Questa pratica può aiutarci a studiare i cambiamenti dinamici dei componenti nano strutturali del macchinario meccanico di trasduzione elettrica sulla superficie dei fasci di stereociglia delle cellule ciliate. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'imaging time-lapse della superficie di cellule viventi con topografia complessa a risoluzione di un singolo nanometro e senza entrare in contatto fisico con il campione. Questa tecnica può essere applicata a quasi tutte le cellule viventi.
In precedenza abbiamo abbinato la superficie delle linee cellulari epiteliali polmonari infettate da virus, cellule muscolari, in My Image Bacteria Soon. Testare le nanopipette all'inizio di ogni sessione di imaging. Dopo aver fabbricato una nanopipetta, controllare la presenza di bolle, rimuovere eventuali bolle se presenti e montare la nanopipetta sul porta pipette per microscopio a conduttanza ionica della sonda saltellante.
A quattro millilitri di soluzione da bagno alla camera e posizionare la camera sullo stadio HPICM. Introdurre l'elettrodo di massa nella soluzione del bagno e assicurarsi che la tensione applicata alla pipetta attraverso l'amplificatore patch clamp sia pari a zero. Dopo aver posizionato il micropolatore in posizione verticale, spostare la pipetta in Z fino a quando non tocca il liquido e impostare l'offset dell'amplificatore a zero, prima di aggiungere più 100 millivolt per controllare la corrente della pipetta.
Utilizzare la colla al silicio per collegare lo standard di calibrazione AFM alla camera e coprire il campione con quattro millilitri di HBSS. Utilizzare nastro biadesivo per fissare la camera allo stadio X Y della configurazione HPICM e caricare una nuova nanopipetta sul supporto, come dimostrato. Dopo aver testato la resistenza e il diametro della nanopipetta, impostare la corrente su un nano amplificatore.
Utilizzare un manipolatore a morsetto a patch grossolano per posizionare la nanopipetta approssimativamente sopra il centro dello standard di calibrazione e aumentare il set point mentre si monitora il segnale dal sensore dell'attuatore piezoelettrico Z su un oscilloscopio in tempo reale. Dopo aver stabilito un ciclo di avvicinamento Z ripetibile stabile, diminuire il set point al valore appena sopra il punto di instabilità e spostare la pipetta verso il basso ad una velocità di circa cinque micron al secondo, fino a raggiungere il campione. Il livello inferiore del segnale di posizionamento Z in tempo reale aumenterà, indicando che la nanopipetta viene prelevata a causa del rilevamento della superficie del campione.
A causa del montaggio irregolare sullo standard AFM, il punto più alto dell'area di interesse potrebbe essere sconosciuto. Pertanto, impostare l'ampiezza della retrazione della pipetta su almeno 200-500 nanometri. Facendo attenzione a non superare il limite superiore del movimento dell'attuatore piezoelettrico Z, iniziare l'imaging a bassa risoluzione.
Una volta identificato il punto più alto del campione nell'area di imaging, diminuire l'ampiezza del salto e ritrarre la pipetta di circa 200 micron lungo l'asse Z per evitare qualsiasi collisione indesiderata con il campione prima di spostarlo in una nuova posizione X Y. Quando l'area di interesse è stata individuata, iniziare a visualizzare le immagini a una risoluzione più elevata. Per l'imaging delle cellule ciliate uditive, fissare saldamente un organo di Corti appena isolato in una camera utilizzando filo interdentale o pipette di vetro flessibili.
Utilizzare nastro biadesivo per fissare saldamente la camera allo stadio piezoelettrico X Y e caricare una nuova nanopipetta sul supporto, come dimostrato. Dopo aver controllato la resistenza della nanopipetta, utilizzare il micropolatore patch clamp per posizionare la nanopipetta sulla regione delle cellule ciliate mentre si osserva l'organo della pianta Corti X in un microscopio invertito. Registrare la corrente in tempo reale e il segnale di posizionamento Z sull'oscilloscopio per verificare se il sistema è stabile con un set point dello 0,5% o inferiore, determinare il set point ottimale e avvicinarsi al campione come dimostrato.
Eseguire l'imaging a bassa risoluzione del campione come dimostrato utilizzando un'ampiezza di salto di almeno sei-otto micron. Se la nanopipetta deve essere spostata in una nuova posizione X Y, ritrarre la pipetta di circa 500 nanometri per evitare una collisione con qualsiasi caratteristica alta all'interno del tessuto e ripetere l'imaging HPICM a bassa risoluzione fino alla regione di interesse in cui si trovano le cellule ciliate. Quindi visualizza la regione di interesse a una risoluzione più elevata in 15 minuti o meno.
Il protocollo HPICM può essere utilizzato per visualizzare qualsiasi cellula viva con una topografia complessa, come i fasci di cellule ciliate uditive di ratto vivo. Nonostante dimostrino una risoluzione X Y inferiore rispetto alle immagini al microscopio elettronico a scansione, le immagini HPICM possono risolvere con successo le diverse file di stereociglia. La forma delle punte stereociliari e persino i piccoli collegamenti a cinque nanometri che collegano gli stereocili adiacenti.
Data la natura senza contatto dell'imaging HPICM, l'imaging time-lapse continuo dello stesso fascio di cellule ciliate può essere eseguito per diverse ore senza danneggiare la coesione del fascio. Si noti che con un set point molto basso, il sistema potrebbe interpretare piccole fluttuazioni della corrente come incontro con la superficie della cella, portando al rumore del punto bianco nell'immagine. Allo stesso modo, grandi ampiezze di hop potrebbero aumentare la risonanza laterale della pipetta, con conseguente produzione di pixel rumorosi.
Al contrario, se l'ampiezza del salto è troppo piccola o il setpoint è troppo alto, la nanopipetta potrebbe collidere con il campione con conseguente artefatti di imaging o danni al fascio di capelli. La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è di trascorrere meno di 15 minuti per fascio di cellule ciliate quando si lavora con cellule vive. Dopo aver ottenuto un'immagine del fascio di capelli, si potrebbe tentare di ottenere registrazioni a canale singolo da posizioni specifiche sulla superficie degli stereociglia per rispondere alle domande sulle proprietà del canale di meccanotrasduzione.
