Ringraziamo S. Jinks Robertson e E. Heidenreich per la fornitura di plasmidi e di ceppi di lievito; P. Pham e MF Goodman per il saggio di aiutare withthe TLS. Questo lavoro è stato finanziato, in parte, dalla Federazione americana per la ricerca Invecchiamento concessione e dal NIH AG20642, AG025135.

Due modelli di vita hanno usato per studiare l&#39;invecchiamento in S. cerevisiae: RLS e CLS. La (in erba) la durata della vita replicativa (RLS) si basa sull&#39;osservazione che le cellule di lievito madre subiscono un numero finito di divisioni 3-6. Ci concentreremo sulla durata della vita cronologico (CLS), un modello basato sulla sopravvivenza cronologico di non dividere il lievito in coltura o su piastre 7-11. Lievito tipo selvatico cresce in modo esponenziale per 10-12 ore in sintetico destrosio completa (DSC) di media . Quando il livello di glucosio riduce, interruttori lievito da fermentazione alla respirazione, un processo chiamato spostamento diauxic. Cellule continuano a dividersi lentamente durante la fase di post-diauxic per circa 48 ore prima di entrare G 0 arresto. Il tasso metabolico delle cellule rimane alta fino al giorno 5-6 (giorno 0 è il giorno inoculazione). La vitalità delle cellule nel corso del tempo si può accedere dalla percentuale di cellule invecchiamento cronologico, campionati ogni due giorni, che può uscire da G 0 arresti e formare colonie su ricchi piatti YPED. 1. Lievito cronologico durata di vita (CLS) in coltura liquida <ol><li> Inoculare una singola colonia in 1 ml di glucosio terreno sintetico completo (DSC, Tabella 1) e incubare una notte con agitazione (220 rpm) a 30 ° C. Tre inoculums dalle colonie indipendenti dovrebbero essere preparati per ogni sforzo per fornire repliche biologiche. </li><li> Diluire la cultura in una notte fresca medio della DSC (in genere 10 ml) di OD = 0,05-0,1 (~ diluizione 1:100) e incubare con agitazione (220 rpm) a 30 ° C. Questo punto è considerato tempo 0 giorni dell&#39;invecchiamento cronologico. Mantenere un rapporto 1:5 di cultura / fiasco del volume (10 ml di cultura in 50 ml, o per gli esperimenti più / grande cultura 25 ml in 125 ml) per garantire la corretta aerazione. </li><li> A partire dal giorno 3, rimuovere 2 aliquote da 10 microlitri dal pallone, diluire 10.000 volte in acqua in autoclave, 10 microlitri cultura diluito (ovvero, 10 4 -10) su YEPD (1 estratto di lievito%, 2% bacto peptone, 2% di destrosio , 2% agar) piastre e incubare a 30 ° C per 48-72 ore prima formanti colonia unire (CFU) viene contato. </li><li> Giorno 3 CFU è considerato al 100% la sopravvivenza. Fattori di diluizione della cultura invecchiamento nei giorni successivi deve essere aggiustato di conseguenza per assicurare ~ 20-100 colonie nel test CFU (ad esempio, 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, ecc.) Per le cellule di tipo selvatico in background DBY746, la CLS raggiunge l&#39;1% di sopravvivenza intorno al giorno 11. </li></ol> Variazioni di test in situ viabilità comprendono: <ul><li> Restrizione calorica (CR) di limitazione del glucosio. Diluizione della cultura durante la notte in media glucosio limitata SC (come 0,5 o 0,05% al posto del glucosio standard 2%) in genere portare a bassa densità di popolazione di saturazione al giorno 3, ma molto esteso media e massima (10% di sopravvivenza) la durata della vita 12. </li><li> Per estremi CR / fame, lavare il giorno 3 cultura fase stazionaria (in genere 10 ml, come nel punto 3) con acqua autoclavato (risospendere le cellule in uguale volume di acqua e spin down a 2500 rpm per 5 minuti, ripetere 3 volte). Cellule Incubationof in acqua simula la condizione di fame che il lievito può incontrare allo stato selvatico. Ogni due giorni poi, la cultura invecchiamento devono essere lavati con acqua in autoclave e risospesi in volume uguale di acqua per rimuovere ogni nutrienti rilasciati dal lisato le cellule morte. Eseguire test vitalità campionando la cultura invecchiamento come descritto sopra. Questa condizione fame sarà portato a quasi un raddoppio del CLS medio nel wild type DBY746 ceppo 12. </li></ul> 2. Test in situ vitalità Nella cultura liquido, una piccola frazione di cellule sopravvissute possono ri-entrato nel ciclo cellulare e crescere utilizzando sostanze nutritive restanti o quelli modulo rilasciato lisate le cellule morte nel mezzo, un fenotipo definito ricrescita / ansimante 13. Abbiamo sviluppato una vitalità-on-a-plate