Lavoro supportato da National Institutes of Health sovvenzioni R01DC10146/R01DC010397, dell&#39;NIDCD P30 DC006276 Core Research, e istituti di istruzione superiore. Il suo contenuto è esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIH o istituti di istruzione superiore. Gli autori dichiarano assenza di conflitto attuale o potenziale di interesse.

1. Isolamento di OHC <ol><li> Iniziare questa procedura per la raccolta delle ossa temporali da cavie, topi o il vostro modello animale dei mammiferi. </li><li> Quindi, aprire le ossa temporali utilizzando una pinza martello al fine di esporre la coclea, e immergile nella Leibovitz L-15. Togliere l&#39;eccesso di osso con attenzione, mantenendo intatto il guscio osseo. Considerando che questa è una procedura generale applicabile alle ossa temporale di qualsiasi specie di mammiferi, piccole modifiche alla tecnica può essere necessaria quando si tratta di ossa temporali da animali molto piccoli. Negli animali vecchi della bolla di solito è calcificato, introducendo un&#39;ulteriore complicazione alla procedura. </li><li> Sotto osservazione microscopica, aprire la regione apicale della coclea e rimuovere vascularis stria e del legamento spirale usando la punta della lama di un bisturi # 11, un punto di micro e scegliere una pinzetta sottile. </li><li> Prendete l&#39;Organo di Corti fuori dal modiolus cocleare con la pinzetta, e lo mise in collagenasi 1mg/ml in L-15 a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Se OHC da trasforma basale della coclea sono necessari, rimuovere il guscio osseo che copre la base della coclea con il piccone, e separare la spirale dal dell&#39;osso temporale con il bisturi prima di rimuovere l&#39;organo di Corti. </li><li> Trasferimento dell&#39;organo del Corti alla camera di registrazione con una siringa da 50 microlitri Hamilton. In seguito, le cellule si dissociano da reflusso attraverso l&#39;ago. </li></ol> 2. Setup sperimentale <ol><li> Schema del campo elettrico alternato Esterne (EAEF) generatore e il loro collegamento con il sistema di acquisizione delle immagini (fig. 1). La circuiteria di controllo è stato appositamente implementato presso il Nucleo di Ingegneria dell&#39;Università degli Ear House Institute. </li><li> Il setup sperimentale utilizzato nei nostri esperimenti è costituito da un microscopio Axiovert 135TV invertito (Zeiss, Thornwood, NY) con un&#39;alternativa basata su LED sistema di illuminazione (LED ad alta potenza del sistema-36AD3500, tecnologie Lightspeed, Campbell, CA), due micromanipolatori elettronica (Eppendorf &quot;PatchMan&quot;, Germania), un PC controllato ad altissima velocità Photron Fastcam X 1024 PCI fotocamera (Photron USA Inc.) nel porto Keller e una telecamera aggiuntiva CCD regolari nel porto trinoculare. La fotocamera Fastcam è in grado di catturare immagini ad alta frequenza (fino a 100.000 fps) e ad alta risoluzione (ad esempio, 1024 x 1024 pixel a 1000 fps, 512 x 128 a 10.000 fps, 384 x 96 a 18.000 fps, e così via). Le immagini fornite dalla telecamera ad alta velocità sono osservati direttamente nel monitor del PC, mentre la telecamera CCD è collegata a un altro monitor. Il LED basati su sistema di illuminazione funziona in due modalità differenti: a bassa potenza analogico e digitale ad alta potenza. Tutte le procedure preliminari (posizionamento elettrodi, posizionamento delle cellule, fuoco, ecc) sono eseguite utilizzando le modalità di risparmio energetico analogica. L&#39;elevata potenza di illuminazione si accende l&#39;apertura l&#39;otturatore della fotocamera e poi spenta con la chiusura dell&#39;otturatore, facilitando la dissipazione del calore. Software fatto in casa, anche sviluppato presso il Nucleo Ear Casa Engineering Institute, in esecuzione sullo stesso PC controlla il grilletto della telecamera ad alta velocità, il LED basato su sistema di illuminazione, e la EAEF. Una macchina fotografica digitale convenzionale in porto frontale permette di fotogrammi, se necessario. (Fig. 2 A). </li><li> Elettrodi (due 0,25 millimetri di diametro fili di Ag con la distanza punta di 0,8 mm) sono spinti a posizione utilizzando uno dei micromanipolatori elettronico. Posizione elettrodi &#39;è monitorato visivamente e attraverso l&#39;immagine microscopica, un cambiamento nel piano focale dell&#39;immagine indica che gli elettrodi toccato il fondo della camera sperimentale. Inizialmente, il campo elettrico viene calibrato utilizzando un elettrodo esterno. Questo elettrodo misura il potenziale elettrico in punti differenti, generando una &quot;mappa&quot; del campo elettrico. Se una singola cellula isolata ciliate esterne è posto tra le punte degli elettrodi con il suo asse longitudinale parallelo alla EAEF applicata, si muoverà allungamento e accorciamento alla stessa frequenza del campo elettrico. Se la cella è posizionato perpendicolarmente al campo un diverso tipo di risposta OHC (flessione) possono essere osservati e studiati. (Fig. 2 B) </li></ol> 3. EAEF stimolazione e l&#39;acquisizione delle immagini <ol><li> Quattro diversi protocolli di stimolazione sono selezionabili (Fig. 3): <ol><li> continuo singola frequenza (Fig. 3 A). Si noti che tipo di modalità di stimolo, frequenza, ampiezza e onda può essere selezionata usando il fatto in casa software di controllo (cerchi rossi). </li><li> scoppiata singola frequenza (Fig. 3 B). La lunghezza delle esplosioni e le lacune tra scoppio sono selezionabili. </li><li> lineare sweep (fig. 3 C). Le frequenze iniziale e finale sono selezionabili. </li><li> multi-stimolazione (Fig. 3 D). Singola frequenza e spazza lineari possono essere combinati in un singolo esperimento. Dopo aver selezionato i parametri corrispondenti, il software di controllo configura il sistema e consente all&#39;operatore di avviare luce sincronizzato registrazione video e la stimolazione delle cellule facendo clic su un solo pulsante insullo schermo del computer. </li></ol></li><li> Le immagini sono catturati in formato AVI per ulteriori analisi ad alte frequenze. