Ringraziamo il Dott. R. Michael Sramkoski per un aiuto con citometria a flusso, il dottor Purnima Jaiswal e il Dr. Di Wu per prima input e Ilya Aylyarov per un aiuto con le illustrazioni. Supportato da NIH Grant R01GM089872 e la Citometria e Microscopia strumento Imaging Core del Comprehensive Cancer Center, causa (P30 CA43703).

1. La crescita delle cellule aploidi <ol><li> Grow S. cellule di Saccharomyces dallo sfondo S288C (BY4741) in condizioni standard 10. </li><li> Trasforma aploidi per esprimere uno dei due marcatori fluorescenti cospicui 10. I marcatori di scelta sono GFP solubili espressa nel citoplasma (pEG220, URA3/YIp, linearizzato con BglII 11) e una singola proteina ribosomale, RPL25, fuso con mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, da A. Johnston). Ci aspettiamo che le equivalenti a due colori protocolli di purificazione potrebbe fare uso di altre proteine ​​fluorescenti brillanti che vengono sintetizzati dalle cellule aploidi parentali. In alternativa, la parete cellulare può essere etichettato con lectine fluorescenti. </li><li> Sulla purificazione giorno precedente zigote, inoculare 5 ml culture di ciascun tipo di cellula e crescere con agitazione per una notte a 23 ° C per raggiungere A600 non superiore a 1,0. Grow trasformanti GFP (ATY4442) in completo terreno sintetico di cui 2% di glucosio (CSM-glucosio) unand RPL25-mCherry trasformanti (ATY4552) in sintetico terreno selettivo privo uracile 10. Mantenere colture parallele di ciascun tipo cellulare con agitazione a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Conduzione di una croce <ol><li> Regolare la densità ottica (A600) di ciascun campione di 1,0 in terreno fresco. [1 Unità di densità ottica ~ 3 x 10 7 cellule / ml] </li><li> Miscelare volumi uguali di due culture, vortice brevemente 3 volte, seguiti da un vortice più per 10 sec. </li><li> Preparare CSM-glucosio piatti. Le piastre sono identiche a quelle utilizzate per la crescita di routine e sono stati asciugati 45 min dopo la colata e solidificazione del agar 10. </li><li> Distribuire ben 20 40-ml goccioline della miscela 1 centimetro dal bordo della superficie di CSM-glucosio piastre. Quando le goccioline sono dapprima applicato alla superficie avviare il timer per misurare il tempo trascorso. Una volta che il liquido è stato assorbito (circa 30 min), coprire i piatti e lasciarli indisturbati a rootemperatura m. </li></ol> 3. Preparazioni raccolta <ol><li> Campioni raccolto dopo 1,75-2,5 hr a 23 ° C lavando ripetutamente singole goccioline secche dalla piastra usando 150 ml di glucosio-CSM freddo, mantenendo le piastre in ghiaccio. Ripetutamente lavare gocciolina 10-20 volte con lo stesso mezzo di massimizzare il recupero. Raccogliere in 15 ml provette Falcon su ghiaccio. </li><li> Sonda ultrasuoni i campioni 10x al 60% di ampiezza con un sonicatore Fisher FB120 (120Watt, 120Volt, Freq 20KHz) su ghiaccio. </li><li> Verificare in un microscopio fase che aggrega poche o nessuna rimangono. 15-50% delle cellule sono attesi sono formate zigoti a questo punto. </li><li> Lasciare il tubo di cellule in posizione verticale indisturbata in ghiaccio per 10 min quale ulteriore misura precauzionale (per permettere di risolvere aggregati). </li><li> Recuperare il più in alto del 90% del volume e filtrare attraverso una rete di nylon (BD Falcon tubo in polipropilene con tappo filtro (Rif. 352235)). In un esperimento tipico, 10 7 cellulerecuperato da una piastra a questo punto erano diluiti in 4 ml di glucosio-CSM. </li></ol> 4. Citometria a Flusso <ol><li> Ordinare le celle utilizzando la riflessione Sony iCyt Citometro modello di flusso, (altamente automatizzata ordine parallela) HAPS1 con una punta di 100 micron. Per eccitazione GFP, utilizzare il blu argon-ion, 250 milliwatt laser a 488 nm. Per eccitazione mCherry, utilizzare i 100 milliwatt laser a 561 nm. Anche se non si ha esperienza con altre macchine, ci aspettiamo che Becton Dickinson FACSAria, Becton Afflusso Dickson o Beckman Coulter MoFlo XDP sarebbe bene se equipaggiato con i laser corretti. </li><li> Base ordinamento parametri su un grafico a dispersione in avanti rispetto indietro per cancello cellule vitali. Stabilire una trama di emissione di 615 + / - 30 nm filtro passa-banda (mCherry) rispetto a 525 + / - 25 nm filtro passa-banda (GFP) per dividere gli eventi in quattro quadranti, &quot;Rosso + Verde-&quot;, &quot;Rosso + Verde +&quot;, &quot;Red- Green-&quot;e&quot; Rosso-Verde + &quot;(Figura S2). Utilizzare le cellule non fluorescente come f di serieo la determinazione del &quot;Red-Green-&quot; quadrante. </li><li> Celle di ordinamento con una pressione di 21,5 psi guaina, una frequenza gocciolina di 43.400 gocce / sec, e una pressione di 20,5 psi campione. </li><li> In ordine iniziale (&quot;Recovery Mode&quot;): Raccogliere i campioni in provette Eppendorf refrigerati contenenti 250 ml di freddo CSM-glucosio. Sedimenti 10 sec alla massima velocità in una microcentrifuga refrigerata (Tomy MRX-150, 15.000 rpm) e aspirare la soluzione di flusso (citometria a flusso soluzione guaina (PBS con 1 mM EDTA) BioSure Catalog No. 1027). Risospendere in 500 ml freddo CSM-glucosio. </li><li> Secondo tipo (&quot;Modalità Purezza&quot;): Condurre il tipo come per l&#39;ordinamento iniziale, usando la modalità &quot;purezza&quot; opzione. Sedimenti il ​​purificato le cellule e risospendere il pellet in 500 ml-1.0 ml CSM-glucosio. Agitare per 15 minuti in piastre da 24 pozzetti a 23 ° C per consentire il recupero metabolico. </li></ol> 5. DeltaVision Microscopia <ol><li> Preparare pad agarosio come segue: portare una sospensione di 1,5% agarosio (ultrapuraAgarosio, Invitrogen, catalogo # 15.510-07) in CSM-glucosio a ebollizione, brevemente vortice, e quindi applicare campioni 0,3 ml della soluzione di agarosio alla superficie orizzontale vetrini standard e coprirli immediatamente con una seconda slitta (senza applicazione di pressione). </li><li> Dopo raffreddamento per 10 minuti, rimuovere delicatamente la slitta superiore facendolo scorrere orizzontalmente, avendo cura di lasciare una superficie liscia e non disturbare lo strato di agarosio. (Quando la slitta superiore è stato rimosso, il campione di cellule deve essere applicata entro 1-2 min. Quando tenuti in una camera umida a temperatura ambiente senza rimuovere la slitta superiore, tamponi possono essere conservati fino a un giorno prima dell&#39;uso.) </li><li> Campioni di sedimenti e depositi aliquote da 1 ml di pellet su pattini di agarosio (senza toccare la superficie). Immediatamente coprire il campione con un quadrato n ° 1 coprioggetto. Tagliare via l&#39;eccesso di agarosio con un unico taglio lametta. Sigillare le preparazioni con vaselina erogati da una siringa. </li><li> Immagine con Deltavision (Applied Precision) con un obiettivo 100x immersione in olio senza binning (Olympus UPlanApo 100x/1.40; ∞ / 0.17/FN26.5). </li><li> Deconvolve z-stack utilizzando il programma Softworx 5.0.0 ( <a href="http://www.api.com/softworx.asp" target="_blank">http://www.api.com/softworx.asp</a> ) ed elaborare minimamente. Successive z-aerei sono stati generalmente raccolti a intervalli di 0,2-0,4 micron. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Livelli di intensità di fluorescenza in cellule aploidi trasformate: Il livello di fluorescenza nei aploidi è illustrato nella figura S1. Prima del, controinterrogatorio epifluorescente dimostrato che essenzialmente tutte trasformanti GFP erano verdi e che tutti i trasformanti mCherry, anche se spesso debole, erano rossi. Per garantire che tutte le cellule utilizzate per la croce erano effettivamente fluorescente, abbiamo utilizzato la sottopopolazione con la più brillante segnale fluorescente. Resa: Aopo l&#39;ordinamento iniziale, il Rosso Verde + campione + (figura S2) include in genere 8-20% del numero di ingresso di cellule e un numero eccessivo di cellule aploidi, forse a causa della persistente adesione cellula-cellula. Poiché arricchimento alta non si ottiene con una specie singola, il campione deve essere parzialmente purificato sonda sonicata due volte al 60% dell&#39;ampiezza seguita da re-ordinamento. (Sorta di recupero in genere una durata compresa tra 1-2 ore, mentre il secondo tipo richiede solo 15 min.) Delle cellule sottoposte al secondo tipo, i + Rosso Verde + campioni inclusi 23-52% delle celle di input. Esame microscopico Fase: Esame al microscopio a contrasto di fase è emerso che la purezza della preparazione zigote finale in media circa il 90% rispetto al 21 Preparazioni (che vanno dal 86% al 91%). I contaminanti erano o aploidi verdi o rossi, o coppie di aploidi che erano in contatto tra loro. Figura 3 cataloga la percentuale di zigoti che hannonessuna gemma, boccioli mediale (Med), germogli laterali (Lat) né boccioli terminali (Term), il numero di aploidi coppie dello stesso colore (&quot;2Same&quot;) o colore diverso (&quot;2Hap&quot;), aploidi e come singoli ( HAP). Quando le cellule sono state raccolte dopo 1,75 ore, più del 50% sono stati unbudded e le altre sottocategorie (mediale, con gemme laterali o terminali) erano ugualmente rappresentati. Dopo 2,5 ore ci sono stati numero approssimativamente uguale di zigoti in ciascuna delle quattro categorie (unbudded, con gemme mediale, laterale o terminale). Osservazioni al microscopio (Figura 4): La struttura di zigoti sembra rimanere invariato durante la purificazione. In base alla durata della croce, la popolazione ha avuto proporzioni diverse di zigoti unbudded e germogliato, come spiegato sopra. Poiché entrambi i aploidi verde e rosso mostrato notevoli variazioni di intensità del segnale fluorescente, alcuni zigoti erano prevalentemente rosso mentre altri erano prevalentemente verde, come si osserva dalla Comparing le singole immagini a colori alle immagini combinate in Figura 4. Si noti inoltre che la GFP (MW 26kDa) entra nel nucleo e può essere trovato nel nucleo anche quando i nuclei non sono fusi. Vacuoli spiccano come neri non fluorescenti sfere. Il prodotto finale di purificazione produce una popolazione variegata a vari stadi di sviluppo. Zigoti etichettati Una fusione non hanno subito. Di tipo B sono unbudded zigoti. Tipo C hanno una piccola gemma. Tipo D hanno un bocciolo più grande, e zigoti di tipo E sono in procinto di subire citochinesi. Si noti inoltre che molti dei zigoti precedenti presentano ancora un non fluorescente linea mediana divisione (*), e che la vacuolare &quot;struttura di ereditarietà&quot; (I) 12 può essere spesso visto estendersi dal zigote nella gemma. In alcuni casi, il segnale verde ha ridistribuito nel compagno in misura molto maggiore che il segnale rosso. Questo riflette il ritardo di trasferimento che è caratteristica di polisomi (Tartakoff, in preparazione). 6 zigoti, il che è sufficiente per molte immunoblot, utilizzando procedure rivelazione chemiluminescente. Usando fenolo-cloroformio protocolli di isolamento si estraggono circa 1,5 mg di RNA da questo numero di cellule. Poiché gli zigoti purificati sono stati refrigerati, prima di ulteriori analisi si consiglia di incubazione a 23 ° C in terreno di crescita. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig1.jpg" /> Figura 1. Cronologia della formazione dello zigote. Zigoti come intermedia tra aploidi e diploidi. Questo diagramma mostra l&#39;attivazione classica (shmooing) di aploidi, la loro fusione, e la formazione della gemma iniziale. Germogli può essere sia mediale (M), laterale (L) o terminale (T). <imgalt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4197/4197fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Schematica del protocollo di purificazione zigote. Dopo incubazione sulla superficie delle piastre di agar in mezzo completo con glucosio, la miscela di cellule è stato recuperato mediante lavaggio e quindi sottoposto ad un ordinamento iniziale in &quot;modalità di recupero&quot;, seguito da un secondo ordinamento in &quot;modalità purezza. &quot; Il colore giallo indica che sia mCherry e segnali GFP erano visibili nei zigoti. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig3.jpg" /> Figura 3. Varietà di zigoti nelle miscele di accoppiamento purificati frazioni. State raccolte dopo 1,75 o 2,5 ore per recuperare frazioni arricchite in zigoti relativamente precoci vs relativamente più maturo. Otto esperimenti indipendenti, indicati con i colori distinti, sono state eseguite per ciascun punto temporale. I grafici indicano i numeri relativi di zigoti che have spazialmente distinti modelli di formazione di gemme. Data la breve durata dell&#39;incubazione (meno di 2,5 ore a temperatura ambiente) tutte gemme osservati sono eventi iniziali zigotici erba. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig4.jpg" /> Figura 4. Esame DeltaVision di frazioni arricchite. Un tipico campo è stato esaminato al microscopio Deltavision. Le illustrazioni mostrano sia i colori sia rosso e verde o singolo. Il rosso corrisponde all&#39;etichetta polisomale (Rpl25p-mCherry) e il verde GFP citosolico. Nota l&#39;arricchimento elevato di zigoti, e le caratteristiche designate subcellulari: i (v) vacuoli, gemme (b), nucleo (n), &quot;struttura di ereditarietà&quot; vacuolare (i), e la partizione (*) che sembra separare il parentale domini in zigoti relativamente presto. Il loro colore variabile globale riflette l&#39;intensità relativa dei aploidi che fuse. Nei casi in cui i due domini parentali mantengonoun colore diverso, equilibrio dei marcatori (GFP citoplasmatica, mCherry-tagged polisomi) era incompleta. Time-lapse studi in corso mostrano che ridistribuisce GFP solubili prima polisomi. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4197/4197fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . Supplementari Legends <img alt="Figura S1" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS1.jpg" /> Figura S1. Fluorescenza di cellule aploidi a sinistra:. Cellule che esprimono polisomi mCherry-tag sono stati esaminati per rilevare un segnale verde. La finestra rettangolare è stato impostato per evitare le cellule negative. Grafico Oriente: cellule che esprimono GFP citosolico sono stati analizzati, mostrando la popolazione nettamente luminosa principale di positivi. Più a destra: cellule che esprimono polisomi mCherry-tag sono stati analizzati. Il rettangolo (identico a quello all&#39;estrema sinistra) comprende più brillanti cellule e permette tuttinegativi da evitare. Il &quot;R2&quot; designazione indica la percentuale di cellule recuperate nel rettangolo indicato. <img alt="Figura S2" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS2.jpg" /> Figura S2. Distribuzione cellulare in cernita prima e seconda. Questi due colori grafici indicano la percentuale di verde + rosso + cellule nel quadrante in alto a destra (R5). Questa percentuale sale al 52% del secondo tipo. Asse orizzontale: segnale verde. Asse verticale: segnale rosso.

