
			<td>Brain Tree Lifescience</td>
			<td>MTI</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics

Abbiamo integrato con successo precedentemente stabilito intracranica finestra (ICW) tecnologia 1-4 con intravital 2-fotone microscopia confocale di sviluppare un nuovo piattaforma che permette una visualizzazione diretta lungo termine della struttura del tessuto cambiamenti intracranially. Imaging ad una risoluzione di singola cellula in un modo in tempo reale fornisce informazioni dinamiche supplementari oltre i limiti previsti dalle analisi istologiche standard di end-point, che guarda unicamente a &#39;snapshot&#39; sezioni di tessuto. La creazione di questa tecnica di imaging intravitale in fluorescenti topi chimerici, siamo in grado di immagine quattro canali fluorescenti simultaneamente. Incorporando cellule fluorescente, come GFP + midollo osseo, è possibile monitorare il destino di queste cellule che studiano loro migrazione lungo termine, l&#39;integrazione e la differenziazione all&#39;interno del tessuto. Ulteriore integrazione di una cella giornalista secondario, come ad esempio una linea tumorale mCherry glioma, consente caratzazione di interazione fra cellule. I cambiamenti strutturali nel microambiente del tessuto possono essere evidenziati attraverso l&#39;aggiunta di coloranti intra-vitali e gli anticorpi, per esempio anticorpi CD31 con tag e molecole destrano. Inoltre, si descrive la combinazione del nostro modello di imaging ICW con un animale di piccole micro-irradiatore che prevede l&#39;irradiazione stereotassica, la creazione di una piattaforma attraverso la quale i cambiamenti del tessuto dinamici che si verificano in seguito alla somministrazione di radiazioni ionizzanti possono essere valutati. Attuali limiti del nostro modello includono penetranza del microscopio, che è limitata ad una profondità di fino a 900 micron dalla superficie sub corticale, limitando l&#39;imaging all&#39;asse dorsale del cervello. La presenza del cranio dell&#39;osso rende la ICW una procedura tecnica più impegnativo, rispetto ai modelli a camera più consolidate e utilizzate attualmente utilizzati per studiare tessuto mammario e cuscinetti adiposi 5-7. Inoltre, la ICW providi molte sfide durante l&#39;ottimizzazione della formazione immagine.