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati <ol><li> In questo film, due cellule ciliate esterne isolate mostrano cambiamenti nella lunghezza e curvatura, quando sono stimolati da un campo elettrico alternato esterna che è parallela o trasversale, rispettivamente, al loro asse longitudinale. (Movie # 2). </li><li> Risposte OHC mobili vengono analizzati off-line utilizzando il software ProAnalyst (Xcitex Inc., Cambridge, MA). &quot;Tracking Feature&quot; funzione di questo software fornisce la distanza tra due punti di frame-by-frame (Fig. 4). Nel corso delle cellule accorciare la distanza tra i punti selezionati al vertice (cuticolare piatto, di colore rosso) e la base della cellula (polo basale, di colore verde) è più piccolo, e aumenta con l&#39;allungamento delle cellule. Il filmato mostra il software di analisi fotogramma per fotogramma le variazioni di lunghezza. Il pannello in basso l&#39;immagine mostra la traccia del movimento. In questo esempio, la variazione totale in lunghezza è di circa 6,5 ​​pixel. </li><li> &quot;Contour Tracking&quot; funzione nel software ProAnalyst in grado di rilevare automaticamente i bordi delle cellule e misurare l&#39;area della sezione ottica (Fig. 5). </li><li> Microsfere di polistirolo aggiunto alla soluzione del bagno in modo casuale e fermamente allegare alla membrana plasmatica (Fig. 6 A). Diverse microsfere possono essere selezionati contemporaneamente, e il software può automaticamente traccia di tutti i loro fotogramma per fotogramma. In questo modo, le cellule possono essere divise in sezioni e la motilità di ogni sezione valutato in maniera indipendente. (Fig. 6 A) </li><li> Selezionando microsfere trova al margine laterale dell&#39;immagine cellula, variazioni di lunghezza di ciascun segmento e cambiamenti di angolo di un segmento rispetto ad altri (flessione) può anche essere valutato in maniera indipendente. (Fig. 6B) </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Schema del generatore EAEF e sui loro collegamenti con il sistema di acquisizione dell&#39;immagine. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Un&#39;immagine) del setup sperimentale. B) Particolare del palco microscopio, con vignette raffiguranti il ​​elettrodi e una singola OHC posto tra loro con il suo parallelo all&#39;asse longitudinale del campo elettrico. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. A) Interfaccia utente del software di controllo fatto in casa configurato per singola frequenza di stimolazione. I parametri selezionati sono cerchiati in rosso. B) l&#39;interfaccia utente del fatto in casa software di controllo configurato per scoppiare a frequenza singola stimolazione. C) l&#39;interfaccia utente del fatto in casa software di controllo configurato per la stimolazione scansione lineare. D) Interfaccia utente del software di controllo fatto in casa configurato per il multi-stimolazione. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Singolo fotogramma di uno OHC con due punti selezionati alla base (verde) e l&#39;apice (rosso) della cellula, rispettivamente, con il &quot;tracking Feature&quot; funzione del software ProAnalyst. La curva sotto la cella mostra le variazioni periodiche della distanza tra i punti selezionati associati con la stimolazione elettrica. Spostando la barra verticale telai differenti possono essere selezionati per l&#39;analisi individuale. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Il &quot;Monitoraggio Contour&quot; funzione ProAnalyst rileva il bordo delle cellule e automaticamente misurare l&#39;area della sezione ottica. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Un&#39;immagine) Catturato un OHC isolato decorato con microsfere di polistirolo (in alto), e la stessa immagine con cinque microsfere selezionati singolarmente (in basso). Un colore diverso è stato assegnato a ogni microsfera, ed i loro spostamenti possono essere individualmente e automaticamente fotogramma per fotogramma monitorati, analizzati e confrontati. B) segmenti di lunghezza arbitraria può essere definito selezionando polistirolo microsfere trova al margine della cellula, e variazioni di lunghezza di questi segmenti così come i cambiamenti di orientamento di un segmento rispetto ad altri (cella di piegatura) possono essere valutate automaticamente fotogramma per telaio con il software di analisi delle immagini. Movie 1. Isolamento di Guinea OHC maiale. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie1_web.mov">Clicca qui per guardare il video</a> Movie 2. OHC parallela e perpendicolare al EAEF mostrando electromotility tipici e le risposte di curvatura. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie2_web.mov">Clicca qui per guardare il video</a>

