1. Configurazione del sistema <ol><li> F-7000 Spettrofotometro a fluorescenza dotato di alta fotomoltiplicatore gamma di sensibilità estesa R-928F rivelatore. </li><li> F-7000 Accessori: Rodamina B, diffusore, filtro rosso e sub-standard sorgente di luce sono stati utilizzati per generare i fattori di correzione spettrali dello strumento. </li><li> Accessorio Yield Quantum misura, che comprende: 60 mm Integrare sfera, piastrelle in ossido di alluminio bianche, Spectralon bianco standard, cellule polvere (2 sexies), polvere di ossido di alluminio e software resa quantica. </li><li> Generatore programma rapporto e il modello appropriato verrà utilizzato per il calcolo delle coordinate di cromaticità. </li></ol> 2. Configurazione del sistema <ol><li> Accendere il F-7000 Hitachi spettrofotometro a fluorescenza e attendere che la lampada allo xeno per scaldarsi per un&#39;ora. Iniziare a utilizzare il vano standard del campione (portacuvette) installato nello strumento. </li></ol> 3. Acquisition di integrare i fattori di correzione Sphere Quando si misurano i fattori di correzione Integrazione Sphere, il software seleziona automaticamente i parametri del test di misura elencati nella Tabella 1. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Condizioni analitiche </td></tr><tr><td> Misura </td><td> Lunghezza d&#39;onda di scansione </td></tr><tr><td> Modalità di scansione </td><td> Sincrono </td></tr><tr><td> Dati in modalità </td><td> Fluorescenza </td></tr><tr><td> EM WL </td><td> 200 nm </td></tr><tr><td> EX Inizio WL </td><td> 200 nm </td></tr><tr><td> Fine WL EX </td><td> 900 nm </td></tr><tr><td> Velocità di scansione </td><td> 240 nm / min </td></tr><tr><td> Ritardare </td><td> 5,0 s </td></tr><tr><td> Slit EX </td><td> 5,0 nm </td></tr><tr><td> EM Slit </td><td> 20 nm </td></tr><tr><td> PMT di tensione </td><td> 250 V </td></tr><tr><td> Spettri corretti </td><td> ON </td></tr><tr><td> Risposta </td><td> Auto </td></tr></tbody></table> Tabella 1. 3,1. Acquisizione dei dati Diffusore <ol><li> Mettere diffusore nel vano campione standard e chiudere il vano del campione. </li><li> Fare clic sulla finestra di misura Yield Factor Correction Quantum e poi, sulla misurazione diffusore. </li><li> Immettere il nome del file: &quot;IS_factor_F70_diffuser&quot; per i dati diffusore e fare clic su OK (Video 1). </li><li> Dopo la misurazione, il file verrà salvato nella cartella &quot;corretta&quot; di FL Solutions. Figura 1 è un esempio di dati di misurazione del diffusore. </li></ol> 3.2. Acquisizione del fattore di correzione per nessun campione (di riferimento) &lt;ol&gt; <li> Rimuovere il vano standard del campione dallo strumento, negozio di diffusore, quindi installare la sfera di integrazione. </li><li> Riempire la cella di polvere con polvere di ossido di alluminio fino ad una altezza di almeno 25 mm per assicurarsi che la polvere copre interamente il porto della sfera d&#39;integrazione. Toccare il fondo della cella attentamente per compattare la polvere. </li><li> Posizionare la piastrella ossido di alluminio bianco nella porta di riferimento (P2) della sfera integratrice (quello rivolto verso l&#39;emissione monocromatore) e la cella polvere con ossido di alluminio nel porto campione (P1) della sfera integratrice (quello rivolto verso l&#39;eccitazione monocromatore ). </li><li> Fare clic sulla finestra Yield Misura Quantum Factor Correction, allora sull&#39;integrazione di misura Sphere (senza campione) (Video 2). </li><li> Il software vi ricorderà di impostare i campioni. Immettere il nome &quot;è senza sample&quot; e fare clic su OK. </li><li> Dopo la misurazione, il file verrà salvato nella cartella &quot;funzione di correzione<html> t &quot;di Solutions FL. Figura 2 è un esempio della sfera di integrazione con i dati di misurazione nessun campione. </li></ol> 3,3. Acquisizione del fattore di correzione in presenza di un campione: <ol><li> Rimuovere la cella con polvere di ossido di alluminio e sostituirlo con lo standard Spectralon bianco. (La norma Spectralon dovrebbe essere rivolto verso il monocromatore di eccitazione (P1)). </li><li> Fare clic sulla finestra Yield Misura Quantum Factor Correction e quindi sull&#39;integrazione di misura Sfera (con il campione). Il software vi ricorderà di impostare il materiale standard per la