La fase opzionale di ricostituire la BM di topi NODscid dovrebbe risultare in un assorbimento 80% del fluorescente &#39;donatore&#39; BM nel 100% dei &#39;Host&#39; topi il NODscid, tuttavia l&#39;ottimizzazione della TBI sarà tenuto a migliorare la ricostituzione in altri non ceppi-immunocompromsed. Se i topi sono senza successo ricostituiti si ammalano e muoiono rapidamente seguendo la procedura, i topi indeboliti possono richiedere cibo supplementare e le fonti d&#39;acqua. La ICW una volta finito dovrebbe assomigliare a quello visto in Figura 2Biv. E &#39;ideale per avere una cresta di acrilico che circonda il vetrino di vetro come questo dà forza per il join con il cranio. Finestre perfetti sono riproducibili e permettono di immagini ripetute fino a 8 settimane dopo la loro generazione (Figura 2C). Immagini prodotte attraverso queste finestre ottimali sarà come quelli visti in Figura 3Bi. Imperfezioni nella generazione finestra produrranno immagini di poveriqualità per esempio, bolle d&#39;aria sotto la finestra impedirà interi campi di vista sta eseguendo l&#39;acquisizione, aree appare scuro come l&#39;aria impedisce al laser imaging (Figura 3Bii). Con eccesso di colla e acrilico su coprioggetto ci sarà un elevato livello di sfondo fluorescenza e le zone del campo viene cancellato come si vede in Figura 3Biii, allo stesso modo in caso di imbrattamento sulla finestra piccoli punti di fluorescenza di fondo saranno visibili nel campo (Figura 3Biv). Successo di ICW dell&#39;imaging è predeterminato dalla integrità della tecnica chirurgica, tuttavia, anche ICWS ottimali possono incontrare problemi durante la sessione di imaging. Come tale, una portata e del grado di chiarezza esiste nelle immagini generate come visto in Figura 3. L&#39;immagine di qualità pubblicazione ritratta in figura 3C si verifica quando tutto è ottimale. Anche se non è possibile per tutti i topi, è fattibile aspettarsi 80% dell&#39;immagines generati a guardare come questo. Uno dei maggiori difetti nella configurazione attuale microscopia è l&#39;uso di laser invertiti. I topi devono essere posizionati sulla schiena e questo si traduce in stress eccessivo e il disagio che può portare a respiro affannoso durante l&#39;imaging. Questo produce un immagine &#39;foderato&#39; come la respirazione interferisce con la media che si verifica durante l&#39;imaging, per cui, ogni riga di pixel è ripreso quattro volte e la media dei quattro è visualizzato nell&#39;immagine finale. Qualsiasi movimento durante il calcolo della media, come quella causata da respiro affannoso, creerà un manufatto che appare come una linea sull&#39;immagine, come visto in Figura 3D. I topi che non sono sufficientemente anestetizzato durante l&#39;imaging possono riscontrare questo problema anche. L&#39;effetto &#39;foderato&#39; può essere diminuito limitando l&#39;immagine media su on, tuttavia questo a sua volta riduce la qualità dell&#39;immagine, e non può eliminare il problema. In alternativa, i topi possono essere riposizionati o nuovi tentativi quando la respirazione si è normalizzata. L&#39;uso oF AN 2PLM verticale sarebbero negare questo problema come topi potevano essere ripreso &#39;in posizione prona&#39;. Un ulteriore problema con l&#39;imaging su un 2PLM invertita include la limitata accessibilità per il posizionamento della ICW una volta che il mouse si trova sul microscopio, e questo porta a immagini &#39;segmentate&#39; come quelli visti in Figura 3E. Qui il laser e coprioggetto non sono ortogonali tra loro e come tale la rappresentazione si verifica in un angolo. Ciò provoca la generazione di una immagine &#39;segmentata&#39; dove i lati del campo di vista non vengono esposte. Il problema si risolve facilmente con il riposizionamento del mouse per assicurare il vetrino è completamente orizzontale, una volta sulla testa di montare come si vede nella figura 3Aii. Il modello qui presentato è stato specificamente utilizzato per esaminare il ruolo di BMDCs nella vascolarizzazione del tessuto tumorale e dimostra la capacità di utilizzare tre diversi canali contemporaneamente (Cherry, GFP, Far-rosso - Alexa647 e APC) making della PCP e SHG ridondante per questa particolare storia. Siamo stati in grado di topi immagine longitudinalmente per un massimo di otto settimane, studiando il reclutamento e l&#39;integrazione delle cellule midollari nel sistema vascolare a livello di singola cellula, senza effetti negativi causati dalla finestra. Questo modello dimostra la facilità di raccolta delle informazioni dinamiche sulla fonte e la formazione del sistema vascolare e l&#39;interazione di diversi tipi di cellule di interesse, precedentemente persi con l&#39;analisi istologica punto finale. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Problema </td><td> Ragionamento </td><td> Soluzione </td></tr><tr><td> 1.4 </td><td> Bone frantumi </td><td> Utensili consumati </td><td> Raccogliere midollo osseo formare un topo fresco con forbici affilate o lama fresca bisturi, frammenti ossei possono inibire l&#39;iniezione TV </td></tr><tr><td> 1.5 </td><td> Bassa estrazione (bassa viscosity) </td><td> Piastre laterali osso tagliato troppo distalmente; poveri metodo di raccolta </td><td> Le ossa dovrebbero essere tagliati come prossimalmente possibile e raccolti con l&#39;osso all&#39;interno del tubo di raccolta per evitare alzatina Ora dovrebbe essere speso per estrarre il massimo BM e con cura Se Piscina necessario più di un topo in 1 ml </td></tr><tr><td></td><td> Alta Estrazione (alta viscosità) </td><td> Tampone a bassa raccolta </td><td> Diluire la soluzione con il più 0,1% di BSA, diviso per tre topi riceventi fino a 500 microlitri per massimo del mouse </td></tr><tr><td> 1.6 </td><td> Bad iniezione endovenosa </td><td> Povero vasodilatazione e visibilità nave </td><td> Migliora la dilatazione con lampada di calore. Posto del mouse in coda vena immobilizzazione con costruito in fonte di luce per facilitare l&#39;accesso </td></tr><tr><td> 1 </td><td> I topi malati </td><td> Infezione </td><td> Sacrifica topi secondo le regole dell&#39;istituzione. Assicurarsi vengono pulite le code prima dell&#39;iniezione e controllare la sterilitàdi estratto BM nella cultura </td></tr><tr><td></td><td> I topi muoiono </td><td> Povero BM captazione </td><td> Verificare% di fluorescenza assorbimento BM di topo morto. Ottimizzare TBI per ceppo di topi in uso Aumentare la quantità di BM di iniezione (ad esempio uso un mouse donatore per due riceventi) </td></tr><tr><td> 2.4 </td><td> Emorragia Minori </td><td> Dura violato durante la perforazione </td><td> Pressione con cuscinetti in gel e e continuo lavaggio salina sterile </td></tr><tr><td></td><td> Maggiore emorragie </td><td> Cervello danneggiato da perforazione </td><td> Sacrifica il mouse secondo le linee guida delle istituzioni </td></tr><tr><td> 2.8 </td><td> Bolle d&#39;aria sotto il vetrino coprioggetto </td><td> Problemi di contatto con la superficie corticale impedisce il corretto posizionamento </td><td> Rimuovere vetrino e aggiungere ulteriore PBS a galleggiare il coprioggetto sulla finestra per rimuovere le bolle </td></tr><tr><td> 2.10 </td><td> Slittamento del vetrino durante l&#39;incollaggio </td><td> Acrmassa ylic è pesante, mettendo pressione sul vetrino e sposta il vetrino di mezzo </td><td> Pinzetta dovrebbe essere utilizzato per contenere coprioggetto giù mentre vengono applicati Vetbond e acrilico </td></tr><tr><td> 4.2 </td><td> Bad iniezione endovenosa </td><td> Povero vasodilatazione e visibilità nave </td><td> Migliora la dilatazione con lampada di calore. Posto del mouse in coda vena immobilizzazione con costruito in fonte di luce per facilitare l&#39;accesso </td></tr><tr><td> 4.4 Figura 3C </td><td> Immagini &#39;foderato&#39; </td><td> Affannoso o respirazione irregolare </td><td> Rimuovere il mouse dal telaio e permettere di recuperare Aumentare il livello di anestetici somministrati e regolare la posizione per garantire il collo non è eccessivamente flessa o estesa per impedire la respirazione </td></tr><tr><td> Figura 3C </td><td> Immagine &#39;segmentata&#39; </td><td> Cervello non è parallelo obiettivi </td><td> Regolare la posizione del vetrino per assicurarsi che sia piatta </td></tr><tr><td></td><td> Nave non visualizzato </td><td> iniezione non si vede per via intravascolare </td><td> Ripeti l&#39;iniezione in vena della coda alternativa, coda caldo per garantire una buona vasodilatazione </td></tr><tr><td></td><td> Alta sfondo </td><td> Sporca coprioggetto, Bolle d&#39;aria, acrilico </td><td> Pulire