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	<li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+insights+into+the+morphogenesis+of+inner+ear+hair+cells.">Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells.</a> Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).</li><li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+outer+hair+cell+motility.">Cochlear outer hair cell motility.</a> Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).</li><li>Dallos, P., Fakler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestin,+a+new+type+of+motor+protein.">Prestin, a new type of motor protein.</a> Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 104-111 (2002).</li><li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+outer+hair+cell+bending+in+an+external+electrical+field.">Cochlear outer hair cell bending in an external electrical field.</a> Biophys. J. 73, 1665-1672 (1997).</li><li>Matsumoto, N., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+Prestin-Dependent+and+Prestin-Independent+Components+from+Complex+Motile+Responses+in+Guinea+Pig+Outer+Hair+Cells.">Extraction of Prestin-Dependent and Prestin-Independent Components from Complex Motile Responses in Guinea Pig Outer Hair Cells.</a> Biophys J. 89, 4343-4351 (2005).</li><li>Matsumoto, N., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestin-dependent+and+prestin-independent+motility+of+guinea+pig+outer+hair+cells.">Prestin-dependent and prestin-independent motility of guinea pig outer hair cells.</a> Hear Res. 208, 1-12 (2005).</li><li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+remarkable+cochlear+amplifier.">The remarkable cochlear amplifier.</a> Hear Res. 266, 1-17 (2010).</li><li>Kitani, R., Kakehata, S., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+responses+of+cochlear+outer+hair+cells+stimulated+with+an+alternating+electrical+field.">Motile responses of cochlear outer hair cells stimulated with an alternating electrical field.</a> Hearing Research. , (2011).</li><li>Dallos, P., Evans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+outer+hair+cell+motility:+corrections+and+addendum.">High-frequency outer hair cell motility: corrections and addendum.</a> Science. 268, 1420-1421 (1995).</li><li>Frank, G., Hemmert, W., Gummer, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+dynamics+of+high-frequency+electromechanical+transduction+in+outer+hair+cells.">Limiting dynamics of high-frequency electromechanical transduction in outer hair cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 4420-4425 (1999).</li><li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+frequency+limit+and+phase+of+outer+hair+cell+motility:+effects+of+the+membrane+filter.">On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter.</a> J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).</li><li>Inou&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Video Microscopy. , (1986).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo sperimentale presentato qui permette di valutare le risposte OHC mobili della gamma kHz senza alcuna restrizione al movimento della cellula. Protocolli di stimolazione differenti, altri marker (microsfere), come pure i cambiamenti nell&#39;orientamento della cella con riguardo al campo elettrico, permettono di indagare nuovi aspetti della motilità OHC con un livello di dettaglio precedentemente inaccessibili. Altri metodi, ad esempio quelli che utilizzano fotodiodi 9 o laser Doppler vibrometria <su...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 </td><td> Gibco </td><td> 21083 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi (Tipo 4) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5138 </td><td> 1mg/mL in L-15 </td></tr></tbody></table>

