Questo lavoro è stato supportato dal NINH concedere R01MH097949 e l&#39;autismo parla pilota di Grant 7359 al BWL e il Norris Cotton Cancer Center Optical Imaging Shared Strumentazione di Grant P30CA023108.

<ol>
	<li>Williams, M. R., DeSpenza, T., Li, M., Gulledge, A. T., Luikart, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactivity+of+newborn+Pten+knock-out+neurons+results+from+increased+excitatory+synaptic+drive.">Hyperactivity of newborn Pten knock-out neurons results from increased excitatory synaptic drive.</a> J Neurosci. 35 (3), 943-959 (2015).</li><li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pten+knockdown+in+vivo+increases+excitatory+drive+onto+dentate+granule+cells.">Pten knockdown in vivo increases excitatory drive onto dentate granule cells.</a> J Neurosci. 31 (11), 4345-4354 (2011).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-132+mediates+the+integration+of+newborn+neurons+into+the+adult+dentate+gyrus.">miR-132 mediates the integration of newborn neurons into the adult dentate gyrus.</a> PLoS One. 6 (5), e19077 (2011).</li><li>Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification+and+titration+of+a+lentivirus-based+vector+for+gene+delivery+purposes.">Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes.</a> Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).</li><li>Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+higher+titer+lentivirus+with+caffeine.">Creating higher titer lentivirus with caffeine.</a> Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).</li><li>Fricano, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acids+increase+neuronal+hypertrophy+of+Pten+knockdown+neurons.">Fatty acids increase neuronal hypertrophy of Pten knockdown neurons.</a> Front Mol Neurosci. 7, 30 (2014).</li><li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+are+they+the+future+of+animal+transgenesis?.">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis?.</a> Physiol Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ci sono alcuni passaggi critici che sono importanti per il confezionamento virale di successo. salute delle cellule è critico prima e durante la trasfezione, le cellule non sane ridurrà notevolmente la quantità di virus prodotto. Se la trasfezione e confezionamento hanno successo, allora il 100% delle cellule dovrebbe esprimere il fluoroforo e le celle deve formare un sincizio funzionale. Nel passaggio 3.2.4, toccando il tubo è necessaria per alto titolo trasfezione efficiente, e il pH della soluzione salina tamponata con HEPES-deve essere esatta. Il maxi-prep che producono i plasmidi necessari per il confezionamento virale devono essere estremamente puro. A questo punto, è utile etanolo precipitare il DNA eluizione finale e risospendere in tampone Tris-EDTA. È inoltre molto importante per ridurre la quantità di siero a 2% o meno nei media che la caffeina è aggiunta a il giorno 6 (passo 3.4) prima della raccolta virale. Se il siero non viene ridotta, quindi il virus purificato finale contiene una quantità indesiderabile di prot sieroEin. L&#39;uso di polietilene glicole 6000 quando precipitare le particelle virali esclude la necessità di ultracentrifugazione. E &#39;anche importante notare che i CRISPR contenente virus Cas9 tipicamente hanno un titolo circa 10 volte inferiore a virus contenenti esclusivamente un fluoroforo. Per la radiochirurgia stereotassica, l&#39;uso di anestesia inalatoria permette un controllo rapido e preciso o coscienza dell&#39;animale rispetto agli anestetici iniettabili e permette anestesia su una gamma di età maggiore. E &#39;molto importante mantenere gli strumenti chirurgici pulito e sterile, e il targeting riproducibile