Questo studio è sostenuto da NIH DC052256 e DC006015, e NSF 0.324.769 di QG e T32-DC008072 a BS.

1. Preparazione Questa procedura è biosicurezza di livello 2, quindi tutti i preparativi sono apportate le seguenti in una cappa rischio biologico in cui si svolge la procedura di microiniezione. <ol><li> Preparare e preriscaldare a 37 ° C ad acqua: Riempire un sacchetto di plastica con acqua di stoccaggio - tenuta e impostare su un svuotato riscaldamento blocco incubatore. Questo permetterà di recuperare i topi dopo l&#39;iniezione. </li><li> Riempire un contenitore di rischio biologico dei rifiuti con il 10% di candeggina per un volume adatto per immersione di tutti i rifiuti da questa procedura. </li><li> Preparare un piatto piccolo aperto di etanolo al 70% e un secondo piatto con ddH2O sterilizzato e posto nella cabina di sicurezza biologica. </li><li> Sterilizzare una siringa 5μL capacità di Hamilton con una 33-gauge a spruzzo discendono lungo il corpo ago con etanolo al 70% con lo stantuffo tirato fuori tutta la strada. Ripetutamente aspirare etanolo dal piatto ed espellere tutta la strada fuori almeno 5 volte. </li><li> Lavare la cartuccia siringa aspirando e espellendo acqua sterile almeno 5 volte. Luogo siringa in modo sicuro da parte nel cofano della cultura e lasciarlo asciugare. </li><li> Rimuovere le scorte virale da -80 ° C e magazzini frigoriferi, posto sul ghiaccio per consentire lo scongelamento. Microiniezione richiede 2μL di azioni virali per il mouse ad un titolo di 10 9 unità infettive / mL. Lentivirus possono essere ottenute da fonti commerciali o prodotte in laboratorio secondo il protocollo stabilito (Lois et al., 2002). </li><li> Preparare una fase di iniezione che prevede una zona rialzata rispetto la superficie del cofano - può utilizzare una capsula di Petri 10 centimetri coperta con un foglio di Kimwipe. </li><li> Disporre cotone imbevuto di alcol nei pressi della stazione di iniezione. </li></ol> 2. Microiniezione di particelle lentivirali nell&#39;epitelio olfattivo Tutte le procedure di animali effettuati in questo metodo sono fatto in base alle linee guida approvate IACUC. Il Mus musculus ceppo C57BL/6J è il modello animale utilizzato in tutti gli esperimenti hanno dimostrato qui. <ol><li> Anestetizzare cuccioli di topo da ipotermia prendendo un topo cucciolo (P0-P3) fuori dalla gabbia e mettendo il cucciolo su un taglio aperto guanto in ghiaccio per 5 minuti. </li><li> In attesa che il cucciolo di essere completamente anestetizzato, 2μL aspirato di magazzino virale nella siringa sterilizzata Hamilton. </li><li> Posizionare il mouse cucciolo in cima alla fase di iniezione. Tirare delicatamente la pelle dalla parte superiore della testa all&#39;orecchio verso la parte superiore del collo. Questo dovrebbe fornire una superficie cutanea insegnato nel corso della cavità nasale e la facilità di iniezione. </li><li> Inserire l&#39;ago attraverso la parte superiore della cavità nasale circa 3 mm sotto la superficie della pelle per raggiungere l&#39;epitelio olfattivo. Microinject 0.5μL di soluzione antivirus per colpo, la scelta di due siti per lato, sinistro e destro (quattro iniezioni totale per il mouse = 2μL di virus necessaria). Siti di iniezione devono essere sfalsati l&#39;uno dall&#39;altro. Per il targeting dei siti d&#39;iniezione appropriate, cercare la superficie dorsale del cranio per il contorno del bulbo olfattivo. Questa linea è appena visibile alla nascita attraverso la semi-trasparente la pelle e il cranio. Per fare due iniezioni per lato, mirano solo una iniezione rostrale ad una lampadina a delineare un asse mediale. Effettuare l&#39;inserimento seconda laterale alla struttura lampadina, ma assicurarsi di angolo l&#39;iniezione medialmente in modo che si può raggiungere l&#39;epitelio