investigating outer hair cell motility with a combination of external alternating electrical field stimulation and high-speed image analysis

OHC sono cilindriche cellule sensomotorio trova l&#39;organo del Corti, l&#39;organo uditivo all&#39;interno dell&#39;orecchio interno dei mammiferi. Il nome &quot;cellule ciliate&quot; deriva dal loro caratteristico fascio apicale di stereociglia, un elemento critico per la rilevazione e trasduzione di energia sonora 1. OHC sono in grado di cambiare forma-allungare, accorciare e piegare-in risposta alla stimolazione elettrica, meccanica e chimica, una risposta motoria considerato cruciale per l&#39;amplificazione di segnali acustici cocleari 2. Stimolazione OHC induce due risposte diverse mobili: i) electromotility, alias motilità veloce, variazioni di lunghezza nel range microsecondo derivati ​​da cambiamenti conformazionali a trazione elettrica in proteine ​​motrici densamente OHC nella membrana plasmatica, e ii) la motilità lenta, cambia forma nel millisecondi a secondi gamma di riorganizzazione del citoscheletro 2, 3. OHC flessione è associato con electromotility, e il risultato sia da una distribuzione asimmetrica delle proteine ​​motrici nella membrana plasmatica laterale, o asimmetrica stimolazione elettrica di queste proteine ​​motore (ad esempio, con un campo elettrico perpendicolare all&#39;asse lungo delle cellule) 4. Stimoli meccanici e chimici inducono risposte mobili essenzialmente lento, anche se i cambiamenti nelle condizioni ionico delle cellule e / o del loro ambiente può anche stimolare la membrana plasmatica-embedded proteine ​​motrici 5, 6. Dal momento che le risposte OHC mobili sono una componente essenziale dell&#39;amplificatore cocleare, l&#39;analisi qualitativa e quantitativa di queste risposte mobili a frequenze acustiche (approssimativamente da 20 Hz a 20 kHz negli esseri umani) è una questione molto importante nel campo della ricerca dell&#39;udito 7. Lo sviluppo della nuova tecnologia di imaging ad alta velocità che unisce telecamere, sistemi basati su LED di illuminazione e sofisticati software di analisi dell&#39;immagine offre ora la possibilità di eseguire qualitativo affidabile e studi quantitativi della risposta mobili di OHC isolato in un campo elettrico alternato esterno (EAEF) 8. Questa è una tecnica semplice e non invasivo che aggira la maggior parte dei limiti degli approcci precedenti 9-11. Inoltre, il LED basato su sistema di illuminazione fornisce luminosità estrema con insignificanti effetti termici sui campioni e, per l&#39;uso della microscopia video, risoluzione ottica è di almeno 10 volte più alta rispetto alle tradizionali tecniche di microscopia ottica 12. Ad esempio, con l&#39;impostazione sperimentale descritta qui, variazioni di lunghezza delle cellule di circa 20 nm, possono essere regolarmente rilevati e affidabile a frequenze di 10 kHz, e questa risoluzione può essere ulteriormente migliorati a frequenze più basse. Siamo fiduciosi che questo approccio sperimentale contribuirà a estendere la nostra comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari alla base della motilità OHC.

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Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

Un metodo affidabile per studiare delle cellule esterne capelli (OHC) risposte di mobili, tra cui electromotility, motilità lenta e flessione, è descritto. Motilità OHC è provocato dalla stimolazione con un esterno di campo elettrico alternato, e il metodo si avvale di alte velocità di registrazione delle immagini, a base di illuminazione a LED, e l&#39;ultima generazione di software di analisi di immagine.