sistema che utilizza la auxotrophy del ceppo DBY746 (TRP1) per eludere la ricrescita / ansimante problema e permettono anche la verifica degli effetti della esposizione costante o privazione di varie sostanze nutritive o stimoli esterni sui lieviti CLS 11. Questo test in situ vitalità imita anche il modello replicativo durata della vita in modo tale che le cellule sono costantemente esposti alle sostanze nutritive abbondante per tutta la durata dell&#39;analisi vita. <ol><li> Inoculare una singola colonia in 1 ml di glucosio terreno sintetico completo (DSC) e incubare una notte con agitazione (220 rpm) a 30 ° C. Almeno tre inoculums da colonie indipendenti dovrebbero essere preparati per ogni sforzo per fornire repliche biologiche. </li><li> Che la cultura per crescere a ~ 10 8 cellule / ml (OD 600 = ~ 10), diluire l&#39;acqua culturewith autoclavati a 100-200 cell/10 microlitri (di solito 10 4 volte diluizione) e 1.000 cells/10 microlitri (10 3 -diluizione). </li><li> Piastra di due aliquote di 10-30 ml di coltura diluita su una piastra di triptofano abbandono della DSC. Perr ogni ceppo, preparare una serie da 8 a 20 piastre ed etichettato in base alla densità placcatura (ad esempio, 10 4 volte diluita, tavola 10 microlitri o 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, 10 3 -30 , ecc), che assicurano 10-100 colonie possono essere contate in previsione di redditività è diminuita durante l&#39;invecchiamento. </li><li> Incubare la piastra fissata a 30 ° C per tutta la durata dell&#39;analisi vita. </li><li> Il giorno della placcatura e successivamente ogni 2 giorni, rimuovere una piastra e aggiungere goccia a goccia 0,5 ml Triptofano (2 mg / ml) per permettere cellule vitali per crescere. Incubare la piastra a 30 ° C per ulteriori 48-72 ore. Contare i CFU per la vitalità del giorno di aggiunta triptofano. Il CFU, al momento della placcatura è considerata al 100% la sopravvivenza. </li></ol> Variazioni di test in situ viabilità comprendono: <ul><li> Età cellule su piastre di agar (condizione di fame estrema). Aggiungere 1 ml di 2x YPED invece di triptofano nei giorni successivi per permettere la crescita e CFU contano 14. </li><li> Celle di età su piastre con triptofano medio di abbandono sintetico completa di fonti di carbonio diversi, ad esempio, varie concentrazioni di glucosio (restrizione calorica da limitazione glucosio), varie fonti di carbonio come l&#39;etanolo, glicerina, acido acetico 14. Aggiungere 1 ml di glucosio / soluzione triptofano (20% glucosio e 1mg/ml triptofano) per consentire la crescita e contare CFU. </li><li> Altri manipolazione dei nutrienti, come l&#39;azoto. </li></ul> 3. Danno al DNA e della frequenza di mutazione durante l&#39;invecchiamento cronologico Canavanina resistenza (Can r) e CAN1 sequenziamento Frequenza di mutazioni spontanee può essere valutata misurando la frequenza di resistenza canavanina (Can r) nelle culture cronologicamente invecchiamento. Le mutazioni nel (YEL063) CAN1 gene, che codifica per il plasma arginina permeasi, rendere le cellule resistenti alla L-arginina analogico canavanine.Can colonie r raccolti in diversi momenti possono anche essere salvati per l&#39;estrazione di DNA genomico e la sequenza successiva del CAN1 gene, in grado di fornire i dati dello spettro di mutazione (mutazione con Surveyor, SoftGenetics). Sostituzioni di basi (Trp + ritorni) Ceppi con TRP1-289 contiene una mutazione ambra (C403T) nella sequenza TRP1 codifica. Misura della frequenza di TRP1-289 alla riversione Trp + 15 consente la stima del tasso base sostituzione durante l&#39;invecchiamento cronologico lievito. Mutazioni frame-shift Il Lys - ceppo EH150 (Mata, lys2ΔBglII, TRP1-Δ, his3-Δ200, ura3-52, ade2-1o) ospita una mutazione lys2ΔBgl II che è stato costruito con l&#39;inserimento di quattro nucleotidi di creare una restrizione Bgl II sito degli enzimi del gene LYS2 . Il conseguente spostamento di 4 risultati open frame lettura in auxotrophy della lisina, che può essere invertita da piccoli inserzione / delezione mutazioni 16-17. Lordo riarrangiamenti cromosomici (GCR) Per rilevare lordo riarrangiamenti cromosomici (GCR), abbiamo generato un ceppo mutante, in cui HXT13 (YEL069), che codifica per un trasportatore esoso altamente ridondanti, è stata interrotta da una cassetta URA3 18. HXT13 si trova a 7,5 kb telomerica CAN1 sul cromosoma V. Mutazioni in entrambi i CAN1 e URA3 geni rendere resistenza alle cellule di