richiede un posizionamento preciso della testa. Assicurarsi che non vi è alcuna beccheggio o di rollio della testa nello strumento stereotassico e che il cranio si sente saldamente in posizione. Può essere utile per consentire il cranio asciugare per trovare i punti di sutura per determinare le coordinate stereotassica. Inoltre, il tasso e il volume per ogni stereotassica coordinate dovrebbero essere empiricamente determinato. Questa tecnica è limitante in quanto la diffusione di un lenti- o di retrovirus è limitato, soprattutto se confrontato con i virus adeno-associati (AAV) .Pertanto, questi virus sono utili quando infettare una regione del cervello discreta, ma non per l&#39;infezione complessivo associato con AAV utilizzato per l&#39;analisi del comportamento in animali. L&#39;uso di caffeina in questo protocollo aumenta notevolmente il titolo di questi virus, ma non sono ancora alto come i titoli ottenuti in imballaggi AAV. Inoltre, l&#39;integrazione stabile è solo un vantaggio di espressione fluoroforo, come forma CRISPR / Cas9 stabili modifiche genomiche anche quando transientemente trasfettate ed è possibile che in corso espressione del Cas9 e sgRNA possono eventualmente produrre effetti fuori bersaglio. L&#39;espressione transiente del sistema / Cas9 CRISPR con AAV è sufficiente a produrre cambiamenti genomici che si propagano per tutta divisioni cellulari, tuttavia, espressione fluoroforo non venga mantenuta. Creazione di lenbrano e retrovirus che utilizzano il sistema CRISPR / Cas9 impartirà la possibilità di indirizzare qualsiasi nuova gene in un&#39;ampia varietà di organismi. L&#39;efficienza di editing gene sembra essere dipendente dalla sequenza del RNA guida mira la scissione Cas9. È stato determinato empiricamente che tra il 10% e il 80% dei cloni contengono indels dopo sequenziamento infettato cellule Neuro2A. E &#39;attualmente noto se le frequenze INDEL calcolati in cellule Neuro2A sono riflettenti di quelle in neuroni. Guida al software di progettazione RNA come Benchling ora includono un punteggio &quot;on-target&quot;, che può essere in grado di predire l&#39;efficacia di una data sequenza bersaglio. Fino a che punto tali punteggi &quot;a bersaglio&quot; sono bisogni affidabili da determinare empiricamente nei neuroni e altri tipi di cellule, come il sistema di CRISPR-Cas9 diventa più ampiamente attuate. produzione animale transgenico lentivirus-based è stato variamente successo con i rapporti che i transgeni lentivirus-consegnato diventano SIricevitore in presenza 11. CRISPR editing gene mediata del DNA può essere passato attraverso la linea germinale per generare modelli animali interi. Così, stabile l&#39;editing genomico può essere realizzabile, nonostante il silenziamento di fluorofori virali-consegnato e transgeni Cas9. Questo può fornire una piattaforma efficiente per alterazioni genomiche mirati. La consegna virale del sistema / Cas9 CRISPR, pur non richiedendo organismi transgenici, è complementare a quelle tecniche. Ad esempio, l&#39;iniezione di tali particelle virali in un animale transgenico composto che esprime inducibile Cre e Cre opto dipendente o chimico-genetico transgeni dovrebbe facilitare studi complessi sul rapporto tra manipolazioni genetiche e attività neuronale. Un secondo esempio è quello di fornire queste particelle virali Cas9 / sgRNA in un knockout condizionale, nel tentativo di screening per le interazioni gene-gene. Infine, un altro itinerario interessante di questa ricerca è lo screening di fenotipi e composti terapeutici nelle cellule del paziente derivata, che puòessere utilizzato per convalidare e scoprire le reti genetiche che sono interrotti in varie malattie.