misurazione della riflettanza. </li><li> Immettere il nome: &quot;E &#39;con il campione&quot; per la sfera di integrazione con il file di dati di esempio e fare clic su OK (Video 3). </li><li> Dopo la misurazione, il file verrà salvato nella cartella &quot;corretta&quot; di FL Solutions. Figura 3 è un esempio della sfera d&#39;integrazione con i dati di misura del campione. </li></ol>&quot;&gt; NOTA: Nel caso sia necessario utilizzare i filtri di cut-off per bloccare secondo light scattering ordine sul lato delle emissioni che interferiscono con il picco di fluorescenza, è necessario misurare una linea di base utilizzando solo il diffusore e anche il diffusore e il filtro del caso, tali. file di dati verranno utilizzati dal software per il calcolo resa quantica. In pratica si consiglia di misurare tutti i filtri cut-off come parte della configurazione iniziale del sistema. 4. Esempio di misura (Salicilato di sodio in polvere) Misurazione resa Quantum comporta l&#39;acquisizione di uno spettro di emissione sia no-campione (di riferimento) e in presenza di un campione. Selezionare i parametri analitici di misurazione come segue: <ol><li> Fare clic sul pulsante &quot;Metodo&quot; e nella scheda Generale scansione lunghezza d&#39;onda di selezionare la modalità di misurazione e immettere le informazioni appropriate per l&#39;operatore e gli accessori(Video 4). </li><li> Fare clic sulla scheda &quot;Instrument&quot; e inserire i parametri di misura per lo strumento come indicato nella Tabella 2 (video 5). </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Condizioni analitiche </td></tr><tr><td> Misura </td><td> Lunghezza d&#39;onda di scansione </td></tr><tr><td> Modalità di scansione </td><td> Emissione </td></tr><tr><td> Dati in modalità </td><td> Fluorescenza </td></tr><tr><td> EX WL </td><td> 350 nm </td></tr><tr><td> EM Inizio WL </td><td> 330 nm </td></tr><tr><td> EM Fine WL </td><td> 600 nm </td></tr><tr><td> Velocità di scansione </td><td> 1200 nm / min </td></tr><tr><td> Ritardare </td><td> 0 s </td></tr><tr><td> Slit EX </td><td> 5,0 nm </td></tr><tr><td> EM Slit </td><td> 5,0 nm </td></tr><tr><td> PMT di tensione </td><td> 350 V </td></tr><tr><td> Spettri corretti </td><td> ON </td></tr><tr><td> Risposta </td><td> Auto </td></tr><tr><td> Spettri corretti </td><td> ON </td></tr></tbody></table> Tabella 2. <ol start="3"><li> Non sono necessarie ulteriori impostazioni in questo momento dato che le impostazioni della scheda del monitor, elaborazione e report può essere effettuata dopo i dati sono stati misurati. Stiamo solo andando a leggere e poi fare clic sul pulsante OK, al fine di impostare i parametri di misurazione scelte nello strumento (Video 6). </li><li> Come opzione, le impostazioni selezionate potrebbero essere salvate per un uso futuro. Si procederà ora misurare l&#39;ossido di alluminio standard di riferimento con eccitazione diretta. </li><li> Posizionare la cella polvere con Al2O3 polvere nella porta di misura campione (P1) (davanti al fascio di eccitazione). </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;campione&quot;e digitare il nome del campione: &quot;P1_Baseline_Al2O3&quot;, quindi fare clic sulla casella accanto a &quot;file Auto&quot;. Selezionare il nome della cartella e file per i dati: &quot;P1_Baseline_Al2O3&quot;, quindi fare clic su &quot;Salva&quot; e &quot;OK&quot; (Video 7). </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Misura&quot; per misurare il campione Al2O3. (Video 8), dopo l&#39;elaborazione dei dati si apre la finestra, clicca su &quot;Scale Auto Axis&quot; pulsante di regolazione della scala, per visualizzare il picco di diffusione con eccitazione diretta (Figura 4). </li><li> Ora si procederà misurare il campione di salicilato di sodio con eccitazione diretta. Fare clic sull&#39;icona &quot;Sample&quot; e inserire &quot;Salicilato P1_Sodium&quot; per il nome del campione e il file, quindi fare clic sul pulsante OK (Video 9). </li><li> Collocare il campione Salicilato di sodio nella cella polvere e nel porto P1 della sfera d&#39;integrazione (la porta di fronte al fascio di luce di eccitazione) e fare clic sul pulsante &quot;Misura&quot;. (Video 10) Quando il processo dei datiING finestra si apre, fare clic su &quot;Auto Scale Asse&quot; per regolare la scala e visualizzare la dispersione e picchi di fluorescenza. </li><li> In questo momento ripeteremo misurazioni per ossido di alluminio e salicilato di sodio con i campioni posti in porto P2 della sfera integratrice, al fine di leggere usando eccitazione indiretta. </li><li> Innanzitutto fate click sul pulsante &quot;Campione&quot; e digitare il nome del campione e il file: &quot;P2_Baseline_Al2O3&quot; per tutti e due (Video 11). </li><li> Spostare la piastrella ossido di alluminio bianco da P2 a P1 della sfera d&#39;integrazione e posizionare una cella riempita con polvere di ossido di alluminio in P2. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Misura&quot; per leggere il campione (Video 12). </li><li> Per completare la misurazione del campione abbiamo bisogno di misurare il campione di salicilato di sodio mediante irradiazione indiretta. Per prima cosa digitare il campione e nomi di file come nei passi precedenti. Il nome sarà salicilato P2_Sodium (Video 13). </li><li> Collocare il campione salicilato di sodio nel porto P2 della sfera d&#39;integrazione e cliccare sul pulsante Misura (Video 14). </li></ol> 5. Quantum Yield Calcolo In primo luogo si procederà integrando il caricamento dei fattori di correzione sfera. <ol><li> Fare clic sul pulsante di calcolo resa quantica per aprire il programma di calcolo del quantum yield (Video 15). </li><li> Fare clic sul pulsante Impostazioni Quantum Yield Factor Correction (Video 16). </li><li> Fare clic sulla scheda Correzione sfera di integrazione e fare clic sulla casella accanto a &quot;correzione sfera integratrice&quot;, quindi fare clic sulla scheda Correzione filtro e assicurarsi che il &quot;filtro di correzione&quot; casella è selezionata, fare di nuovo clic sulla scheda Correzione sfera di integrazione (Video 17 ). </li><li> Fare clic sul pulsante Load della sezione Diffuse dati di misurazione, quindi selezionare il file &quot;IS_factor_F70 nessun campione&quot; ( <strong&gt; Video 18). </li><li> Selezionare il file &quot;IS_factor_F70_diffuser&quot; e quindi fare clic sul pulsante Carica (Video 19). </li><li> Fare clic sul pulsante Load dei dati di sfera integratrice di misura (senza campione) sezione (Video 20). </li><li> Selezionare l&#39;opzione &quot;IS_factor_F70 nessun campione&quot; file e quindi fare clic sul pulsante Carica (Video 21). </li><li> Fare clic sul pulsante Load dei dati di sfera integratrice di misura (con il campione) sezione (Video 22). </li><li> Selezionare l&#39;opzione &quot;IS_factor_F70 con il campione&quot; file e poi sul pulsante Carica (Video 23). </li><li> Lunghezza d&#39;onda normalizzato può essere lasciato a 600nm o portato al valore di lunghezza d&#39;onda in cui la correzione sfera di integrazione è uguale a 1. Per fare questo, assicurarsi che la casella davanti a &quot;Mostra finestra di calcolo resa quantica&quot; sia selezionato e fare clic sul pulsante OK della &quot;Impostazione fattore di rendimento Quantum&quot; Window, che si chiuderà questa finestra (Video 24). </li><li> Ora cliccate su &quot;Integrare Correzione Sphere&quot; scheda di &quot;Yield Calcolo Quantum&quot; finestra e regolare il cursore fino a quando il Integrare lettura correzione sfera è &quot;1&quot;, specificando la lunghezza d&#39;onda (Video 25). </li><li> Clicca su &quot;Setting Yield Factor Correction Quantum&quot; e se il cambiamento richiesto la lunghezza d&#39;onda normalizzata alla lettura ottenuto nella fase precedente e fare clic sul pulsante OK (Video 26). </li></ol> Il passo successivo è quello di caricare la linea di base ei dati di esempio dei file <ol start="13"><li> Clicca su &quot;Yield Calcolo Quantum&quot; tab (Video 27). </li><li> Caricare &quot;Data senza campione&quot; (file P1_Baseline_ Al2O3) per irraggiamento diretto cliccando sul pulsante di carico e carico &quot;dei dati con il campione&quot; (file salicilato P1_Sodium) per l&#39;irradiazione diretta (Video 28). </li><li&gt; Avanti si procederà a selezionare la &quot;dispersione&quot; e &quot;fluorescenza&quot; regioni (Video 29). </li><li> Ora si calcola la resa quantica di irradiazione diretta del campione. Fare clic sul pulsante &quot;Calcolo&quot; e leggere i risultati (Video 30). Avremo bisogno di questi dati per il calcolo finale della resa quantica per il campione prendendo in considerazione