La piattaforma vettoriale lentivirale ha un grande vantaggio rispetto alla piattaforma vettoriale più popolare, in particolare a causa della capacità dei vettori lentivirali di ospitare inserti genetici più grandi. Pertanto, sembra che il vettore lentivirale sarebbe la piattaforma preferita nell'applicazione che prevede la consegna di strumenti CRISPR / Cas. Questa tecnica imita il meccanismo regolatore naturale dell'espressione alfa-sinuleina che quando è compromessa è associata a malattia.
Permette la messa a punto del livello di espressione rispetto ai robusti cambiamenti nell'espressione genica. Consiglio vivamente di convalidare questo o approcci simili utilizzando più RNA guida per lo screening. C'è una grande variabilità nella potenza dell'RNA guida.
L'unico modo per determinarlo è lo screening e la convalida robusti e completi. Il sistema sviluppato può essere facilmente adattato ad altri sistemi modello come modelli animali tra cui primati roditori e non umani. Questi esperimenti di follow-up potrebbero servire da prova di concetto per futuri studi clinici.
A dimostrare la procedura sarà la Dott.ssa Ekaterina Ilich, membro senior dello staff del mio laboratorio, focalizzata sull'esecuzione della procedura di clonazione molecolare per la creazione di Plasmidi Vettoriali Lentivirali relativi a questo progetto. Dimostrerà anche i passaggi chiave coinvolti nella produzione lentivirale vector. A dimostrare la procedura sarà anche la Dott.ssa Lidia Tagliafierro, un postdoc del mio laboratorio incentrato sulla differenziazione delle cellule iPS umane in cellule patologiche rilevanti.
Dimostrerà i passaggi chiave nella creazione di saggi per valutare i profili di metilazione della synucleina intron1. Ahila Sriskanda, un membro dello staff del mio laboratorio che si concentra sulla cultura delle cellule progenitrici neurali derivate dalle cellule iPS umane. Per iniziare, sviluppare il dominio catalitico DNMT3A dal d-Cas9-DNMT3A-GFP amplificando la porzione DNMT3A del vettore.
Dopo aver digerito il frammento DNMT3A usando un enzima di restrizione BamH1. Cloat nel sito BamH1 del vettore PBK-301 modificato che trasporta d-Cas9 e verificato dal sequenziamento diretto di Sanger, per sostituire il gene reporter Meissen puro e il plasmide risultante con GFP digerire d-Cas9-DNMT3A-P2A puro Meissen e plasmide con FSC 1. Purificare il frammento vettoriale usando un metodo di purificazione del gel.
Preparare l'inserto digerendo PBK-201 con FSC-1. Clonare il frammento FSC 1 nel vettore per creare d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP. Rivestire piatti da 15 centimetri con gelatina allo 0,2% per la trasfezione e attendere 10 minuti.
Quindi aspirare la gelatina e aggiungere 22,5 millilitri di mezzo ad alto contenuto di glucosio e 2,5 millilitri di sospensione cellulare HEK-293T precedentemente coltivata. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius con 5%CO2 fino a raggiungere il 70-80% di confluenza. Per preparare la miscela plasmide sufficiente per la piastra di 115 centimetri utilizzare i quattro plasmidi descritti nel manoscritto.
Aggiungere 312,5 micro litri di un cloruro di calcio molare allo stesso tubo da 15 millilitri con i plasmidi e portare il volume finale a 1,25 millilitri utilizzando acqua sterile a doppia distillazione. aggiungere delicatamente 1,25 millilitri di due soluzione X BBM cadere saggiamente sul tubo durante il vortice. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
Aspirare il mezzo dalle cellule e aggiungere 22,5 millilitri di DMEM ad alto glucosio appena preparato senza siero. Aggiungere 2,5 millilitri della miscela di trasfezione cadere saggiamente su ogni piatto. Ruotare le piastre e incubare a 37 gradi Celsius con 5%CO2 per due o tre ore dopo l'incubazione aggiungere 2,5 millilitri di siero per piastra per ottenere il 10% di diluizione e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius con 5%CO2.
Per raccogliere il virus raccogliere il supernatante da tutte le cellule trasfette e tirarle in tubi conici da 50 millilitri. Centrifugare a 400-450 g per 10 minuti a temperatura ambiente e quindi filtrare il supernatante attraverso un filtro sottovuoto da 0,45 micrometri. Successivamente creare un gradiente di saccarosio preparando tubi conici ultra centrifugati.
Aggiungere con cura il supernatante filtrato al gradiente distribuendo equamente il supernatante virale tra ogni tubo ultra centrifugato riempiendo almeno tre quarti di ciascun tubo. Centrifugare i campioni a 70000 g per due ore a 17 gradi Celsius. Raccogliere delicatamente dal 30% al 60% di frazioni di saccarosio in tubi puliti aggiungere PBS 1X freddo fino a 100 millilitri di volume totale e pipetta più volte da mescolare.
Aggiungere con cura quattro millilitri di saccarosio al 20% in 1X PBS a ciascun tubo per stratificare la preparazione virale continuare pipettando circa 20-25 millilitri della soluzione virale per ogni tubo. Bilanciare accuratamente i tubi e quindi centrifugare a 70000 g per due ore a 17 gradi Celsius. Aspirare con cura il liquido rimanente per rimuovere completamente tutto il liquido lasciando il virus contenente pellet che sono appena visibili come piccole macchie traslucide.