Per studiare la base della normale fisiologia e patologia malattia, vi è la necessità di manipolare con precisione l&#39;espressione genica in organismi modello. Per organismi modello mammiferi, questo è in gran parte incentrata sulla creazione e lo sviluppo di topi transgenici in cui un elemento genetico di interesse è affiancato da siti riconosciuti da un ricombinasi. Ciò può risultare in una determinata manipolazione sito di questi geni affiancate. Anche se questa è stata una strategia di successo, è tempo e risorse; per esempio, la creazione di un animale transgenico tripla che esprimesse un gene floxed, Cre ricombinasi, e un gene reporter Cre richiede più accoppiamenti e convalida. Al contrario, l&#39;iniezione stereotassica di replicazione particelle virali difettose codificano una proteina fluorescente e la ricombinasi in un gene animale floxed non necessita genotipizzazione complesse o strategie di selezione 1. Inoltre, se una proteina fluorescente e Cre esprimere virus è co-iniettata con una seconda Enco virusding una proteina fluorescente diversa, allora questo fornisce un controllo all&#39;interno dei tessuti per la manipolazione genetica mirata. Mentre questa strategia richiede ancora l&#39;uso di animali knock-in, strategie di RNA virale basato mediate aggirare la necessità di animali transgenici. Ad esempio, l&#39;iniezione stereotassica di virus replica-carenza che codificano una proteina fluorescente e un RNA breve hairpin (shRNA) può utilizzare macchinari endogena RNAi della cellula comportare una riduzione potenti della trascrizione di un gene di interesse. Tuttavia, le strategie shRNA producono sottile gene knock-down, spesso con conseguente modesti fenotipi cellulari 2. Mentre un knock-down può essere più fisiologicamente rilevanti per la disfunzione del gene eterozigote, la sua diminuzione robustezza rispetto ad un knock-out non è l&#39;ideale per la scoperta di nuovi geni fenotipica. Una terza tecnica che si è recentemente emerso, il CRISPR (cluster regolarmente intervallate Ripetere palindromo Short) / Cas9 (CRISPR-associataproteine ​​9) del sistema, si basa sulla espressione sia un piccolo RNA esogeno e un enzima taglio DNA. Il sistema / Cas9 CRISPR è stato adattato dal sistema immunitario procariote che si è evoluto un metodo per identificare estera, invadendo il DNA di virus e il targeting per la degradazione mediante l&#39;enzima Cas9 3,4. Questa potente tecnica di montaggio del genoma può essere utilizzato per la creazione di eliminazioni mirate, inserimenti, e mutazioni; e il seguente protocollo illustrerà come fare delezioni in un gene di interesse per knockout sua espressione in vivo. L&#39;enzima Cas9 deve essere espresso con un RNA guida omologa alla regione di interesse e contigua con un RNA ponteggio. Knockout di un gene utilizzando questa tecnica richiede mira Cas9 ad una regione specifica del genoma utilizzando RNA guida sintetici (sgRNA), e inducendo rotture a doppio filamento (DSB) in un sito di interesse. Questi DSB sono poi riparati dal macchinario cellulare di riparazione endogena via non omologa end-joining (NHEJ), che leannuncio a indels che possono produrre missenso o nonsense mutazioni e può quindi costituire una perdita di espressione della proteina funzionale 5. Poiché questo sistema produce alterazioni genomiche, richiede solo l&#39;espressione transiente del Cas9 e sgRNA. Tuttavia, è desiderabile che un indicatore fluorescente stabile per identificare le cellule e la loro progenie manipolati in questo modo. Lenti- e retrovirus hanno il vantaggio di stabile integrazione del DNA di interesse nelle cellule ospiti che mantengono l&#39;espressione a lungo termine e si tramandano alle cellule figlie durante la mitosi. Questo protocollo descrive la progettazione e realizzazione di due tipi di replica difettoso, retrovirus alto titolo: il virus dell&#39;immunodeficienza umana derivati ​​particelle lentivirali (lentivirus) e quelli basati su murino virus Maloney leucemia (retrovirus). Mentre entrambi di questi virus sono in grado di supportare esprimere stabile di grandi transgeni, le particelle retrovirali possono integrare solo nel genoma dudivisione cellulare anello con la degradazione della membrana nucleare, e quindi può essere utilizzata come strumento per etichettare e cellule data di nascita 6. Mentre lentivirus hanno la reputazione di essere relativamente basso titolo 7, questa metodologia, compreso l&#39;uso di caffeina durante la raccolta 8 virale, produce abitualmente titoli di 10 9 e 10 10 particelle / ml. Un altro vantaggio di lenti- e retrovirus è la tolleranza per grandi inserti. Il seguente insieme di protocolli delinea la procedura per la progettazione di un lenti o di retrovirus che codifica per un reporter fluorescente, sgRNAs, e Cas9 di utilizzare il sistema / Cas9 CRISPR di modificare il DNA, così come esprimere una proteina fluorescente. Mouse neurochirurgia stereotassica è un metodo valido per l&#39;iniezione di virus in vivo per studiare la morfologia, la funzione e la connettività dei neuroni infetti. L&#39;infezione virale nei neuroni può essere usato per manipolare i livelli di espressione per un periodo prolungato di time, ad esempio durante lo sviluppo, e l&#39;espressione possono essere controllati con precisione mediante l&#39;uso di vari sistemi inducibili farmacologici e espressione specifica guidato Cre. Questo protocollo particolare spiega come iniettare un virus che esprime un sgRNA e Cas9 per knockout un gene di interesse nel cervello di un topo adulto. Topi recuperare molto rapidamente da questa procedura e espressione del transgene virale può essere visto entro 48 ore dopo l&#39;iniezione. Tuttavia, l&#39;espressione fluoroforo sembra aumentare nel corso di settimane conseguenti livelli massimi vicino da 3 settimane dopo l&#39;infezione. I topi che subiscono l&#39;iniezione stereotassica virale possono essere utilizzati per il comportamento, elettrofisiologia, o studi morfologici. Nel complesso, lo scopo di queste procedure è quello di dimostrare come knockout un gene nel cervello di topo adulto con radiochirurgia stereotassica e un virus che esprime un sgRNA specifico e Cas9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="519">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">List of Cell Culture Reagents</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:64px;width:139px;">293FT cell line</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">R700-07</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;">For Lentivirus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">293GP cell line</td>
			<td style="width:93px;">Clontech</td>
			<td style="width:60px;">631458</td>
