Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NIH R01DA021194 e R01NS058850.

1. Cervello fetta preparazione <ol><li> Giovani (15-40 giorni di età) maschili e femminili ratti Sprague-Dawley sono utilizzati. (Abbiamo anche utilizzare questo protocollo stesso nei topi.) Sotto anestesia uretano profondo, gli animali sono decapitati e il cervello è rapidamente sezionati fuori. Di 300 micron di spessore fette coronali del cervello che contiene la parte midrostral della substantia nigra sono tagliati su un vibratome Leica (VT-1200S). La fetta di taglio procedura viene eseguita in una gelida, saccarosio ossigenato di taglio soluzione contenente (in mm): 220 saccarosio, 2.5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 0,5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 10 D- glucosio. Si tratta di bolle con una miscela di 95% di CO O 2 / 5% da 2 a mantenere ossigenato e mantenere il pH a 7,4. Mantenere la soluzione di taglio ghiacciato durante tutta la procedura. </li><li> Le sezioni di cervello sono incubati in una camera di incubazione riempiti con un liquido artificiale ossigenato cerebrospinale (aCSF) contenente (in mm): 125 NaCl, 2.5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 2,5 CaCl 2, 1,3 MgCl 2, 10 D-glucosio. Si tratta di bolle con una miscela di 95% di CO O 2 / 5% da 2 a mantenere ossigenato e mantenere il pH a 7,4. La temperatura di incubazione è di 34 ° C per 45 min e poi a temperatura ambiente fino a quando la fetta cervello è trasferita nella camera di registrazione. </li></ol> 2. Fingerprinting elettrofisiologiche dei neuroni nigral <ol><li> Una fetta cervello è trasferito in una camera di registrazione di patch clamp continuamente perfuso con la aCSF ossigenato a 32 ° C. </li><li> Pipette di patch sono prelevate dalla autoclave borosilicato (KG-33) tubo capillare di vetro (1,10 mm di diametro, 1,65 mm di diametro, il re di precisione Vetro, Claremont, CA) utilizzando un PC-10 estrattore (Narishige, Tokyo, Giappone) e riempite con soluzione intracellulare preparati con DNase RNase-free-acqua (Fisher Scientific) (contenente 135 mM KCl, 0,5 mM EGTA, 10 HEPES mM, 1,5 mM MgCl 2, pH regolato a 7,3). Le pipette patch sono resistenze di 2-3 MΩ nella vasca da bagno. </li><li> Substantia nigra è identificata in base alla sua posizione anatomica distinti (Fig. 1A1-2). Sotto la guida visiva di un microscopio video (Olympus BX51W1) dotata di ottiche Nomarski e 60X lente immersione in acqua, grandi cellule nella substantia nigra pars compacta (SNC) e substantia nigra pars reticulata (SNR) (possibile neuroni DA e neuroni GABA) vengono selezionati per la registrazione. Convenzionali giga ohm stretto sigillo a cellula intera configurazione si ottiene (Fig. 1B1). Attuale analisi Morsetto e tensione possono essere eseguite. Per minimizzare la degradazione dell&#39;mRNA, registrazione elettrofisiologica dovrebbe essere breve (≤ 5 min). Una possibilità è quella di registrare solo la membrana e le proprietà spiking di fornire le impronte digitali elettrofisiologiche per i neuroni di interessi (Fig. B2-3). Questa breve registrazione richiede solo circa 1 min. </li></ol> 3. Citoplasma aspirazione <ol><li> Dopo le impronte digitali elettrofisiologici e caratterizzazione di SNR GABA e neuroni DA, aspirazione bocca dolce viene applicato per aspirare il citoplasma. Il nucleo della cellula può anche essere aspirato, con conseguente contaminazione da DNA genomico. La tenuta non deve essere spezzato; detriti altrimenti extracellulare tra mRNA può essere risucchiata nella pipetta di patch e contaminare il contenuto della cella. L&#39;integrità della tenuta è buona fino a quando l&#39;aumento della corrente di mantenimento a -70 mV non superi i 100 pA. </li><li> Poi il contenuto della cella aspirato viene espulsa in un tubo di 0,2 ml PCR rompendo la punta della pipetta e una piccola pressione positiva. Contenuto di una cella è raccolto in una provetta PCR. Dopo aver accettato il contenuto della cella, il tubo di raccolta PCR, pre-raffreddata su ghiaccio, è immediatamente posto in un congelatore a -20 ° C. </li><li> Per escludere la contaminazione dei detriti extracellulare che può contenere mRNA, la pipetta di patch è abbassato nel tessuto senza realmente aspirare citoplasma e poi il contenuto della pipetta è sottoposto a RT-PCR. </li></ol> 4. Trascrizione inversa (RT) <ol><li> Dopo aver raccolto il contenuto delle celle da un ragionevole numero di neuroni, di solito 10-20, RT dovrebbe iniziare immediatamente per ridurre al minimo la degradazione del mRNA. </li><li> Dal momento che la quantità del contenuto della cella da un singolo neurone è troppo piccolo, procedura di isolamento del RNA non viene eseguita. Per rimuovere il DNA genomico potenziale contaminazione, il contenuto della cella aspirato viene prima digerito da DNasi I (5 microlitri DNasi I e 1,6 microlitri DNasi I buffer, 5 min a 25 ° C). Poi DNasi I è inattivato con l&#39;aggiunta di 1,2 microlitri 25 mM EDTA e incubazione a 75 ° C per 5 min. </li><li> cDNA viene sintetizzato con il SuperScript III della trascrittasi inversa a base di cellule-Direct cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, tabella 1). Primo filone cDNA viene sintetizzato a 50 ° C per 50 minuti, poi la reazione è inattivato da incubazione a 85 ° C per 5 minuti e 1 ml RNasi H è aggiungereed per digerire mRNA (37 ° C per 20 min). Il singolo filamento del DNA è conservato a -20 ° C per l&#39;amplificazione PCR in seguito. </li><li> La rimozione completa del DNA genomico è stato verificato mediante RT-minus di controllo in cui si omette la trascrittasi inversa, mentre tutti gli altri componenti della reazione sono stati esattamente gli stessi. </li></ol> 5. Due stadio di amplificazione PCR <ol><li> Primer sono stati progettati secondo le sequenze in GenBank. Quando possibile, introne-spanning coppie di primer sono state utilizzate che consentono di rilevare la contaminazione di DNA genomico. Sequenze di coppia di primer sono elencati nella Tabella 2. L&#39;efficacia delle coppie di primer deve essere prima verificato da mRNA intero cervello che producono prodotti positivo. Tutti i primer sono sintetizzati dal Integrated Technologies DNA (Iowa City, Iowa, USA). </li><li> Nella prima fase, 5 ml di i 30 microlitri cDNA viene amplificato per 35 cicli in presenza di coppia di primer (Tabella 2). Il protocollo cicli termici del termociclatore (Mastercycler, Eppendorf, Tabella 1) è di 2 min a 94 ° C per la denaturazione iniziale, poi 35 cicli di 15 s a 94 ° C per denaturare, 30 s a 55 ° C per temprare, e 45 s a 72 ° C per estendere, seguita da 7 min per una estensione finale. Taq DNA polimerasi, deossinucleotidi trifosfati (dNTPs), e tutti gli altri componenti necessari per l&#39;amplificazione PCR sono forniti da un super mix PCR (Invitrogen, tabella 1) </li><li> Nella fase di PCR secondo, il prodotto di 1 microlitri dal palco del 1 ° amplificazione PCR è usato come modello e la coppia di primer stesso utilizzato nella prima fase viene utilizzato (Tabella 2). 