vetrino con un panno umido di etanolo al 70%, non si impregna come può penetrare sotto acrilico e danneggiare il tessuto cerebrale </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Risoluzione dei problemi. Una linea guida per interventi correttivi necessari per aree problematiche delle procedure. <img alt="Schemi 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363schemata1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363schemata1.jpg" /> Schemi 1. Diagramma di flusso sperimentale. Ciò dimostra la cronologia degli eventi attraverso fasi sperimentali 1-4. Modelli murini sono settati più di una settimana, pergarantire la BM ricostituisce correttamente, e non sono trattati con farmaci fino al giorno 7 del tumore al fine di garantire gli innesti tumorali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50363/50363schemata1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig1.jpg" /> Figura 1. Ricostituzione BM. (A) procedura di estrazione BM i. Dissezione delle ossa degli arti posteriori. Ii. Dissected femore e tibia dagli arti posteriori, pulito e pronto per l&#39;estrazione. Iii. Ossa con fondello rimosso e lavato attraverso, dimostrando l&#39;aspetto bianco delle ossa vuote. (B) Schemata dimostrando dove vene laterali per iniezione sono posizionati nella coda. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-Page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig2.jpg" /> Figura 2. Generazione ICW. (A) asettica configurazione consigliata (B) i. Superficie del cranio Esposti rivela i punti di riferimento necessari per la chirurgia, ICW dovrebbe essere posizionato sulla emisfero destro equidistanti dal bregma e Lamda. Ii. Periostieum sollevata con soluzione di lidocaina, pronti per la rimozione . iii. gancio dentale richiesto per la rimozione del frammento osseo generata con il trapano. iv. Terminati ICW con acrilico dentale. (C) Tre esempio finestre dimostrare la riproducibilità del metodo. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig3.jpg" /><br/&gt; Figura 3. 2PLM risultati attesi. Tutte le immagini mostrano verde BM, tumore rosso, blu (pseudo colore rosso lontano) vascolare. (A) i. Dimostra il telaio testa che mantiene il flusso isoflurano all&#39;interno del piccolo irradiatore animale. La x 11 mm collimatore 8 può anche essere visto muoversi attraverso il portale. Ii. Mouse nel invertito posizionato nel telaio prevalenza richiesta per l&#39;imaging, plastercine modellabile assicura tutte le finestre può essere accettata. (B) le foto dimostrative degli esiti di problemi con la generazione finestra da i. una finestra ottimale, ii. una finestra con le bolle d&#39;aria intrappolate sotto, iii fuoriuscita acrilico sopra il vetrino e IV. sporco sulla finestra stessa. (C) mette in evidenza i problemi che si verificano con l&#39;imaging a seguito di successo generazione di un ICW i. ottimale di imaging ii manufatti. respirazionecreare un&#39;immagine &#39;allineato&#39; iii. coprioggetto non perpendicolari al laser generare un&#39;immagine &#39;segmentata&#39;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50363/50363fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig4.jpg" /> Figura 4. Usi funzionali e adattamenti del modello. (A) CFP di elaborazione delle immagini dopo il quale immagine GFP viene sottratto immagine CFP per rivelare l&#39;immagine PCP vero che può essere sovrapposto agli altri tre canali in bianco. Verde BM, tumore Rosso, Bianco CSC, Blu (pseudo colore rosso lontano) vascolare (B) Dimostrazione delle fibre di collagene che può essere ripreso con SHG. Dextran verde, rosso BM, Ciano Collagene (C) i. cellule VEGFTrap in VitrØ dimostrare il segnale GFP prodotta con il VEGFtrap. ii. imaging in vivo dimostra le cellule VEGFtrap chiaramente e inoltre mette in evidenza la facilità di commutazione dei canali per dimostrare il sistema si sta guardando. Verde VEGFTRap + Tumore, BM Rosso, Blu (pseudo colorata rosso lontano) vascolare. (D) Illustra la raccolta di fluoresceina nello stroma del tumore e non nelle cellule direttamente, mostrata dalla mancanza di segnale sovrapposizione verde con tumore rosso. Verde fluoresceina, tumore Rosso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50363/50363fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