L-canavanina e 5-fluoroorotic acido (5FOA), rispettivamente. Considerando la bassa frequenza di mutazioni puntiformi che si verificano in entrambi i geni, l&#39;analisi della possibile 5FOA r r frequenza fornisce una stima della GCR che provocano la perdita di entrambi i geni. Ricombinazione omologa e homeologous Per monitorare il livello di omologhi (100%) e la ricombinazione homeologous (91%) durante l&#39;invecchiamento cronologico, abbiamo generato mutanti in cui plasmidi linearizzati (HIS3:: introne-IR-URA3) portando entrambi al 100% ripete omologo invertite (IR) (pSR406 ) o 91% homeologous IRS (pSR407) al HIS3 locus 19. Ricombinazione tra l&#39;IRS permette l&#39;espressione della proteina funzionale His3. <ol><li> In parallelo al test vitalità normale (come descritto sopra), rimuovere una quantità appropriata di cellule dalla cultura invecchiamento, <ol><li> di mutazione può r, iniziare con ~ 2x10 7 celle (200 ml di giorno 3 cultura); </li><li> per il ritorno Trp +, inizia con ~ 10 8 celle (500-1000 ml di giorno 3 cultura); </li><li> per Lys + frame-shift mutazione, inizia con ~ 10 8 celle (500-1000 ml di giorno 3 cultura); </li><li> per GCR, iniziare con 2-3x10 8 celle (2-3 ml del giorno 3 cultura); </li><li> per la ricombinazione omologa e homeologous, inizia con &amp; tilde; 5x10 7 celle (200-500 ml di giorno 3 cultura); </li></ol> regolare la quantità placcatura in base alla diminuzione della redditività totale e l&#39;aumento della frequenza di mutazione durante l&#39;invecchiamento cronologico (Tabella 2). In caso di ceppi con fenotipo hypermutator (come quelli con carenze nella riparazione del DNA), ridurre la quantità di campionamento di conseguenza. </li><li> Agglomerare le cellule con il banco macchina centrifuga (6000 rpm per 5 min). </li><li> Risospendere le cellule in 1 ml di acqua in autoclave, e agglomerare le cellule di nuovo. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 100 ml di acqua. Piastra di cellule, <ol><li> per Can mutazione r, in arginina-dropout piastre sintetico terreno completo (DSC-Arg, integrata con 60 mg / ml L-canavanina solfato); </li><li> per il ritorno Trp +, il triptofano-dropout piastre (DSC-Trp); </li><li> per Lys + frame-shift mutazione, sul lisina-dropout piastre (DSC-Lys); </li><li> per il GCR, il arginina-dropout piastre (DSC-Arg) integrato con 5FOA (1 mg / ml) e L-canavanina solfato (60 mg / ml); </li><li> per la ricombinazione omologa e homeologous, in istidina-abbandono piastre completato con galattosio (2%). </li></ol></li><li> Conte CFU dopo incubazione di 3-4 giorni &#39;a 30 ° C. La frequenza di mutazione è normalizzata al numero di cellule vitali. </li></ol> Complementare al test in situ vitalità, età-dipendente Trp ritorno + Lys + frame-shift mutazione, ricombinazione, o Can r può anche essere studiato in cellule invecchiate sul piatto. <ol><li> Cellule piastra (~ 10 8 cellule / piastra) su piatti sintetici Trp-,-Lys, His-abbandono, o L-canavanina terreno completo (come descritto sopra). </li><li> Ogni due giorni (o per il punto temporale di interesse), il punteggio delle colonie emergenti. </li><li> Frequenza di mutazione è stimata normalizzando colonie emergenti per il numero totale delle cellule vitali del giorno specifico. </li></ol> 4. Translesion sintesi (TLS) L&#39;età-dipendente aumento della frequenza di mutazione può comportare maggiori danni macromolecola, diminuita protezione cellulare / riparazione e aumento riparazione del DNA errate (come Polζ-dipendente sintesi translesion, TLS) durante l&#39;invecchiamento. Ad esempio, il longevo sch9 mutanti Δ mostra espressione elevata di SOD2, e ridotta espressione del soggetto a errori di riparazione del DNA enzima Rev1 20. Qui si descrive un saggio che unisce modello di DNA danneggiato e di tutto estrarre nucleare per valutare la TLS in vitro. <ol><li> Preparare l&#39;estratto nucleare come descritto da Wang et al 21;. Quantificare la concentrazione di proteine ​​da saggio BCA (Pierce). </li><li> Aggiungi mcg 0, 5, 10 o 20 di estratti nucleari a 50 microlitri (volume finale) reazioni contenente TLS buffer (20 mM HEPES, 7 mM MgCl 2, 1 mM DTT, 25 mM NaCl, pH 7,8), 200 e 100 nM μMdNTPs 5&#39;-32 P-12-etichettati mer primer (5&#39;-CGA TGG TAC GGA-3 &#39;) ricotto ad un 48-mer modello contenente danno al DNA di interesse (5&#39;-GCC ATA CTG GTA CTA ATG ATT AAC GAC TXA AGC ACG TCC GTA CCA TCG-3 &#39;, in cui X è il sito danneggiato, per