40 cicli vengono eseguiti con il tempo di estensione ridotta a 30 s. Lo stesso mix di super-PCR è usato. </li><li> Prodotti di PCR di amplificazione della 2 ° fase sono separati da 2,5% elettroforesi su gel di agarosio, visualizzati con bromuro di etidio (0,05 mg/100 ml gel) o gelgreen ai raggi UV, e fotografato (fig. B4). Le bande positive vengono poi tagliati fuori, estratto utilizzando un kit di estrazione Qiagen (Tabella 1) e sequenziato, e confrontati con le sequenze pubblicate di geni bersaglio. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: L&#39;(DA) neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta e pars reticulata ei neuroni vicini proiezione GABA nella substantia nigra pars reticulata sono distinte caratteristiche elettrofisiologiche (Zhou et al 2006;. Ding et al 2011.). Come mostrato in fig. 1B2, SNR neuroni GABA mostra spiking alta frequenza spontanea di circa 10 Hz. Le punte hanno una durata base di circa 1 ms. Su iperpolarizzante iniezione di corrente, SNR neuroni GABA visualizzare un abbassamento debole depolarizzante in risposta a iperpolarizzante iniezione di corrente, che indica una debole espressione di I h attuali in questi neuroni (Fig. 1B2). Al contrario, i neuroni nigral DA presentano bassa frequenza (circa 2 Hz), picchi spontanei che hanno una durata base di circa 3 ms. Neuroni DA mostrano anche un abbassamento pronunciato in risposta a iperpolarizzante iniezione di corrente, che indica una forte espressione della corrente I h (Fig. 1B3) (Zhou et al 2006;.. Ding et al 2011). SCRT-PCR rilevato mRNA per acido glutammico decarbossilasi 1 (GAD1, l&#39;enzima chiave per la sintesi del GABA e un marker per i neuroni GABA) in elettrofisiologico identificato Snr GABA neuroni, ma non in DA neuroni (Fig. 1B4, 5). Al contrario, SCRT-PCR rilevato mRNA per tirosina idrossilasi (TH, enzima chiave per la sintesi di dopamina e un marker di neuroni DA) in elettrofisiologico identificato Snc e SNR neuroni DA, ma non in neuroni GABA (Fig. 1B4, 5). Così SCRT-PCR risultati confermano l&#39;identificazione elettrofisiologiche dei neuroni. Successivamente, SCRT-PCR è stato utilizzato per il profilo l&#39;espressione di tensione ad attivazione KV3 subunità del canale, Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 e Kv3.4. Queste subunità contribuiscono a formare voltaggio-dipendenti K + canali di proprietà diverse a seconda della composizione subunità (Ding et al. 2011). Nell&#39;esempio SNR GABA neurone mostrato in fig. 1B4, mRNA per Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 e Kv3.4 sono stati rilevati. Nell&#39;esempio SNR DA neurone mostrato in Fig.1B5, solo Kv3.2, Kv3.3 e Kv3.4 sono stati rilevati. Nel nostro pool di dati, Kv3.1 era più frequentemente rilevata nel SNR neuroni GABA che in nigral neuroni DA, indicando un alto livello di espressione del Kv3.1 in rapida spiking SNR neuroni GABA (Ding et al. 2011). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3136/3136fig1.jpg" /> Figura 1. Identificazione elettrofisiologiche dei neuroni GABA Snr e nigral neuroni DA A:.. Aree nigral possono essere identificati dalla loro posizione anatomica distinte A1 mostra la posizione del SNC e SNR in una coronale Nissl macchiato di sezione catturate con un obiettivo 1X. L&#39;area è stata scatola captured con un obiettivo 10X e visualizzati nel mezzo come indicato dalla freccia. La cella ricca di SNC e cellule poveri SNR sono chiaramente visibili. A2 mostra la posizione del SNC e SNR in un live, senza macchia sezione coronale catturate con un obiettivo 4x. La cella ricca di SNC e cellule poveri SNR sono chiaramente identificabili. VTA, nell&#39;area ventrale tegmentale. B1 mostra un SNR GABA cerotto neurone essere bloccato in cellula intera modalità. B2 mostra le proprietà elettrofisiologiche tipiche di SNR neuroni GABA in modalità di registrazione corrente morsetto. Questi incendi spontanei neuroni ad alta frequenza potenziale azione di breve durata e hanno un debole I h-mediata abbassamento iperpolarizzante iniezione di corrente. B3 mostra tipica proprietà elettrofisiologiche di neuroni DA nigral in modalità di registrazione corrente morsetto. Sparano spontaneo a bassa frequenza dei potenziali di azione di lunga durata e hanno un rilievo I h-mediata sag (testa di freccia) risposta a iperpolarizzante iniezione di corrente. Così, SNR neuroni GABA e neuroni dopaminergici nigral sono chiaramente identificati elettrofisiologico. B4 mostra un quadro di gel SCRT-PCR prodotti da un elettrofisiologico identificato Snr GABA neurone. Glutammato decarbossilasi 1 (GAD1) ​​mRNA ma non tirosina idrossilasi (TH) mRNA è stato rilevato. mRNA per Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 e Kv3.4 sono stati individuati in questo GABA Snr neurone. B5 mostra SCRT-PCR rilevazione di mRNA neuronali canale KV3 in un DA Snr neurone. MRNA TH ma non GAD1 mRNA è stato rilevato in un elettrofisiologico identificato Snr DA neurone. mRNA per Kv3.2, Kv3.3 e Kv3.4 sono stati individuati in questo DA Snr neurone. B6 mostra i dati raccolti. 7. I potenziali risultati falsi negativi e falsi positivi Sulla base della nostra esperienza, diversi fattori possono portare a falsi negativi SCRT-PCR risultati. Questi fattori includono fallimento in quantità sufficiente aspirazione del citoplasma grazie alla patch di intasamento punta della pipetta, contaminazione da RNasi, e inefficiente primer PCR. Patch intasamento puntale di solito può essere visto sul monitor video e indicati dalla resistenza maggiore accesso. Contaminazione da RNasi può essere evitato con lo spegnimento completo e guanti. Efficacia di PCR dovrebbero essere testati utilizzando RNA totale da tessuto cerebrale pugno (Zhou et al 2008;.. Ding et al 2011). Dato che usiamo sempre DNasi per il trattamento di prima i nostri campioni prima di RT, non abbiamo incontrato risultati falsi positivi. Teoricamente, senza digestione DNase, contaminazione da DNA genomico, e quindi falsi positivi possono verificarsi quando il gene è intronless o la coppia di primer non copre l&#39;intera regione introne.