Indagare esterno motilità delle cellule dei capelli con una combinazione di stimolazione esterna alternata campo elettrico e ad alta velocità Image Analysis

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

investigating-outer-hair-cell-motility-with-combination-external

Research

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Neuroscience

13.4K Views.  House Ear Institute. Un metodo affidabile per studiare delle cellule esterne capelli (OHC) risposte di mobili, tra cui electromotility, motilità lenta e flessione, è descritto. Motilità OHC è provocato dalla stimolazione con un esterno di campo elettrico alternato, e il metodo si avvale di alte velocità di registrazione delle immagini, a base di illuminazione a LED, e l'ultima generazione di software di analisi di immagine.

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TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: Utilizzo del Theta Burst protocollo Esplora Mechasnism di plasticità in individui con Sindrome X Fragile e autismo

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

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Neuroscienze

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

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Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Cellula intera Patch Clamp per lo studio dei meccanismi di Infrared Stimolazione Neurale

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

A Human-machine-interface Integrating Low-cost Sensors with a Neuromuscular Electrical Stimulation System for Post-stroke Balance Rehabilitation

A stroke is caused when an artery carrying blood from heart to an area in the brain bursts or a clot obstructs the blood flow to brain thereby preventing delivery of oxygen and nutrients. About half of the stroke survivors are left with some degree of disability. Innovative methodologies for restorative neurorehabilitation are urgently required to reduce long-term disability. The ability of the nervous system to reorganize its structure, function and connections as a response to intrinsic or extrinsic stimuli is called neuroplasticity. Neuroplasticity is involved in post-stroke functional disturbances, but also in rehabilitation. Beneficial neuroplastic changes may be facilitated with non-invasive electrotherapy, such as neuromuscular electrical stimulation (NMES) and sensory electrical stimulation (SES). NMES involves coordinated electrical stimulation of motor nerves and muscles to activate them with continuous short pulses of electrical current while SES involves stimulation of sensory nerves with electrical current resulting in sensations that vary from barely perceivable to highly unpleasant. Here, active cortical participation in rehabilitation procedures may be facilitated by driving the non-invasive electrotherapy with biosignals (electromyogram (EMG), electroencephalogram (EEG), electrooculogram (EOG)) that represent simultaneous active perception and volitional effort. To achieve this in a resource-poor setting, e.g., in low- and middle-income countries, we present a low-cost human-machine-interface (HMI) by leveraging recent advances in off-the-shelf video game sensor technology. In this paper, we discuss the open-source software interface that integrates low-cost off-the-shelf sensors for visual-auditory biofeedback with non-invasive electrotherapy to assist postural control during balance rehabilitation. We demonstrate the proof-of-concept on healthy volunteers.

A novel low-cost human-machine interface for interactive post-stroke balance rehabilitation system is presented in this article. The system integrates off-the-shelf low-cost sensors towards volitionally driven electrotherapy paradigm. The proof-of-concept software interface is demonstrated on healthy volunteers.

Un uomo-macchina-interfaccia Integrazione di sensori a basso costo con una stimolazione del sistema neuromuscolare elettrica per post-ictus Balance riabilitazione

A stroke is caused when an artery carrying blood from heart to an area in the brain bursts or a clot obstructs the blood flow to brain thereby preventing ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels). The present protocol describes how this method can be used to stimulate the posterior tibial nerve that activates plantar flexor muscles. Percutaneous electrical nerve stimulation consists of inducing an electrical stimulus to a motor nerve to evoke a muscular response. Direct (M-wave) and/or indirect (H-reflex) electrophysiological responses can be recorded at rest using surface electromyography. Mechanical (twitch torque) responses can be quantified with a force/torque ergometer. M-wave and twitch torque reflect neuromuscular transmission and excitation-contraction coupling, whereas H-reflex provides an index of spinal excitability. EMG activity and mechanical (superimposed twitch) responses can also be recorded during maximal voluntary contractions to evaluate voluntary activation level. Percutaneous nerve stimulation provides an assessment of neuromuscular function in humans, and is highly beneficial especially for studies evaluating neuromuscular plasticity following acute (fatigue) or chronic (training/detraining) exercise.