olfattivo che si trova ventralmente sotto il bulbo. Evitare di penetrare il bulbo olfattivo! </li><li> Asciugare qualsiasi soluzione residua virus o del sangue che possono sfuggire dal sito di iniezione o aperture con una narice Kimwipe. Disporre immediatamente di Kimwipes nel contenitore candeggina diluita rischio biologico. </li><li> Posizionare il mouse iniettato sul letto ad acqua incubatrice. </li><li> Ripetere i passaggi 1-4 per tutti i mouse da iniettare, ricordando che avrà bisogno di circa 2μL di azioni virali per il mouse. </li><li> Lasciate che i topi recuperare sulle incubatore letto ad acqua per 30 minuti prima di tornare al loro gabbia originale nidificazione. </li><li> Smaltire fase microiniezione, salviette igienizzanti e prodotti di carta qualsiasi ulteriore pulizia nello smaltimento candeggina rischio biologico. </li><li> Pulire la siringa Hamilton da ripetuti aspirazione ed espulsione di etanolo e acqua come fatto nelle fasi di preparazione. Lasciare la siringa ad asciugare. </li><li> Per la massima efficienza di trasduzione ripetere questa procedura di nuovo in 4 ore. OSNs infetto può essere visualizzato per tutta la lunghezza della cellula in meno di tre giorni. </li></ol> 3. Immunoistochimica di galleggianti sezioni bulbo olfattivo <ol><li> Sacrificare il mouse iniettati nel punto in tempo desiderato e perfusione fissare il tessuto con il 4% paraformaldeide. Sezionare la OB. Incubare in paraformaldeide notte e il 30% di saccarosio in PBS durante la notte. Incorporare nel mezzo di inclusione ottobre in ghiaccio secco. </li><li> Coronale sezioni OB si ottengono con una 60μm di spessore utilizzando un criostato. Sweep sezioni lampadina in un piatto di 10 centimetri cultura con 5 ml 1x PBS (pH 7,4). Sezioni devono essere tenuti galleggianti in PBS per consentire ottobre a dissolve. Trasferimento sezioni galleggianti e PBS in una fiala 50mL conica. </li><li> Consentono di fare tappe di depositarsi sul fondo della fiala. Aspirare PBS senza succhiare tutte le sezioni. Sciacquare sezioni di tessuto con 20 mL di PBS. Ripetere regolare e passi l&#39;aspirapolvere. Tessuto Risospendere con 10 ml di PBS e sezioni trasferimento galleggianti in una fiala da 15 ml conica per immunocolorazione. Una volta sezioni di tessuto si sono stabiliti, aspirare PBS surnatante senza disturbare i tessuti. Sezioni Risospendere con 0,3% Triton X-100 in 1x PBS, pH 7,4 (PBS-Tx) che consente detergente per perforare le membrane cellulari. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e ripetere l&#39;incubazione con PBS-Tx due volte. </li><li> Incubare sezioni di tessuto in 10 ml di soluzione bloccante (siero di cavallo al 5% in PBS-Tx) per due ore a temperatura ambiente. </li><li> Soluzione di risciacquo bloccare almeno due volte con PBS-Tx per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Preparare 2 ml di una soluzione di anticorpo primario in PBS-Tx. Reagenti e vedere sezione Attrezzature per gli anticorpi utilizzati in questo esperimento. </li><li> Sostituire il secondo PBS-Tx lavare il blocco con una soluzione di anticorpo primario. Incubare su una piattaforma lentamente a dondolo (~ 30rpm) a 4 ° C per 24-48 ore per permettere una buona penetrazione nelle sezioni 60μm galleggiante. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, la soluzione di anticorpo primario può essere recuperata con attenzione con una pipetta e conservato a 4 ° C per il riutilizzo fino a due volte nel giro di due settimane senza una significativa perdita di intensità della colorazione. </li><li> Lavare le sezioni per tre volte in PBS-Tx per 20 minuti ciascuno a temperatura ambiente con rotazione dolce (~ 30rpm). </li><li> Preparare 2 ml di diluizione anticorpo secondario in PBS-Tx. Aspirare l&#39;ultimo lavaggio e aggiungere la soluzione secondaria di anticorpi a sezioni di tessuto. Avvolgere la parte esterna della fiala colorazione foglio d&#39;alluminio per bloccare la luce, che può causare photobleaching fluoroforo. Luogo avvolto flaconcino su una piattaforma lentamente a dondolo e incubare a 4 ° C durante la notte. </li><li> Scartare la soluzione secondaria di anticorpi con un aspirapolvere distanza. Lavare le sezioni una volta con PBS-Tx per 20 minuti a temperatura ambiente. Risciacquare altre due volte con PBS (pH 7,4) per 20 minuti ciascuno a temperatura ambiente. Montare le sezioni di tessuto su vetrini colorati con Fluoromount G. </li><li> Schermo attraverso sezioni colorate per gli assoni OSN positivamente infetti e termini assone con un microscopio a fluorescenza. </li><li> Per costruire una vista tridimensionale di un marcato OSN assone e terminale pergolato, effettuare una serie di sezioni ottiche attraverso la profondità 60μm della porzione obiettivo tessuto OB (lungo l&#39;asse z) usando la microscopia confocale. </li><li> Questa pila di Z-sezione immagini possono poi essere proiettate insieme per ricostruire una prospettiva a 360 ° di rotazione di una singola etichetta OSN assone, tra cui dettaglio terminale pergolato nella sua interezza. Uno qualsiasi angolo di rotazione singoli possono essere catturati ed esportati come file immagine (es. JPG, TIFF) per la presentazione in formato 2D. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Con i metodi descritti qui, siamo in grado di trasdurre neuroni sensoriali olfattivi da lentivirus in vivo. Abbiamo così lontano OSNs visualizzati infettati con GFP e reporter mCherry fluorescenti, e con un myc-tag proteina di fusione mediante immunocitochimica. Questa tecnica offre una grande varietà di OSNs infetti. Eppure, trasduzione avviene sporadicamente abbastanza per fornire OSNs etichettate singolarmente, consentendo così l&#39;analisi della morfologia delle cellule singole. Assoni e dei terminali degli assoni sono esposte all&#39;interno di sezioni di tessuto OB in mezzo ai loro ambiente nativo di microscopia confocale (Figura 1). L&#39;intero OSN assone terminale pergolato in genere può essere catturato all&#39;interno di un 40-50 micron sezione ottica. Alto ingrandimento infetti terminali degli assoni OSN consente un&#39;analisi dettagliata dei assonale morfologia pergolato a livello glomerulare. <img src="/files/ftp_upload/2951/2951fig1.jpg" /> Figura 1. Traiettoria del singolo neurone olfattivo sensoriale assonale e il suo terminale pergolato. A) una sezione coronale del bulbo olfattivo di un mouse P7 che mostra il livello del nervo olfattivo (ONL) immunostained per OMP (rosso) e lo strato glomerulare (GL) immunostained sia con OMP e Vglut2 (grigio). Un singolo assone dei neuroni sensoriali olfattivi che esprimono GFP (verde) viaggia all&#39;interno della ONL e penetra nella struttura glomerulare. B) L&#39;assone terminale morfologia pergolato all&#39;interno del glomerulo chiaramente evidenziato dalla espressione di GFP. Vglut2 co-colorazione in grigio illumina la superficie totale glomular entro il quale la GFP-positive assone elabora un ABOR terminale. C) lentivirali OSNs infetti che esprimono GFP (verde) in OE. Il cytostructure dell&#39;epitelio olfattivo è mostrato con colorazione DAPI (blu). Espressione GFP permette la visualizzazione di corpi cellulari OSN e il loro processi cellulari in OE. D) Un assone OSN e la sua morfologia terminale con Rap1GAP2 espressione knock-down di shRNA. Lentivirus portando una cassetta a doppia espressione con Rap1GAP2 shRNA sotto il promotore del mouse U6 e GFP sotto unPromotore CMV sono stati applicati alla OE. Infetti terminali degli assoni olfattivi mostrato una più semplice terminale pergolato rispetto a quella del controllo GFP solo. Bar = 20μm.