			<td style="width:228px;">For Retrovirus</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Iscove&#39;s Modification of DMEM (IMDM)</td>
			<td style="width:93px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:60px;">10-016-CV</td>
			<td style="width:228px;">Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and&#160; 1% P/S</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">35-011-CV</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="125" rowspan="2" style="height:126px;width:139px;">MEM Nonessential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Corning</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">25-025-CI</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">L-Glutamine solution, 100X (L-Gln)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">25-005-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Pennicillin/Streptomycin solution, 100X (P/S)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">30-002-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="84" rowspan="2" style="height:84px;width:139px;">Polystyrene 10cm plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">USA Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">CC7682-3394</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Trypsin EDTA 1X</td>
			<td style="width:93px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:60px;"> 
			&#160;25-053-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:60px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:228px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">List of Transfection Reagents</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">5ml polystyrene tubes</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">352054</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:139px;">Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2)</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">C69-500</td>
			<td style="width:228px;">Make a 2.5 M solution in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">S271-3</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">HEPES</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">BP2939-100</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:139px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">S369-500</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:139px;">(Na2HPO4)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="78" rowspan="2" style="height:78px;width:139px;">2X HEPES Buffered Saline (HBS)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;">500ml: 8.2g NaCl, 5.95g HEPES, 0.106g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">filter and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Caffeine</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:60px;">C0750-5G</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">0.22 &#181;M syringe filter unit</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore&#160;</td>
			<td style="width:60px;">SLGV033RS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">0.45 &#181;M syringe filter unit</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore&#160;</td>
			<td style="width:60px;">SLHP033RS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:139px;">60CC L/L Syringe</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">MV60CCLL</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">50 ml Conical Tube</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">352098</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">polyethylene glycol&#160;&#160; 6000 (PEG 6000)</td>
			<td style="width:93px;">Millipore</td>
			<td style="width:60px;">528877</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:139px;">(10X) Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">National Diagnostics</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">CL-253</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">0.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:93px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:60px;">1605-0000</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Matrigel</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">CB-40230A</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">6-well plate</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">353046</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">AC41678-5000</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Donor Horse Serum</td>
			<td style="width:93px;">Cellgro</td>
			<td style="width:60px;">35-030-CV</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:60px;">X100-500ML</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">10ml serological pipette</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">357551</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">anti-GFP, rabbit, 488 conjugate</td>
			<td style="width:93px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:60px;">A21311</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:60px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:228px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">&#160;Stereotaxic Surgery Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:139px;">Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1cc luer slip T.B. 100/bx</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">1CCVLS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">&#160;Isoflurane&#160;</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
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			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">&#160;JOR580S</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">artificial tear ointment</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">RXPARALUBE-O</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">PVP PrepSolution&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">HPIV108208H</td>
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		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">normal saline&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">DYND500MLSH</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">cotton tipped applicators</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">CTA6</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Triple antibiotic ointment&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">RXTRIP-OI15</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">MONOJECT&#174; Needles Soft Pack 25g x 5/8&#34;</td>
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		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">6-0 silk sutures</td>
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			<td style="width:60px;">MV-711</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism's genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.