We present a protocol to assess changes in neuromuscular function. Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method that evokes muscular responses. Electrophysiological and mechanical properties of these responses permit the evaluation of neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels).

Valutazione della Neuromuscolare Funzione Con percutanea stimolazione elettrica del nervo

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central nervous system. Changes in ENS function are a major cause of GI symptoms and disease and may contribute to GI symptoms reported in neuropsychiatric disorders including autism. It is well established that isolated colon segments generate spontaneous, rhythmic contractions known as Colonic Migrating Motor Complexes (CMMCs). A procedure to analyze the enteric neural regulation of CMMCs in ex vivo preparations of mouse colon is described. The colon is dissected from the animal and flushed to remove fecal content prior to being cannulated in an organ bath. Data is acquired via a video camera positioned above the organ bath and converted to high-resolution spatiotemporal maps via an in-house software package. Using this technique, baseline contractile patterns and pharmacological effects on ENS function in colon segments can be compared over 3-4 hr. In addition, propagation length and speed of CMMCs can be recorded as well as changes in gut diameter and contraction frequency. This technique is useful for characterizing gastrointestinal motility patterns in transgenic mouse models (and in other species including rat and guinea pig). In this way, pharmacologically induced changes in CMMCs are recorded in wild type mice and in the Neuroligin-3R451C mouse model of autism. Furthermore, this technique can be applied to other regions of the GI tract including the duodenum, jejunum and ileum and at different developmental ages in mice.

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

Video Imaging e mappe spazio-temporale per analizzare la motilità gastrointestinale nei topi

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific frequency and in turn modulate ongoing cortical oscillatory activity. This neurotool allows the establishment of a causal link between endogenous oscillatory activity and behavior. Most of the tACS studies have shown online effects of tACS. However, little is known about the underlying action mechanisms of this technique because of the AC-induced artifacts on Electroencephalography (EEG) signals. Here we show a unique approach to investigate online physiological frequency-specific effects of tACS of the primary motor cortex (M1) by using single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) to probe cortical excitability changes. In our setup, the TMS coil is placed over the tACS electrode while Motor Evoked Potentials (MEPs) are collected to test the effects of the ongoing M1-tACS. So far, this approach has mainly been used to study the visual and motor systems. However, the current tACS-TMS setup can pave the way for future investigations of cognitive functions. Therefore, we provide a step-by-step manual and video guidelines for the procedure.

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) allows the modulation of cortical excitability in a frequency-specific fashion. Here we show a unique approach which combines online tACS with single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) in order to "probe" cortical excitability by means of Motor Evoked Potentials.

Effetti della stimolazione transcranica con corrente alternata la corteccia motoria primaria di approccio combinato Online con stimolazione magnetica transcranica

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in humans is transcranial direct current stimulation (tDCS). Less frequently, transcranial alternating current stimulation (tACS) or transcranial random noise stimulation (tRNS), a specific form of tACS using an electrical current applied randomly within a pre-defined frequency range, is used. The increase of noninvasive electrical brain stimulation research in humans, both for experimental and clinical purposes, has yielded an increased need for basic, mechanistic, safety studies in animals. This article describes a model for transcranial electrical brain stimulation (tES) through the intact skull targeting the motor system in alert rodents. The protocol provides step-by-step instructions for the surgical set-up of a permanent epicranial electrode socket combined with an implanted counter electrode on the chest. By placing a stimulation electrode into the epicranial socket, different electrical stimulation types, comparable to tDCS, tACS, and tRNS in humans, can be delivered. Moreover, the practical steps for tES in alert rodents are introduced. The applied current density, stimulation duration, and stimulation type may be chosen depending on the experimental needs. The caveats, advantages, and disadvantages of this set-up are discussed, as well as safety and tolerability aspects.

This protocol describes a surgical set-up for a permanent epicranial electrode socket and an implanted chest electrode in rodents. By placing a second electrode into the socket, different types of transcranial electrical brain stimulation can be delivered to the motor system in alert animals through the intact skull.

Stimolazione elettrica cerebrale transcranica in roditori avvisi

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

Stimolazione elettrica transcranica cronica e registrazione intracorticale in ratti

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

Risposta uditiva del tronco cerebrale ed esterna della cellula ciliata cellule intere Patch Clamp registrazione in ratti postnatali

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...