Dopo aver svuotato il supernatante invertire i tubi su tovaglioli di carta per consentire al liquido rimanente di drenare. Aggiungere 70 micro litri di 1X PBS al primo tubo e pipettare accuratamente per sospendere di nuovo il pellet. Trasferire la sospensione sul tubo successivo e ripetere con pipettazione e trasferimento fino a quando tutti i pellet non vengono ri-sospesi.
Aggiungere altri 50 micro litri di 1X PBS al primo tubo e mescolare per lavarlo. Quindi trasferire la sospensione sul secondo tubo per lavare e continuare con il lavaggio e il trasferimento come in precedenza, producendo circa 120 micro litri della sospensione finale leggermente lattiosa. Centrifugare a 10000 g per 60 secondi per ottenere una sospensione chiara trasferire il supernatante su un nuovo tubo e rendere aliquota di cinque micro litri e conservarli a -80 gradi Celsius posizionare un Cryovial con MD NPC in un blocco termico di 37 gradi Celsius per due minuti e trasferire le celle scongelate in un tubo conico da 15 millilitri con 10 millilitri di DMEM-F12 caldo.
Centrifuga a 300 g per cinque minuti. Aspirare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in due millilitri di mezzo N2B2 completo prerimpito. Aggiungere due millilitri di N2B27 alla sospensione cellulare e placcare due millilitri di cellule in ogni pozzo della piastra di pozzo precedentemente preparata con codice BMM.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con 5%CO2 durante la notte. Quando gli NPC MD sono al 70% di confluenza, trasdurli aggiungendo due micro litri di vettori di guida del lentivirus RNA d-Cas9-DNMT3A e ruotare delicatamente la piastra. Dopo aver incubato le cellule alle stesse condizioni di prima per 16 ore sostituire il mezzo N2B27 48 ore dopo la trasduzione.
Aggiungere N2B27 con cinque microgrammi per millilitro di Meissen puro per ottenere le linee NPC MD stabili, far crescere le cellule per tre settimane in N2B27 più Meissen puro per caratterizzare il profilo di metilazione dell'introne SNCA 1. Prima estrarre il DNA da ogni linea cellulare del trasduttore stabile utilizzando un kit di estrazione del DNA, quindi utilizzare 800 nanogrammi di DNA per eseguire una conversione di bisolffuro con un kit disponibile in commercio e quindi un DNA convertito in 20 nanogrammi per micro litro. Per l'analisi piro-sequenziamento preparare la miscela master PCR in un tubo privo di nucleo trasferire la piastra di reazione a un termociclore e avviare la PCR.
Visualizza gli ampliconi usando due micro litri di prodotto PCR con una colorazione a 30 e bromuro a seguito dell'elettroforesi del gel di Agarosio. Per i saggi piro-sequenzianti si usavano miscele di DNA convertiti con solfuro e reagenti piro-sequenzianti come descritto nel manoscritto. Calcolare i valori di metilazione per ogni sito CPG utilizzando le rese fisiche del software di piro-sequenziamento del vettore Lentivirus d-Cas9-DMMT3A-GFP e il vettore NAIVE GFP generato utilizzando questo protocollo sono comparabili.
Ciò suggerisce che l'utilità della dorsale vettoriale ottimizzata combinata con il protocollo di produzione ottimizzato si traduce in rese elevate più strette dei tassi di trasduzione dei vettori CRISPR-dCas9 del vettore GFP Lentivirus d-Cas9-DNMT3 quattro volte inferiori a quelli del vettore NAIVE GFP suggerendo che l'efficienza di imballaggio del CRISPR d-Cas9-RNA è ridotta. I tassi di trasduzione del vettore PURO ingenuo erano cinque volte superiori rispetto al vettore d-Cas9-DNMT3A. Questi risultati sono stati ulteriormente confermati utilizzando naive GFP e d-Cas9-DNMT3A-GFP.
Il protocollo basato su EB qui descritto consente la differenziazione dei PNG MD. hiPSC espresso piacere marcatore di potenza Oct4 mentre l'MD NPC è espresso sia Nestin che FoxA2. Sette test di piro-sequenziamento sono stati progettati e convalidati per la quantificazione dello stato di metilazione nell'introne 1 della SNCA.
Tutti e 7 i test sono stati convalidati e hanno mostrato una correlazione lineare, utilizzando i test convalidati è stato possibile determinare i livelli di metilazione ai 23 CG nell'introne 1 della SNCA La cosa più importante da ricordare rispetto alla partecipazione a questa procedura è lavorare con cellule che mostrano una crescita e una salute adeguate per garantire coerenza tra gli esperimenti. La produzione di vettori lenticchie evidenziati in questa presentazione può essere facilmente adottata alla produzione di integrali carenti anti-virus che è anche può essere facilmente scalata fino a generare quantità maggiori o vettori più concentrati. Questa tecnica può aprire la strada all'esplorazione dell'impatto patogeno dei geni che si derenovono sull'età o sui disturbi generativi tra cui il morbo di Alzheimer e le relative demenze.
Il vantaggio dei vettori lenticchie che si sviluppano qui è che non è pericoloso o non i vettori lenticchie infettivi hanno solo un effetto minimo sul ciclo cellulare, sono una piattaforma di somministrazione sicura e affidabile per applicazioni di terapia genica.