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	<li>Herskowitz, I., Oshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , 181-210 (1981).</li><li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+age+and+the+life-span+of+zygotes+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).</li><li>Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+and+genome+encounter+during+yeast+zygote+formation.">Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).</li><li>Azpiroz, R., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+mitochondrial+sorting+in+yeast+zygotes.">Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes.</a> Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).</li><li>Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).</li><li>Dujon, B., Jones, E., Strathern, J., Broach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. , 505-635 (1981).</li><li>Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+yeast+mating+reaction.">Assay of yeast mating reaction.</a> Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).</li><li>Ydenberg, C. A., Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mating:+a+model+system+for+studying+cell+and+nuclear+fusion.">Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion.</a> Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).</li><li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+mating+in+yeast.">Synchronous mating in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).</li><li>Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , (2005).</li><li>Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUS1+regulates+the+opening+and+expansion+of+fusion+pores+between+mating+yeast.">FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).</li><li>Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelles+on+the+move:+insights+from+yeast+vacuole+inheritance.">Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La disponibilità di zigoti purificati dovrebbe facilitare gli studi biochimici tra cui trascrittomica, proteomica e lipidomica, nonché di indagine dei meccanismi attraverso i quali si sottopongono zigoti ciclo cellulare rientro, rimodellamento della parete cellulare, caratteristiche in erba e l&#39;ereditarietà, ecc In alternativa, zigoti possono essere generati a partire con ceppi caratteristici portatori di mutazioni in uno o entrambi i genitori. Inoltre, gli zigoti purificati, come per cellule aploidi o diploide, ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente / attrezzature </td><td> Fonte </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, codifica GFP citoplasmatica 11) </td><td> E. Grote </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, codifica RPL25 fuso mCherry </td><td> A. Johnston </td><td></td></tr><tr><td> Fisher FB120 sonicatore </td><td> Fisher Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Tubo in polipropilene con tappo filtro </td><td> BD Falcon </td><td> Rif. 352235 </td></tr><tr><td> Microcentrifuga refrigerata </td><td> Tomy </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> Citometria di flusso soluzione guaina </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> iCyt Riflessione Modello citometro a flusso </td><td> Sony </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision deconvoluzione microscopio </td><td> Applied Precision </td><td></td></tr><tr><td> Montante microscopio a epifluorescenza </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapura agarosio </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-07 </td></tr><tr><td> CSM glucosio formulazione Note: Per le piastre di agar, è sufficiente includere il 2% agar (Difco) </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes

Zigoti sono intermedi essenziali tra aploidi e diploidi stati del ciclo di vita di molti organismi, tra cui il lievito (Figura 1) 1. S. Saccharomyces zigoti risultato dalla fusione di cellule aploidi di tipo accoppiamento distinte (Mata, MATalpha) e danno luogo a corrispondenti diploidi stabili che successivamente generano ben il 20 progenie diploide a causa delle loro divisioni mitotiche sorprendentemente asimmetrica 2. Formazione dello zigote è orchestrato da una complessa sequenza di eventi: In questo processo, fattori solubili accoppiamento legano a recettori cognate, innescando cascate di segnalazione recettoriali che facilitano interruzione del ciclo cellulare e culminano fusione cellula-cellula. Zigoti può essere considerato un modello per la funzione delle cellule progenitrici o staminali. Anche se molto si è imparato a conoscere la formazione di zigoti e sebbene zigoti sono stati utilizzati per studiare cellule molecolari questioni di interesse generale signiicance, quasi tutti gli studi hanno fatto uso di miscele di accoppiamento in cui sono mescolati con una popolazione zigoti maggioranza di cellule aploidi 3-8. Molti aspetti della biochimica della formazione dello zigote e la vita continua dello zigote restano pertanto non indagato. Rapporti di purificazione di zigoti lievito descrivere i protocolli base alle loro proprietà di sedimentazione 9, tuttavia, questa procedura sedimentazione basata non cede quasi il 90% di purezza nelle nostre mani. Inoltre, ha lo svantaggio che le cellule sono esposte a sorbitolo ipertonica. Abbiamo quindi messo a punto un procedimento di purificazione versatile. A questo scopo, coppie di cellule aploidi esprimono proteine ​​fluorescenti verdi o rossi sono stati co-incubate per permettere la formazione zigote, raccolte in tempi diversi, e gli zigoti risultanti sono stati purificati utilizzando un protocollo basato citometria di flusso ordinamento. Questa tecnica fornisce una valutazione conveniente visiva di purezza e di maturazione. La purezza mediadella frazione è circa il 90%. Secondo i tempi di raccolta, zigoti diversi gradi di maturità possono essere recuperati. I campioni purificati forniscono un comodo punto di partenza per &quot;-omiche&quot; studi, per il recupero della progenie iniziale, e per lo studio sistematico di questa cellula progenitrice.