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A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

Descriviamo un romanzo<em&gt; In vivo</em&gt; Tecnica di imaging che le coppie fluorescenti topi chimerici con finestre intracraniche e ad alta risoluzione microscopia a due fotoni. Questa piattaforma di imaging ausili studi di cambiamenti dinamici nel tessuto cerebrale e del microcircolo, a livello di singola cellula, a seguito di insulti patologici ed è adattabile per valutare la somministrazione di farmaci intracranica e la distribuzione.

Un romanzo ad alta risoluzione<em&gt; In vivo</em&gt; Tecnica di imaging per studiare la risposta dinamica di strutture intracraniche alla crescita del tumore e Terapeutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

a-novel-high-resolution-vivo-imaging-technique-to-study-dynamic

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

11.4K Views.  Hospital for Sick Children, Toronto Medical Discovery Tower. Descriviamo un romanzo In vivo Tecnica di imaging che le coppie fluorescenti topi chimerici con finestre intracraniche e ad alta risoluzione microscopia a due fotoni. Questa piattaforma di imaging ausili studi di cambiamenti dinamici nel tessuto cerebrale e del microcircolo, a livello di singola cellula, a seguito di insulti patologici ed è adattabile per valutare la somministrazione di farmaci intracranica e la distribuzione.

Video: A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Un In Vitro Sistema per studio dormienza tumorale e l&#39;interruttore di crescita metastatica

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Ricerca

Medicina

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The cell line was originally induced by intracranial injection of 3-methyl-cholantrene into a C57BL/6 syngeneic mouse strain 1; therefore, immunologically competent C57BL/6 mice can be used. While we use GL261, the following protocol can be used for the implantation and monitoring of any intracranial mouse tumor model. GL261 cells were engineered to stably express firefly luciferase (GL261-luc). We also created the brighter GL261-luc2 cell line by stable transfection of the luc2 gene expressed from the CMV promoter. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mice (albino variant of C57BL/6) from the National Cancer Institute, Frederick, MD were used to eliminate the light attenuation caused by black skin and fur. With the use of albino C57BL/6 mice; in vivo imaging using the IVIS Spectrum in vivo imaging system is possible from the day of implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). The GL261-luc and GL261-luc2 cell lines showed the same in vivo behavior as the parental GL261 cells. Some of the shared histological features present in human GBMs and this mouse model include: tumor necrosis, pseudopalisades, neovascularization, invasion, hypercellularity, and inflammation 1.
Prior to implantation animals were anesthetized by an intraperitoneal injection of ketamine (50 mg/kg), xylazine (5 mg/kg) and buprenorphine (0.05 mg/kg), placed in a stereotactic apparatus and an incision was made with a scalpel over the cranial midline. A burrhole was made 0.1mm posterior to the bregma and 2.3mm to the right of the midline. A needle was inserted to a depth of 3mm and withdrawn 0.4mm to a depth of 2.6mm. Two &mu;l of GL261-luc or GL261-luc2 cells (107 cells/ml) were infused over the course of 3 minutes. The burrhole was closed with bonewax and the incision was sutured.
Following stereotactic implantation the bioluminescent cells are detectable from the day of implantation and the tumor can be analyzed using the 3D image reconstruction feature of the IVIS Spectrum instrument. Animals receive a subcutaneous injection of 150&mu;g luciferin /kg body weight 20 min prior to imaging. Tumor burden is quantified using mean tumor bioluminescence over time. Tumor-bearing mice were observed daily to assess morbidity and were euthanized when one or more of the following symptoms are present: lethargy, failure to ambulate, hunched posture, failure to groom, anorexia resulting in &gt;10% loss of weight. Tumors were evident in all of the animals on necropsy.

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial implantation of GL261 cells into C57BL/6 mice produces malignant gliomas that recapitulate many of the hallmarks of human glioblastoma multiforme. We used GL261 cells stably expressing luciferase to allow us to use in vivo imaging to follow tumor progression. The surgery and 3D in vivo imaging are demonstrated.

Impianto intracranica con 3D successivi In Vivo Bioluminescent Imaging dei gliomi Murine