l&#39;eccitazione indiretta. </li><li> Fare clic sul file di testo e salvare i dati con il nome file &quot;irradiazione QY Direct&quot; (Video 31). </li><li> Utilizzando i dati dei file P2_Baseline_Al2O3 e salicilato P2_Sodium, calcoleremo resa quantica per l&#39;eccitazione indiretta (Video 32) Ora dobbiamo salvare i dati per il calcolo del rendimento finale Quantum. </li><li> Fare clic sul file di testo e salvare il testo file di dati con il nome di &quot;irraggiamento QY indiretta&quot; (Video 33) Ora dobbiamo aprire i due file di testo in Excel con i dati di resa quantica di direzionet eccitazione e indiretta. Infine si calcola la resa quantica per il campione incluso l&#39;effetto di eccitazione indiretta, utilizzando la formula seguente: </li></ol> Φ = Φd-(1-Ad) ΦI Dove: Φ è la resa corretta quantum tenendo conto di eccitazione indiretta Φd è il rendimento interno Quantum con eccitazione diretta. (Internal resa quantica = quantità di fluorescenza / quantità di luce di eccitazione assorbita.) Ad è l&#39;assorbenza per l&#39;eccitazione diretta. (Questo è il rapporto della quantità di fascio di eccitazione assorbita dal campione). (Assorbanza = (Arex - CsEx) / Arex, dove Arex è la quantità di luce di eccitazione e CsEx è la quantità di luce riflessa) ΦI è il rendimento interno Quantum con Indirect eccitazione Φ = 0,536 - (1-0,848) 0,420 Calcolato Φ = 0,47216 6. Calcolo della cromaticità <ol><li> Useremo opzionale Report Generator software con un modello preparato per il calcolo di cromaticità. </li><li> Aprire il file di dati salicilato P1_Sodium (Video 34). </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Proprietà&quot;, quindi la scheda &quot;Report&quot;. In &quot;Output&quot; &quot;foglio generatore di stampa Usa&quot;, selezionare dal menu a discesa. In &quot;Stampare articoli&quot; template selezionare &quot;FL70Std01_Color-chart.xls&quot; e quindi fare clic sul pulsante &quot;Apri&quot;. Non è necessario selezionare lunghezze d&#39;onda e l&#39;intervallo, poiché ciò viene eseguito automaticamente dal generatore relazione (Video 35). </li><li> Il passo successivo consiste nel creare il rapporto. Fare clic sulla scheda &quot;Report&quot; e la macro per la creazione del report verrà eseguito e salvato nella cartella &quot;Report&quot; in formato Excel con il nome del campione (Video 36). &lt;<html> / Li&gt; <li> In questo momento siamo in grado di aprire il report per visualizzare i dati di colore (Video 37). </li></ol> 7. Segreti del successo <ol><li> Utilizzare campioni freschi. </li><li> Essere consapevoli del fatto che il materiale di diversi produttori potrebbe dare risultati diversi. </li><li> Toccare il fondo della cella per compattare la polvere campione e presentano una superficie uniforme per la misurazione. </li><li> Proteggere i campioni dalla luce. Si deteriorano con l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Provare a utilizzare una velocità di scansione per minimizzare l&#39;esposizione del campione alla luce. </li></ol> 8. Risultati rappresentativi 8,1. Salicilato di sodio è noto per avere una resa quantica di 0,4-0,5 <img src="/files/ftp_upload/3066/3066fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/3066/3066fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . iles/ftp_upload/3066/3066fig2.jpg &quot;alt =&quot; Figura 1 &quot;/&gt; Figura 2. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/3066/3066fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/3066/3066fig3.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 3. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/3066/3066fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantum Yield Measurement of Sodium Salicylate. FL080002, 1 (2008).</li><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy.">Principles of Fluorescence Spectroscopy.</a> Science and Business Media, LLC. 60, (2006).</li><li>Horigome, J., Wakui, T., Shirasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Correction+Method+for+Determination+of+Absolute+Fluorescence+Quantum+Yields+of+Solid+Samples+with+a+conventional+Fluorescence+Spectrophotometer.">A Simple Correction Method for Determination of Absolute Fluorescence Quantum Yields of Solid Samples with a conventional Fluorescence Spectrophotometer.</a> Bunseki Kagako. 58 (6), 553-559 (2009).</li></ol>