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Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Per purificare zigoti di<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;, Cellule aploidi di tipo opposto accoppiamento sono stati progettati per esprimere proteine ​​fluorescenti rossi o verdi, co-incubate per permettere la formazione dello zigote, e frazionati con un protocollo basato citometria a flusso. Il altamente arricchito frazione consente la successiva &quot;-omiche&quot; studi, il recupero della progenie iniziale, e la ricerca sistematica della morfogenesi zigote.

Flusso Cytometry basata Purificazione<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigoti

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

flow-cytometry-based-purification-of-s-cerevisiae-zygotes

Research

JoVE Journal

Biology

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

12.7K Views.  Case Western Reserve University School of Medicine. Per purificare zigoti di S. cerevisiae, Cellule aploidi di tipo opposto accoppiamento sono stati progettati per esprimere proteine ​​fluorescenti rossi o verdi, co-incubate per permettere la formazione dello zigote, e frazionati con un protocollo basato citometria a flusso. Il altamente arricchito frazione consente la successiva "-omiche" studi, il recupero della progenie iniziale, e la ricerca sistematica della morfogenesi zigote.

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Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

Test di adesione ed invasione di Agar in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Ricerca

Biologia

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Un high-throughput metodo per studiare la morfologia globale organello in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

L&#39;identificazione di complessi proteici con la proteomica quantitativa in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purificazione Citometria a flusso di cellule di topo Meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

Studiare età-dipendente instabilità genomica utilizzando il S. Saccharomyces Modello Durata cronologica

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Espressione e purificazione della proteina transmembrana cistica regolatore fibrosi conduttanza in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Ottimizzato Metodi di modellazione e colorazione proliferazione per il monitoraggio divisione cellulare utilizzando coloranti Tracking Cellulari

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microiniezioni di Sea Urchin zigoti

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;