Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'udito e dell'equilibrio. Descrive come rilevare due aspetti importanti della funzione sensoriale delle cellule ciliate, la meccanotraduzione e l'attività presnaptica. I principali vantaggi di questa tecnica sono che ci consente di visualizzare la funzione delle cellule ciliate in un animale vivo e di studiare come raccolte di cellule ciliate rilevano e trasmettono informazioni sensoriali.
Per iniziare questa procedura, utilizzare pinze sottili e filo di tungsteno per modellare i perni da utilizzare per immobilizzare la larva attraverso la testa e la coda, sull'incapsulante indurito. Per creare perni della testa, tenere un pezzo di filo di tungsteno da 0,035 millimetri in una mano. Usando forcep fini nell'altra mano, piegare il filo di un millimetro verso l'alto dalla fine, a 90 gradi.
Scambiare le pini con forbici fini e tagliare un millimetro dopo la piegatura, per creare il perno. Quindi utilizzare le pin per inserire i perni nell'incapsulamento indurito sulla camera. Posizionare la larva al centro della camera di perfusione in modo che si trovi piatta su un lato contro l'incapsulante in silicone.
Usando pin fini, portare il perno della testa di 0,035 millimetri verso il basso perpendicolarmente alla larva. Inserire il perno della testa tra l'occhio e la vescicola otica e scendere nell'incapsulante. Usa un secondo set di pinps per stabilizzare la larva lungo il suo lato dorsale e ventrale, mentre si inchioda.
Assicurarsi che la parte orizzontale del perno contatti la larva e non premo fino all'incapsulante. Inclinare il perno ventralmente, o puntando leggermente verso la parte anteriore della larva, per evitare di interferire con la successiva iniezione cardiaca e l'imaging delle cellule cilide. Usando le pin, inserire un perno di coda di 0,025 millimetri nel notocordo, il più vicino possibile all'estremità della coda.
Per iniettare alfa bungarotossine nella larva, riempire tre microlitri della soluzione nell'ago di iniezione, utilizzando una punta della pipetta a caricamento del gel. Caricare la soluzione in modo uniforme sulla punta, senza bolle. Quindi inserire l'ago per iniezione cardiaca in un supporto per pipette attaccato a un micromanipolatore manuale.
Al microscopio stereo, posizionare l'ago in modo che sia allineato perpendicolarmente all'asse AP della larva anestetizzata, puntando verso il basso con un angolo di 30 gradi. Quindi, collegare il supporto della pipetta all'iniettore di pressione. Iniettare un bolo di alfa bungarotossine nella soluzione, per verificare se la punta dell'ago è chiara.
Se non viene visto alcun colore rosso, raschiare molto delicatamente la punta dell'ago contro il bordo di un perno e riprovare, fino a quando l'ago non è chiaro. Successivamente, avanzare l'ago verso il cuore, fino a quando non tocca la pelle al di fuori del cuore. Premere l'ago nella larva e cercare l'indentazione della cellula pigmentata sulla pelle di fronte al cuore per assicurarsi che l'ago sia posizionato nel piano corretto, rispetto alla larva.
Quindi, avanzare l'ago più lontano, fino a quando non perfora la pelle ed entra nella cavità cardiaca. Tirare leggermente indietro l'ago e iniettare un bolo di alfa bungarotossine nella cavità cardiaca. Cerca l'inflazione della cavità cardiaca o la tintura rossa che entra nella cavità.
Risciacquare delicatamente la larva tre volte, con un millilitro di tampone neuronale per rimuovere il MS222 residuo. Non rimuovere mai tutto il fluido. Mantenere la larva in circa 1 millilitro di tampone neuronale nella camera di perfusione.
In questa procedura riempire 10 microliter di tampone neronale in un ago fluido-getto correttamente rotto utilizzando una punta di carico del gel. Caricare la soluzione uniformemente sulla punta senza bolle. Quindi, inserire l'ago nel supporto della pipetta attaccato al micromanipolatore motorizzato.
Posizionare la camera di perfusione in un adattatore a camera circolare sullo stadio del microscopio. Spostare lo stadio motorizzato in modo che la larva si trova al centro del campo visivo. Successivamente, ruotare l'adattatore circolare della camera in modo che l'accesso AP alla larva sia approssimativamente allineato con la traiettoria dell'ago fluido-getto.