esempio, il sito abasic, 8-oxo-G, ecc.) </li><li> Incubare la miscela a 30 ° C per 30 minuti, terminare la reazione con l&#39;aggiunta di 2,5 microlitri EDTA (20 mm) e 2 ml di proteinasi K (10 mg / mL). </li><li> Purificare l&#39;estrazione del DNA con fenolo e precipitazione in etanolo. </li><li> DNA Risospendere in 50 ml di tampone di caricamento del gel (98% formammide, 20 mM EDTA, e tintura). </li><li> Risolvere i prodotti di sintesi translesion su gel di poliacrilammide 19%. </li><li> Quantificare il TLS utilizzando phosphorimaging (Figura 1). </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Noi di solito usato i conteggi CFU il giorno 3 come sopravvivenza del 100 per cento dello standard analisi dei liquidi CLS. La percentuale di sopravvivenza nei giorni successivi può essere montato a calcolare la media (50% di sopravvivenza) e massimo (10% di sopravvivenza) la vita si estende su 12. Risultati ottenuti da vita nel test vitalità situ sono generalmente coerenti con quelli che utilizzano il test liquido CLS, ma con ridotto la durata media della vita, che è dovuto in parte al fatto che le cellule sono costantemente esposti a sostanze nutritive. Presenza di glucosio inibisce l&#39;attività di protezione cellulare, come dimostrato dal ridotto transattivazione del fattore di trascrizione risposta allo stress, come Msn2 / 4 e Gis1 12. Età-dipendente della frequenza di mutazione varia notevolmente a seconda della priorità bassa tensione, la manipolazione genetica, condizioni di coltura, e l&#39;età. La tabella 2 mostra i risultati tipici ottenuti nel ceppo selvatico (DBY746). <table border="1"><tbody><tr><th> Componente </th><th> g / L </th></tr><tr><td> D-glucosio </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Solfato di ammonio </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Base di azoto (-AS/-AA) </td><td> 1,8 </td></tr><tr><td> NaH2PO4 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td></td><td> mg / L </td></tr><tr><td> Adenina </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Arginina </td><td> 40 </td></tr><tr><td> L-acido aspartico </td><td> 100 </td></tr><tr><td> L-acido glutammico </td><td> 100 </td></tr><tr><td> L-Istidina </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Isoleucina </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-Leucina </td><td> 120 </td></tr><tr><td> L-lisina </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-metionina </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Fenilalanina </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-Serina </td><td> 400 </td></tr><tr><td> L-treonina </td><td> 200 </td></tr><tr><td> L-triptofano </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-tirosina </td><td> 40 </td></tr><tr><td> L-Valina </td><td> 150 </td></tr><tr><td> Uracile </td><td> 80 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Sintetico medio di glucosio completa, DSC (regolare a pH 6,0 con NaOH). Di 4 volte l&#39;eccesso di istidina, leucina, triptofano, uracile e sono inclusi per compensare la auxotrophy del ceppo DBY746. <table border="1"><tbody><tr><th></th><th> Giorno 3 (media ± SEM) </th><th> Fino a (durante l&#39;invecchiamento) </th></tr><tr><td> Può r </td><td> 1,76 ± 0,12 x10 -6 </td><td> 6-8 x10 -6 </td></tr><tr><td> Trp + ritorno </td><td> 6,60 ± 1,70 x10 -8 </td><td> 1,60 x10 -6 </td></tr><tr><td> Lys + frame-shift mutazione </td><td> 3,00 ± 0,78 x10 -8 </td><td> 0,70 x10 -6 </td></tr><tr><td> GCR </td><td> 0,62 ± 0,10 x10 -8 </td><td> 0,30 x10 -6 </td></tr><tr><td> Ricombinazione omologa </td><td> 5,55 ± 2,74 x10 -6 </td><td> 27,00 x10 -6 </td></tr><tr><td> Ricombinazione Homeologous </td><td> 0,12 ± 0,04 x10 -6 </td><td> 0,48 x10 -6 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Frequenze mutazione tipica delle cellule wild-type (DBY746) durante l&#39;invecchiamento cronologico. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3030/3030fig1.jpg" /> Figura 1. Risultato di sintesi translesion (TLS) 20. Estratti nucleari da 3 giorni di età fase stazionaria wild-type (DBY746) e sch9 Δ cellule mutanti sono state incubate con danneggiato o abasic sito contenente modelli di DNA per 30 minuti a 30 ° C. Prodotti TLS sono indicati da solide (con template non danneggiato) o punteggiata (con modello danneggiato) linee. Non c&#39;era sintesi translesion osservato in estratto nucleare da sch9 mutanti Δ. Primer liberi sono indicati dalla freccia aperta.