A seguito del &quot;Protocollo per la progettazione di una guida Strand (sgRNA) per CRISPR / Cas9 Retrovirus&quot;, oligo di targeting una particolare sequenza vengono inseriti nel PXL clonazione vettore valle del promotore hU6 ea valle di un ponteggio guida RNA utilizzando i siti di clonazione BBSI (Figura 1, punto 1). Questo sgRNA viene poi asportato da PXL e inserito nella spina dorsale pRubi utilizzando i siti BstBI e Paci (Figura 1, punto 2). Infine, un&#39;altra sgRNA clonato in PXL può essere posizionato a valle della prima guida in pRubi-Guide1 (Figura 1, fase 3), il targeting un&#39;altra zona del gene e aumentando le possibilità di un knockout via NHEJ. Verifica dei costrutti corretti dovrebbe essere determinata mediante analisi di sequenza. Una volta che questo costrutto è fatto, può essere confezionato in un virus a seguito del &quot;Protocollo per il Retro / lentivirali Produzione- CaPO4 Method&quot;. confezionamento di successo è confermata da infezione da virus in cellule HEK293 per poi titolare la vIRU. Se non vi è alcuna espressione fluoroforo allora è probabile un errore durante il confezionamento del virus. La figura 2 è un risultato rappresentativo di 2 retrovirus, una GFP esprimere e l&#39;altra esprimere mCherry, co-iniettato nel giro dentato topo neonatale (7 giorni di età) e ripreso 21 giorni dopo l&#39;iniezione. Etichettatura di neuroni con mCherry o GFP permette la valutazione morfologica delle varie manipolazioni genetiche in uno stesso tessuto, in cui un virus può esprimere un CRISPR / Cas9 mediata KO e l&#39;altro un virus di controllo, che esprime esclusivamente un fluoroforo. iniezione stereotassica consente precisa selettività anatomica come dimostra l&#39;infezione discreta delle coordinate destinate, giro dentato. Quando si analizzano le sezioni di cervello per l&#39;infezione, è importante mantenere i tessuti circostanti fino a quando non è stato accertato che la regione anatomica corretta è stato infettato. Se non vi è alcun segno di infezione, allora è possibile che l&#39;iniezione avvenuta in una regione di una vicinad può essere identificato nelle sezioni circostanti. Può anche essere utile per individuare il percorso dell&#39;ago per trovare la regione di iniezione esatto. VSVG virus pseudotyped raramente sparsi dei margini del giro dentato quando iniettato in vivo, e tendono a diffondersi lungo le cellule asse infettare rostrali / caudale lungo tutto il giro dentato, come analizzato da ricostruzione 3D (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig1.jpg" /> Figura 1:. Clonazione strategia per il plasmide pRubi-Guide1-Guide2-retrovirale CRISPR Questa strategia è identica per i plasmidi lentivirali FU-based. oligo sgRNA sono ricotto e inseriti in PXL utilizzando i siti di clonazione BSBI. Dopo il sequenziamento per garantire che il sgRNA è inserita con successo in PXL, digerire il plasmide con BstBI e Paci. L&#39;inserto che viene abbandonato (scatola nera) viene poi clonato nel virale posteriore buno (il nero linee tratteggiate) pRubi-Guide1 CRISPR. Una seconda sgRNA può essere inserito anche in PXL e digerito utilizzando l&#39;enzima PACI. Questo viene poi clonato nel vettore CRISPR pRubi-Guide1 (rosse linee tratteggiate) utilizzando il sito PACI. Il plasmide risultante contiene quindi entrambi i filamenti di guida, nonché gli elementi virali necessari, promotori, e fluorofori. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig2.jpg" /> Figura 2:. Iniezione retrovirale del giro dentato del mouse retrovirus che esprimono mCherry (rosso) o GFP (verde) sono stati iniettati nel giro dentato di un mouse p7. 