Luis A. Moreno è impiegato da Hitachi High Technologies America, che produce lo strumento utilizzato in questo articolo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Salicilato di sodio in polvere </td><td> Wako </td><td> 191-03142 </td><td> Mol. Peso 160,10 </td></tr></tbody></table>

absolute quantum yield measurement of powder samples

Misurazione della resa quantica di fluorescenza è diventato uno strumento importante nella ricerca di nuove soluzioni per lo sviluppo, la valutazione, il controllo qualità e ricerca di illuminazione, apparecchiature AV, materiale organico EL, film, filtri e sonde fluorescenti per la bio-industria. Resa Quantum viene calcolato come rapporto del numero di fotoni assorbiti, al numero di fotoni emessi da un materiale. Maggiore è la resa quantica, migliore è l&#39;efficienza del materiale fluorescente. Per i rilievi presentati in questo video, useremo il Hitachi F-7000 spettrofotometro a fluorescenza equipaggiato con la resa quantica di misura Generator accessori e relazione sul programma. Tutte le informazioni fornite applica a questo sistema. Misurazione del rendimento quantico in campioni di polvere viene eseguita la procedura seguente: <ol><li> Generazione di fattori di correzione dello strumento per l&#39;eccitazione e emissioni monocromatori. Questo è un requisito importante per la corretta misurazione della resa quantica. È stata eseguita in anticipo per il campo di misura completa dello strumento e non verrà mostrato in questo video a causa di limitazioni di tempo. </li><li> Misurazione di integrare i fattori di correzione sfera. Lo scopo di questa fase è di prendere in considerazione le caratteristiche di riflettività della sfera di integrazione utilizzato per le misurazioni. </li><li> Di riferimento e la misura del campione con eccitazione diretta e indiretta di eccitazione. </li><li> Quantum calcolo di rendimento servendosi di eccitazione diretto e indiretto. Eccitazione è diretta quando il campione si affaccia direttamente sul fascio di eccitazione, che sarebbe il sistema di misura normale. Tuttavia, perché usiamo una sfera di integrazione, una parte dei fotoni emessi derivanti dalla fluorescenza campione sono riflessi dalla sfera d&#39;integrazione e si ri-eccitare il campione, quindi abbiamo bisogno di prendere in considerazione l&#39;eccitazione indiretta. Questo è accomplished misurando il campione posizionato nel porto di fronte al monocromatore di emissione, il calcolo indiretta resa quantica e correggendo il calcolo diretto resa quantica. </li><li> Corretto il calcolo resa quantica. </li><li> Coordinate di cromaticità calcolo utilizzando Generator programma Report. </li></ol> Gli F-7000 Hitachi Quantum Resa di misura i vantaggi del sistema di offerta per questa applicazione, come segue: <ul><li> Alta sensibilità (S / N ratio 800 o migliore RMS). Signal è la banda Raman dell&#39;acqua misurato nelle seguenti condizioni: lunghezza d&#39;onda 350 nm Ex, Ex passa banda e Em 5 nm, la risposta 2 sec), si misura il rumore al massimo del picco Raman. Alta sensibilità consente di misurare campioni anche con una bassa resa quantica. Usando questo sistema abbiamo misurato rese quantiche di soli 0,1 per un campione di acido salicilico e alta come 0,8 per un campione di magnesio tungstato. </li><li> Misurazione di alta precisione con una gamma dinamica di 6 ordini digrandezza consente misurazioni di entrambi i picchi di scattering taglienti con alta intensità, come pure ampie picchi di fluorescenza di bassa intensità alle stesse condizioni. </li><li> Elevata misura ridotta esposizione alla luce e al campione, a causa di una elevata velocità di scansione fino a 60.000 nm / minuto e una funzione di scatto automatico. </li><li> Misurazione della resa quantica su una vasta gamma di lunghezze d&#39;onda da 240 a 800 nm. </li><li> Accurate misurazioni della resa quantica sono il risultato di raccolta risposta spettrale strumento e integrare i fattori di correzione sfera prima di misurare il campione. </li><li> Grande selezione dei parametri calcolati forniti dal software dedicato e facile da usare. </li></ul> Durante il video si misurerà salicilato di sodio in polvere che è noto per avere un valore quantico resa di 0,4 a 0,5.