<ol>
	<li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor.">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li><li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb:+a+long-term+study.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li><li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li></ol>

Questo protocollo è di biosicurezza di livello 2 compliant. Tutti di lavoro appropriati, protezione personale, e virali misure di contenimento dei rifiuti sono stati stabiliti di conseguenza. Tutte le procedure di animali sono stati eseguiti secondo le linee guida IACUC.

Microiniezione di risultati lentivirus in trasferimento definitivo di costrutti del gene nel DNA genomico OSN. Questo approccio ci permette di eseguire manipolazioni a breve termine oa lungo termine di geni candidati attraverso l&#39;iperespressione o mediata shRNA knock-down. Inoltre, siamo in grado di fluorescenza etichetta OSNs singolo in una linea esistente topo transgenico per osservare co-localizzazione delle popolazioni di recettore olfattivo. Microiniezione è necessaria per la trasduzione lentivirale di OSNs. A...

Microiniezione: topi appena nati sono stati microiniettati 5μL utilizzando una siringa Hamilton (Hamilton # 7647-01) con ago 33 gauge (Hamilton # 7762-06). Reagenti Immunocitochimica: anticorpi primari: GFP anticorpi policlonali di coniglio (Molecular Probes # A-6455), anticorpi policlonali contro pollo OMP (custom) (Chen et al, 2005.), Maiale d&#39;India anticorpi policlonali contro VGlut2 (Millipore # AB2251). Anticorpi secondari: Cy2 coniugato asino anti-coniglio (Jackson Immunolab # 711-225-152), Cy3-coniugati asino anti-pollo (Jackson Immunolab # 703-165-155) e Cy5-capra coniugato anti-cavia (Jackson Immunolab # 106-175-008). Le sezioni sono state montate su vetrini con Fluoromount G (Southern Biotech # 0010-01) con la soluzione 50ng/mL DAPI cromatina macchia. Confocale Imaging: Z-stack immagini sono state scattate con una Olympus Flouview FV1000 microscopio confocale e le immagini raccolte e trasformate in proiezioni in 3D utilizzando Olympus FV10-ASW acquisizione confocale 2.01 e software di analisi.

lentivirus-mediated genetic manipulation and visualization of olfactory sensory neurons in vivo

Sviluppo di un circuito preciso olfattivo si basa sulla proiezione accurata dei neuroni sensoriali olfattivi (OSN) assoni ai loro bersagli sinaptici nel bulbo olfattivo (OB). I meccanismi molecolari della crescita degli assoni OSN e targeting non sono ben compresi. L&#39;espressione genica e la successiva manipolazione di visualizzazione degli assoni OSN singoli e la loro morfologia terminale pergolato finora sono stati difficili. Per studiare la funzione dei geni a livello di singola cellula all&#39;interno di un periodo di tempo specificato, abbiamo sviluppato una tecnica basata lentivirale per manipolare l&#39;espressione genica in OSNs in vivo. Particelle lentivirali sono consegnati a OSNs dalla microiniezione nell&#39;epitelio olfattivo (OE). Cassette di espressione sono poi definitivamente integrata nel genoma di OSNs trasdotte. Espressione della proteina fluorescente verde identifica OSNs infetti e delinea la loro morfologia, inclusi il terminale assone pergolato. A causa del tempo di risposta brevi tra microiniezione e la rilevazione giornalista, studi di funzione del gene può essere concentrato in un periodo molto ristretto di sviluppo. Con questo metodo, abbiamo rilevato espressione GFP all&#39;interno da un minimo di tre giorni e fino a tre mesi dopo l&#39;iniezione. Abbiamo raggiunto entrambi over-espressione e shRNA mediata knock-down da microiniezione lentivirali. Questo metodo fornisce morfologie dettagliate di corpi cellulari OSN e assoni a livello di singola cellula in vivo, e permette quindi la caratterizzazione della funzione del gene candidato durante lo sviluppo olfattivo.

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Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Vi presentiamo una tecnica lentivirali per la manipolazione genetica e la visualizzazione di singoli assoni dei neuroni sensoriali olfattivi e la sua arborizzazione terminale<em&gt; In vivo</em&gt;.

Lentivirus-mediata manipolazione genetica e la visualizzazione dei neuroni sensoriali olfattivi In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

lentivirus-mediated-genetic-manipulation-visualization-olfactory

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Neuroscience

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

15.5K Views.  University of California, Davis. Vi presentiamo una tecnica lentivirali per la manipolazione genetica e la visualizzazione di singoli assoni dei neuroni sensoriali olfattivi e la sua arborizzazione terminale In vivo.

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Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Analizzando le risposte di topo neuroni olfattivi sensoriali che utilizzano l&#39;aria in fase di registrazione Electroolfactogram

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

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Neuroscienze

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Targeting neuroni bulbo olfattivo utilizzo combinato In Vivo Elettroporazione e GAL4-Based Enhancer Trappola Linee Zebrafish

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Fotolisi lampo di composti Caged nel Cilia di neuroni sensoriali olfattivi

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Selettiva trasduzione virale di neuroni olfattivi per adulti nati per cronica In vivo Optogenetic Stimolazione

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo preparati della lampadina vomeronasale Organo e accessori olfattivo intatto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforato Patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi In neuroepithelium intatto: Analisi funzionale di neuroni Esprimendo un Identificato odorizzante Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.