Utilizzando la luce trasmessa e il contrasto di interferenza differenziale, mettere a fuoco la larva e centrarla sotto l'obiettivo 10x. Quindi, innalza l'obiettivo 10x. Usando il micromanipolatore motorizzato, portare l'ago a getto di fluido giù al centro del campo visivo, in modo che sia illuminato dalla luce trasmessa e tocchi a malapena il tampone neuronale.
Abbassa l'obiettivo 10x di concentrarsi sulla larva per confermare la sua posizione. Fuous l'obiettivo sull'ago fluido-getto. Spostare l'ago fluido-getto con il micromanipolatore nell'asse x e y fino a quando non è in una posizione parallela al lato dorsale della larva.
Successivamente, concentrati di nuovo sulla larva. Portare l'ago verso il basso nell'asse z e posizionare l'ago lungo il lato dorsale del pesce, a 1 millimetro di distanza dal corpo. Spostare con cura l'adattatore circolare della camera per assicurarsi che l'ago a getto fluido sia allineato lungo la linea mediana AP della larva.
Quindi, passa all'obiettivo 60x acqua. Assicurarsi che l'obiettivo sia specificato nel tampone neuronale. Usa la messa a fuoco fine per localizzare un neuromast.
Successivamente spostare lo stadio motarizzato per posizionare il neuromast di interesse al centro del campo visivo. Tenere la punta dell'ago a getto fluido lungo il lato dorsale del pesce. Non toccare la punta dell'ago fluido-getto alla larva o alla superficie della camera.
Posizionare l'ago fluido-getto con il micromanipolatore in modo che si trova a 100 micrometri dal bordo esterno del neuromast. Quindi, concentrati sulle punte dei fasci di capelli apicici. Il fondo dell'ago fluido-getto dovrebbe essere a fuoco su questo piano.
Impostare il morsetto a pressione ad alta velocità dalla modalità manuale a quello esterna per ricevere l'input dal software di imaging. Azzerare il morsetto di pressione ad alta velocità premendo il pulsante zero e utilizzare la manopola del set point per impostare la pressione di riposo leggermente positiva. Confermare l'uscita di riposo del morsetto ad alta velocità utilizzando un manometro PSI collegato all'uscita dello stadio di testa.
Per determinare la pressione necessaria per stimolare i fasci di capelli, applicare uno stimolo di prova con un'uscita di 0,125 e 0,25 volt per 200-500 millisecondi. Per ogni stimolo di prova, misurare la distanza di deflessione delle punte delle acconciature, la kinocilia. Scegli una pressione che sposta i fasci a una distanza di circa 5 micrometri.
Assicurarsi che le punte della kinocilia rimangano a fuoco per tutto il tempo. Per acquisire immagini a piano singolo, selezionare uno stimolo da fornire durante l'acquisizione di 80 fotogrammi, dopo il fotogramma 30, a 3 secondi. Per misurare le risposte meccanosensibili al calcio, concentrati sulla base dei fasci di capelli apicali e inizia l'acquisizione dell'immagine.
Per misurare le risposte al calcio presnaptico, concentrati alla base delle cellule ciliate e inizia l'acquisizione dell'immagine. I passaggi per visualizzare i cambiamenti spaziotemporali nell'intensità GCaMP6S, all'interno di un neuromast durante la simulazione, sono delineati qui. Il tempo è rappresentato da sinistra a destra in base al timestamp.
La riga superiore mostra cinque dei quattordici contenitori temporali di una sequenza di immagini GCaMP6S F a 70 fotogrammi. Nella seconda riga, la linea di base è stata rimossa da ogni immagine binned GCaMP6S F per creare immagini delta F. Nella terza riga, le immagini delta F sono state convertite dalla scala di grigi alla tabella di ricerca calda rossa.
Nella riga inferiore, la terza riga è stata sovrapposta alle immagini F nella riga superiore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di assicurarsi che la larva sia appuntata correttamente e di utilizzare controlli appropriati, come descritto nel manoscritto per escludere gli artefatti di movimento dai dati. Lavorare con alfa bungarotoxin può essere pericoloso.
È importante prendere precauzioni, come indossare guanti durante la manipolazione.