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	<li>J, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+pacemaker+frequency+of+individual+dopaminergic+neurons+by+Kv4.3L+and+Kchip3.1+transcription.">Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription.</a> EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).</li><li>Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+expression+of+dopamine+receptors+in+neostriatal+medium+spiny+neurons.">Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons.</a> J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).</li><li>Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutively+active+TRPC3+channels+regulate+basal+ganglia+output+neurons.">Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).</li><li>Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-short+dopamine+pathway+regulates+basal+ganglia+output+neurons.">An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).</li><li>Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kv3-like+potassium+channels+are+required+for+sustained+high-frequency+firing+in+Basal+Ganglia+output+neurons.">Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons.</a> J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).</li><li>Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+functions+of+histamine+H1+and+H2+receptors+and+H3+receptors+in+substantia+nigra+pars+reticulata.">Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata.</a> J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La combinazione di registrazione patch clamp in fetta cervello con SCRT-PCR abbiamo dimostrato qui fornire un metodo eccellente per studiare i profili di espressione dell&#39;mRNA per canali ionici, recettori ed enzimi chiave per la sintesi dei neurotrasmettitori in neuroni individualmente caratterizzato. Ciò è particolarmente utile quando la proteina in questione non può essere rilevato e localizzato utilizzando altri metodi, come l&#39;immunoistochimica a causa di bassi livelli di espressione e / o mancanza di anti...