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current estimates put the prevalence of amblyopia at approximately 1-3%1-3, the majority of cases being monocular2. Amblyopia is most frequently caused by ocular misalignment (strabismus), blur induced by unequal refractive error (anisometropia), and in some cases by form deprivation.
Although amblyopia is initially caused by abnormal visual input in infancy, once established, the visual deficit often remains when normal visual input has been restored using surgery and/or refractive correction. This is because amblyopia is the result of abnormal visual cortex development rather than a problem with the amblyopic eye itself4,5 . Amblyopia is characterized by both monocular and binocular deficits6,7 which include impaired visual acuity and poor or absent stereopsis respectively. The visual dysfunction in amblyopia is often associated with a strong suppression of the inputs from the amblyopic eye under binocular viewing conditions8. Recent work has indicated that suppression may play a central role in both the monocular and binocular deficits associated with amblyopia9,10 .
Current clinical tests for suppression tend to verify the presence or absence of suppression rather than giving a quantitative measurement of the degree of suppression. Here we describe a technique for measuring amblyopic suppression with a compact, portable device11,12 . The device consists of a laptop computer connected to a pair of virtual reality goggles. The novelty of the technique lies in the way we present visual stimuli to measure suppression. Stimuli are shown to the amblyopic eye at high contrast while the contrast of the stimuli shown to the non-amblyopic eye are varied. Patients perform a simple signal/noise task that allows for a precise measurement of the strength of excitatory binocular interactions. The contrast offset at which neither eye has a performance advantage is a measure of the "balance point" and is a direct measure of suppression. This technique has been validated psychophysically both in control13,14 and patient6,9,11 populations.
In addition to measuring suppression this technique also forms the basis of a novel form of treatment to decrease suppression over time and improve binocular and often monocular function in adult patients with amblyopia12,15,16 . This new treatment approach can be deployed either on the goggle system described above or on a specially modified iPod touch device15.

Amblyopia is a developmental disorder of the visual cortex that is often accompanied by strong suppression of one eye. We present a new technique for measuring and treating interocular suppression in patients with amblyopia that can be deployed using virtual reality goggles or a portable iPod Touch device.

La misurazione e trattamento di soppressione in Ambliopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

Stereotassica impianto intracranico e<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging Bioluminescent di xenotrapianti di tumori in un sistema modello del mouse di Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

A Novel<em&gt; In vivo</em&gt; Tecnica Gene Transfer e<em&gt; In vitro</em&gt; test cellulari per lo studio della perdita ossea nei disturbi muscoloscheletrici

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Iniezione ortotopico di cellule di carcinoma mammario nel mammaria Fat Pad di Mice per studiare la crescita del tumore.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Facial Nerve Axotomy in Mice: A Model to Study Motoneuron Response to Injury

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and either cut or crush it to induce peripheral nerve injury. Advantages of this surgery are its simplicity, high reproducibility, and the lack of effect on vital functions or mobility from the subsequent facial paralysis, thus resulting in a relatively mild surgical outcome compared to other nerve injury models. A major advantage of using a cranial nerve injury model is that the motoneurons reside in a relatively homogenous population in the facial motor nucleus in the pons, simplifying the study of the motoneuron cell bodies. Because of the symmetrical nature of facial nerve innervation and the lack of crosstalk between the facial motor nuclei, the operation can be performed unilaterally with the unaxotomized side serving as a paired internal control. A variety of analyses can be performed postoperatively to assess the physiologic response, details of which are beyond the scope of this article. For example, recovery of muscle function can serve as a behavioral marker for reinnervation, or the motoneurons can be quantified to measure cell survival. Additionally, the motoneurons can be accurately captured using laser microdissection for molecular analysis. Because the facial nerve axotomy is minimally invasive and well tolerated, it can be utilized on a wide variety of genetically modified mice. Also, this surgery model can be used to analyze the effectiveness of peripheral nerve injury treatments. Facial nerve injury provides a means for investigating not only motoneurons, but also the responses of the central and peripheral glial microenvironment, immune system, and target musculature. The facial nerve injury model is a widely accepted peripheral nerve injury model that serves as a powerful tool for studying nerve injury and regeneration.

We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.

Facial assotomia Nerve in topi: un modello per studiare motoneuroni risposta al danno

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

Istituzione di un mieloma multiplo umano Xenograft modello nel pollo per studiare la crescita del tumore, invasione e l&#39;angiogenesi

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo ed ex vivo approcci per studiare il cancro ovarico metastatico colonizzazione delle strutture Lattea Spot in peritoneale adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

Usando la formazione immagine retinica per studiare la demenza

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...