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F., JinksRobertson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+crossovers+between+diverged+sequences+are+regulated+by+mismatch+repair+proteins+in+Saccaromyces+cerevisiae.">Mitotic crossovers between diverged sequences are regulated by mismatch repair proteins in Saccaromyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 16, 1085-1093 (1996).</li><li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene+homologue+Sch9+promotes+age-dependent+mutations+by+a+superoxide+and+Rev1/Polzeta-dependent+mechanism.">Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism.</a> J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).</li><li>Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+recombinant+genes+and+preparation+of+cell-free+extracts+in+yeast.">Controlled expression of recombinant genes and preparation of cell-free extracts in yeast.</a> Methods Mol Biol. 313, 317-331 (2006).</li><li>Fabrizio, P., Pletcher, S. D., Minois, N., Vaupel, J. W., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronological+aging-independent+replicative+life+span+regulation+by+Msn2/Msn4+and+Sod2+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Chronological aging-independent replicative life span regulation by Msn2/Msn4 and Sod2 in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Lett. 557, 136-142 (2004).</li><li>Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+quiescent+and+nonquiescent+cells+from+yeast+stationary-phase+cultures.">Isolation of quiescent and nonquiescent cells from yeast stationary-phase cultures.</a> J Cell Biol. 174, 89-100 (2006).</li><li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity+mutation+in+SCH9+prevents+recombination+errors+and+premature+genomic+instability+in+a+Werner/Bloom+model+system.">Longevity mutation in SCH9 prevents recombination errors and premature genomic instability in a Werner/Bloom model system.</a> J Cell Biol. 180, 67-81 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Liquido culture invecchiamento volte esibire la ricrescita / ansimante fenotipo 13, il che complica l&#39;analisi CLS. Ricrescita si verifica in genere quando più di 90-99% della popolazione ha perso vitalità. Questo fenotipo è spesso associata ad un aumento dello stress ossidativo e / o di protezione è diminuita nella cella. Per esempio, la frequenza di questo fenotipo più che raddoppia in celle prive superossido dismutasi citosolica e riduce notevolmente in longevo mutanti (per esempio, o ras2 sch9 Δ Δ) o mutanti superossido dismutasi sovraesprimono 22. In pratica, definiamo la ricrescita come un aumento della redditività o la stabilizzazione della redditività per 3 campionamenti successivi nella fase alta mortalità durante l&#39;invecchiamento cronologico. Età-dipendente frequenze delle mutazioni del DNA differenti variano notevolmente a seconda della priorità bassa tensione, la manipolazione genetica, condizioni di coltura, così come la ricrescita / ansimante e la sopravvivenza estremamente basso. Pre-esperimenti devono essere effettuati presso punti al momento in cui la sopravvivenza media e massima densità di placcatura vari test di mutazione per determinare la frequenza di mutazione prima performingthe gamma completa analisi durata scala. Il ceppo di tipo selvatico deve sempre essere inclusi in una vita di studio o frequenza di mutazione in parallelo a qualsiasi trattamento o mutanti genetici, in modo che inter-esperimento-variazioni possono essere spiegate. Molteplici repliche biologici dovrebbero essere inclusi nello studio, e, sia liquidi che in situ vitalità / mutazione test dovrebbe essere effettuato per corroborare i risultati. Invece di concentrarsi su uno specifico tipo di mutazione del DNA, profili di età-dipendente instabilità genomica usando saggi più in combinazione, possono far luce sul danno al DNA specifico e danni al sistema di riparazione del DNA (s) che contribuiscono a età-dipendente instabilità genomica. Per esempio, un significativo aumento lordo riarrangiamenti cromosomici (GCR), rispetto a quelli di altre mutazioni del DNA, si osserva nel lievito di tipo selvatico suggerendo una pausa elevationof doppio filamento e / o danni a non omologhe fine unirsi (NHEJ) durante lievito invecchiamento cronologico (Tabella 2). Lo spettro di mutazione CAN1 (sequenziamento del gene CAN1) ottenuti nelle wild-type lievito invecchiamento suggerito un aumento del danno ossidativo durante l&#39;invecchiamento cronologico e soggetto a errori di riparazione del DNA e che, a lungo vissuto sch9 mutanti Δ, danno al DNA meno ossidativo e molto ridotto soggetto a errori sintesi translesion sono stati osservati 20. Metodi qui descritti possono essere ulteriormente speso per studiare età-dipendente instabilità genomica. Per esempio, le cellule quiescenti e non-riposo può essere isolato dal lievito stazionaria fase culture utilizzando il metodo del gradiente di densità descritto da Allen et al. 23. In combinazione con il test di mutazione descritta qui, abbiamo riportato che una gran parte di età-dipendente mutazioni nasce da cellule quiescenti, piuttosto che la divisione, le cellule danneggiate o apoptotiche 20,24.