<img src="/files/ftp_upload/3136/3136table1.jpg" alt="Tabella 1" /> Reagenti chiave Tabella 1. E attrezzature <img src="/files/ftp_upload/3136/3136table2.jpg" alt="Tabella 2" /> Tabella 2. Paia Primer per neuronali di ratto KV3 canale, tirosina idrossilasi (TH) e acido glutammico decarbossilasi 1 (GAD1) ​​mRNA per SCRT-PCR

profiling voltage-gated potassium channel mrna expression in nigral neurons using single-cell rt-pcr techniques

Nel sistema nervoso centrale dei mammiferi, i diversi tipi di neuroni con diverse caratteristiche molecolari e funzionali sono mescolate tra loro, difficili da separare e anche non facilmente identificabili per la loro morfologia. Così, è spesso difficile analizzare l&#39;espressione genica in un tipo specifico neurone. Qui documento di una procedura che combina a cellula intera tecniche di registrazione di patch clamp con cella singola invertire reazione a catena della polimerasi della trascrizione (SCRT-PCR) per profilo di espressione di mRNA in diversi tipi di neuroni nel nigra sostanziale. Tecniche elettrofisiologiche vengono prima utilizzate per registrare le proprietà neurofisiologiche e funzionali dei singoli neuroni. Poi, il citoplasma di singoli neuroni elettrofisiologico caratterizzato nigral è aspirato e sottoposto a SCRT-PCR per ottenere profili di espressione di mRNA per la sintesi degli enzimi dei neurotrasmettitori, recettori e canali ionici. L&#39;elevata selettività e sensibilità rendono questo metodo particolarmente utile quando l&#39;immunoistochimica non può essere utilizzata a causa della mancanza di anticorpi adatti o basso livello di espressione della proteina. Questo metodo è applicabile anche a neuroni in altre aree cerebrali.

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Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

I neuroni vengono prima caratterizzata elettrofisiologico. Poi il citoplasma dal neurone registrato è aspirato e sottoposto a trascrizione inversa-PCR per rilevare l&#39;espressione di mRNA per la sintesi degli enzimi dei neurotrasmettitori, canali ionici e recettori.

Profiling di potassio voltaggio-dipendenti espressione di mRNA nei neuroni Canale nigral con singola cella di RT-PCR Tecniche

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

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15.2K Views.  University of Tennessee College of Medicine. I neuroni vengono prima caratterizzata elettrofisiologico. Poi il citoplasma dal neurone registrato è aspirato e sottoposto a trascrizione inversa-PCR per rilevare l'espressione di mRNA per la sintesi degli enzimi dei neurotrasmettitori, canali ionici e recettori.