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Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

In questo video vi mostreremo misurare e calcolare assoluta resa quantica e cromaticità coordinate direttamente nei campioni di polvere secondo i Hitachi F-7000 Sistema di Yield Quantum misura.

Absolute Quantum la misurazione del rendimento dei campioni di polvere

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

27.8K Views.  Hitachi High Technologies America. In questo video vi mostreremo misurare e calcolare assoluta resa quantica e cromaticità coordinate direttamente nei campioni di polvere secondo i Hitachi F-7000 Sistema di Yield Quantum misura.

Video: Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Large Volume (20L+) Filtration of Coastal Seawater Samples

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For this method, samples were collected from the deck of the HMS John Strickland operating in Saanich Inlet. This video documents large volume (&ge;20 L) filtration of microbial biomass, ranging between 0.22&mu;m and 2.7&mu;m in diameter, from the water column. Two 20L samples can be filtered simultaneously using a single pump unit equipped with four rotating heads. Filtration is done in the field on extended trips, or immediately upon return for day trips. It is important to record the amount of water passing through each sterivex filter unit. To prevent biofilm formation between sampling trips, all filtration equipment must be rinsed with dilute HCl and deionized water and autoclaved immediately after use. This procedure will take approximately 5 hours plus an additional hour for clean up.

Large Volume 20L+ Filtration of Coastal Seawater Samples

This video documents large volume (&ge;20 L) filtration of microbial biomass, ranging between 0.22&mu;m and 2.7&mu;m in diameter, from the water column.

Volume di grandi dimensioni (20L +) Filtrazione di campioni d&#39;acqua di mare costiero

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For this method, ...

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Biologia

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

ΓH2AX quantificazione dei Foci, a campioni di tessuto

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1. Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since they do not react with colorimetric reagents2,3. Enzymatic hydrolysis (EH) is an emerging method for accurately characterizing organic P forms in environmental samples4,5. This method is only trumped in accuracy by Phosphorus-31 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (31P-NMR) -a method that is expensive and requires specialized technical training6. We have adapted an enzymatic hydrolysis method capable of measuring three classes of phosphorus (monoester P, diester P and inorganic P) to a microplate reader system7. This method provides researchers with a fast, accurate, affordable and user-friendly means to measure P species in soils, sediments, manures and, if concentrated, aquatic samples. This is the only high-throughput method for measuring the forms and enzyme-lability of organic P that can be performed in a standard laboratory. The resulting data provides insight to scientists studying system nutrient content and eutrophication potential.