studying age-dependent genomic instability using the s. cerevisiae chronological lifespan model

Gli studi che utilizzano il modello Saccharomyces cerevisiae invecchiamento hanno scoperto percorsi durata regolamentare vita che sono in parte conservati in eucarioti superiori 1-2. La semplicità e la potenza del modello di lievito di invecchiamento può essere esplorata per studiare il danno al DNA e la manutenzione del genoma, nonché il loro contributo alle malattie durante l&#39;invecchiamento. Qui, descriviamo un sistema per studiare età-dipendente mutazioni del DNA, tra cui sostituzioni di basi, mutazioni frame-shift, al lordo riarrangiamenti cromosomici e omologa / homeologous ricombinazione, così come l&#39;attività di riparazione del DNA nucleare, combinando l&#39;arco cronologico lievito della vita con il DNA semplice danni e saggi di mutazione. I metodi descritti qui dovrebbe facilitare l&#39;identificazione di geni / percorsi che regolano l&#39;instabilità genomica ed i meccanismi che sono alla base età-dipendente mutazioni del DNA e il cancro nei mammiferi.

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Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Qui si descrive un insieme di saggi di mutazione del DNA che possono essere combinati con il modello lievito arco cronologico della vita a studiare i geni / percorsi che regolano o contribuire all&#39;instabilità DNA genomico durante l&#39;invecchiamento.