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Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

Single-cell Profiling dei neuroni retinici maturi e in sviluppo

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Ricerca

Neuroscienze

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Registrazione Light-evocato Risposte postsinaptica nei neuroni in Dark-adattati, i preparativi della retina del mouse Slice Utilizzando tecniche di patch clamp

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcellulari patch-clamp dal dominio Somatodendritic di nigral dopamina neuroni

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

Identificazione affidabile di vita neuroni dopaminergici in Culture Midbrain Utilizzando RNA Sequencing e TH-promotore-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati ​​utilizzando sonde fluorescenti

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

Espressione del Transgene di mediata da Virus adeno-associato in neuroni geneticamente definiti del midollo spinale

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

Facendo, test e l'utilizzo di microelettrodi selettivo di ioni potassio in fettine di tessuto del cervello adulto

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing platforms process all input cells indiscriminately. Sometimes, fluorescence-activated cell sorting (FACS) is used upstream to isolate a specifically labeled population of interest. A limitation of FACS is the need for high numbers of input cells with significantly labeled fractions, which is impractical for collecting and profiling rare or sparsely labeled neuron populations from the mouse brain. Here, we describe a method for manually collecting sparse fluorescently labeled single neurons from freshly dissociated mouse brain tissue. This process allows for capturing single-labeled neurons with high purity and subsequent integration with an in vitro transcription-based amplification protocol that preserves endogenous transcript ratios. We describe a double linear amplification method that uses unique molecule identifiers (UMIs) to generate individual mRNA counts. Two rounds of amplification results in a high degree of gene detection per single cell.

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

This protocol describes the manual sorting procedure to isolate single fluorescently labeled neurons followed by in vitro transcription-based mRNA amplification for high-depth single-cell RNA sequencing.

Sequenziamento di RNA unicellulare di neuroni di topo fluorescente contrassegnati con cernita manuale e doppia trascrizione In Vitro con conteggi assoluti sequenziamento (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a single-cell electroporation technique that maximizes the efficiency (~80%) of in vitro gene transfection in excitatory and class-specific inhibitory neurons in mouse organotypic hippocampal slice culture. Using large glass electrodes, tetrodotoxin-containing artificial cerebrospinal fluid and mild electrical pulses, we delivered a gene of interest into cultured hippocampal CA1 pyramidal neurons and inhibitory interneurons. Moreover, electroporation could be carried out in cultured hippocampal slices up to 21 days in vitro with no reduction in transfection efficiency, allowing for the study of varying slice culture developmental stages. With interest growing in examining the molecular functions of genes across a diverse range of cell types, our method demonstrates a reliable and straightforward approach to in vitro gene transfection in mouse brain tissue that can be performed with existing electrophysiology equipment and techniques.

Presented here is a protocol for single-cell electroporation that can deliver genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice culture ages. Our approach provides precise and efficient expression of genes in individual cells, which can be used to examine cell-autonomous and intercellular functions.

Elettroporazione a cella singola attraverso diverse culture di fette organotipiche di neuroni eccitatori ippocampali del topo e specifici della classe

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting the expression of G protein-coupled receptors (GPCRs). Formalin-fixed jugular-nodose ganglia were processed with the RNAscope technology to simultaneously detect the expression of two representative GPCRs (cholecystokinin and ghrelin receptors) in combination with one marker gene of either nodose (paired-like homeobox 2b, Phox2b) or jugular afferent neurons (PR domain zinc finger protein 12, Prdm12). Labeled ganglia were imaged using confocal microscopy to determine the distribution and expression patterns of the aforementioned transcripts. Briefly, Phox2b afferent neurons were found to abundantly express the cholecystokinin receptor (Cck1r) but not the ghrelin receptor (Ghsr). A small subset of Prdm12 afferent neurons was also found to express Ghsr and/or Cck1r. Potential technical caveats in the design, processing, and interpretation of multiplex ISH are discussed. The approach described in this article may help scientists in generating accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Multiplex in situ hybridization (ISH) was employed to simultaneously visualize the transcripts for two G protein-coupled receptors and one transcription factor in the entire vagal ganglionic complex of the adult mouse. This protocol could be used to generate accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Rilevazione dell'espressione del recettore accoppiato alla proteina G nei neuroni afferenti vagali di topo utilizzando l'ibridazione multiplex in situ

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...