This protocol describes a high-throughput method of enzymatic hydrolysis that utilizes a microplate reader to measure and classify soil phosphorus as P monoesters, P diesters and inorganic P. Up to 96 samples can be measured at one time in a standard laboratory.

High-Throughput misurazione e classificazione di P organici in campioni ambientali

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

Misura della chemiotassi cellulari con ECIS / Taxi

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Misura della durata della vita in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their cytotoxic granule content to eliminate the target cells and the intracellular pathogen. Death of the host cells and intracellular pathogens is triggered by the granule serine proteases, granzymes (Gzms), delivered into the host cell cytosol by the pore forming protein perforin (PFN) and into bacterial pathogens by the prokaryotic membrane disrupting protein granulysin (GNLY). To investigate the molecular mechanisms of target cell death mediated by the Gzms in experimental in-vitro settings, protein expression and purification systems that produce high amounts of active enzymes are necessary. Mammalian secreted protein expression systems imply the potential to produce correctly folded, fully functional protein that bears posttranslational modification, such as glycosylation. Therefore, we used a cost-efficient calcium precipitation method for transient transfection of HEK293T cells with human Gzms cloned into the expression plasmid pHLsec. Gzm purification from the culture supernatant was achieved by immobilized nickel affinity chromatography using the C-terminal polyhistidine tag provided by the vector. The insertion of an enterokinase site at the N-terminus of the protein allowed the generation of active protease that was finally purified by cation exchange chromatography. The system was tested by producing high levels of cytotoxic human Gzm A, B and M and should be capable to produce virtually every enzyme in the human body in high yields.

We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease.

A High Yield e Cost-efficient Sistema Espressione di granzimi umane in cellule di mammifero

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Reazione selezionato Monitoraggio spettrometria di massa per Absolute Protein Quantificazione

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield Espressione di proteine ​​ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This approach is appropriate for examining physiological changes in target gene expression levels. However, absolute quantification using better statistical analysis is preferable for a comprehensive assessment of gene expression levels. Absolute quantification is still not in common use. This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using RT-qPCR with or without pre-amplification.
A fixed volume (200 &#181;L) of EDTA-plasma was prepared from the blood collected from the femoral vein of conscious cynomolgus monkeys (n = 50). Total RNA was extracted using commercially available system. Plasma miRNAs were quantified by probe-based RT-qPCR assays which contains miRNA-specific forward/reverse PCR primer and probe. Standard curves for absolute quantification were generated using commercially available synthetic RNA oligonucleotides. A synthetic cel-miR-238 was used as an external control for normalization and quality assessment. The miRNAs that showed quantification cycle (Cq) values above 35 were pre-amplified prior to the qPCR step.
Among the 8 miRNAs examined, miR-122, miR-133a, and miR-192 were detectable without pre-amplification, whereas miR-1, miR-206, and miR-499a required pre-amplification because of their low expression levels. MiR-208a and miR-208b were not detectable even after pre-amplification. Sample processing efficiency was evaluated by the Cq values of the spiked cel-miR-238. In this assay method, technical variation was estimated to be less than 3-fold and the lower limit of quantification (LLOQ) was 102 copy/&#181;L, for most of the examined miRNAs.
This protocol provides a better estimate of the quantity of plasma miRNAs, and allows quality assessment of corresponding data from different studies. Considering the low number of miRNAs in body fluids, pre-amplification is useful to enhance detection of poorly expressed miRNAs.

This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using quantitative real-time reverse transcription PCR with or without pre-amplification. This protocol affords better understanding of the quantity of plasma miRNAs and allows qualitative assessment of corresponding data from different studies or laboratories.

Quantificazione assoluta dei livelli di MicroRNA del Plasma nella scimmia cynomolgus, mediante trascrizione d'inversione quantitativa Real-Time PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

Amministrazione semplice ed efficace e la visualizzazione di microparticelle nell'apparato circolatorio di piccoli pesci mediante l'inserimento di rene

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...