Studiare età-dipendente instabilità genomica utilizzando il S. Saccharomyces Modello Durata cronologica

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

studying-age-dependent-genomic-instability-using-s-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

15.5K Views.  University of Southern California, Los Angeles. Qui si descrive un insieme di saggi di mutazione del DNA che possono essere combinati con il modello lievito arco cronologico della vita a studiare i geni / percorsi che regolano o contribuire all'instabilità DNA genomico durante l'invecchiamento.

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Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

Test di adesione ed invasione di Agar in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Ricerca

Biologia

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Un high-throughput metodo per studiare la morfologia globale organello in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

L&#39;identificazione di complessi proteici con la proteomica quantitativa in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

Genomica risonanza magnetica - una risorsa pubblica per lo Studio Patterns sequenza all&#39;interno del DNA genomico

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Flusso Cytometry basata Purificazione<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigoti

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Valutazione del rene Zebrafish Funzione Con un test Clearance fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

Uso di dispositivi microfluidici misurare la durata della vita e cellulare fenotipi in singole cellule di lievito in erba

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

High throughput Screening per eredità a base di proteine in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

A Mouse Model of Lumbar Spine Instability

Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common pathological change leading to low back pain. Appropriate animal models are desired for understanding the pathological processes and evaluating new drugs. Here, we introduced a surgically induced lumbar spine instability (LSI) mouse model that develops IDD starting from 1 week post operation. In detail, the mouse under anesthesia was operated by low back skin incision, L3&#8211;L5 spinous processes exposure, detachment of paraspinous muscles, resection of processes and ligaments, and skin closure. L4&#8211;L5 IVDs were chosen for the observation. The LSI model develops lumbar IDD by porosity and hypertrophy in endplates at an early stage, decrease in intervertebral disc volume, shrinkage in nucleus pulposus at an intermediate stage, and bone loss in lumbar vertebrae (L5) at a later stage. The LSI mouse model has the advantages of strong operability, no requirement of special equipment, reproducibility, inexpensive, and relatively short period of IDD development. However, LSI operation is still a trauma that causes inflammation within the first week post operation. Thus, this animal model is suitable for study of lumbar IDD.

We developed a lumbar intervertebral disc degeneration mouse model by resection of L3&#8211;L5 spinous processes along with supra- and inter-spinous ligaments and detachment of paraspinous muscles.

Un modello di topo di instabilità della colonna lombare

Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common pathological change leading to low back pain. Appropriate animal models are desired for understanding ...