21 giorni dopo, i topi sono stati perfusi e il cervello sezionati e colorati per la GFP e mCherry. (A) Un immagine fluorescente a grande campo 5X mostra la prECISIONE dell&#39;iniezione giro dentato e la specificità di etichettatura dentate neuroni granulari giro. La morfologia dell&#39;ippocampo può essere visto attraverso la (blu) colorazione Dapi. barra della scala misura 200 micron. (B) L&#39;immagine fluorescente 10 volte più grande campo dimostra che questi lentivirus alto titolo infettare un gran numero di cellule la cui morfologia è possibile accedere tramite espressione fluoroforo. barra della scala misura 100 micron. (C) I virus che esprimono GFP o mCherry sono stati co-iniettate in giro dentato. Utilizzando un sistema di retrovirus, si può usare un virus per effettuare una manipolazione genetica segnata da GFP e un&#39;altra manipolazione segnata da mCherry e quindi valutare le variazioni singole o additivi a causa di ogni virus. barra della scala misura 10 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig3.jpg" /> Figura 3:. Diffusione anatomica di iniezione lentivirali coiniezione Stereotassica<html> di un virus GFP-shPten e un virus di controllo mCherry nel cervello di un adulto Pten loxP / + topo ha provocato una diffusione virale lungo tutta la rostrale / asse caudale del giro dentato dell&#39;ippocampo. Questo è mostrato in una ricostruzione 3D della portata di iniezione in cui chiusi contorni della diffusione virale sono stati rintracciati oltre 21 sezioni seriali (Z = 50 um / sezione) utilizzando software di ricostruzione. I tracciati di contorno sono poi stati allineati per generare le immagini 3D per il volume quantificazione. Diffusione virale totale viene visualizzato in verde (volume = 54.730.800 micron 3) e la diffusione dentato-localizzato è mostrato in viola (volume = 27.275.200 micron 3). Il virus si diffonde lungo il percorso dell&#39;ago e il corpo calloso all&#39;intersezione della traccia dell&#39;ago oltre al riempimento all&#39;asse rostrale / caudale del giro dentato. barra della scala misura 200 micron. les / ftp_upload / 53783 / 53783video1frame.jpg &quot;/&gt; Supplemental Video 1. Progettazione di sgRNAs per clonare in backbone retrovirali e lentivirali. In questo esempio di progettazione guida sintetica RNA (sgRNA), la sequenza genomica di CHD8 mouse viene scaricato da NCBI. Il codone di inizio e la struttura esone vengono poi visualizzati in Vector NTI. Questo ci permette di copiare la regione genomica intorno al primo esone codifica ed entriamo in questa sequenza Benchling. Benchling ci permette di visualizzare tutti i potenziali sgRNAs nella regione. Inoltre, dopo che indica la regione genomica che abbiamo in ingresso, Benchling ci mostrerà i punteggi on-target e off-bersaglio per ogni RNA guida. L&#39;utente può quindi selezionare l&#39;RNA guida con i punteggi più alti in bilancio e fuori bersaglio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro del mouse per scaricare).</a>

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Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

Progettazione, Packaging, e consegna di alto titolo CRISPR Retro e lentivirus via Stereotassica iniezione

Il sistema / Cas9 CRISPR offre il potenziale per fare l&#39;editing genoma mirato accessibile e conveniente per la comunità scientifica. Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare come creare virus che sarà ad eliminazione diretta di un gene di interesse utilizzando il sistema / Cas9 CRISPR, e poi iniettare stereotassica nel cervello di topo adulto.

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.5K Views.  Geisel School of Medicine at Dartmouth College.  Il sistema / Cas9 CRISPR offre il potenziale per fare l'editing genoma mirato accessibile e conveniente per la comunità scientifica. Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare come creare virus che sarà ad eliminazione diretta di un gene di interesse utilizzando il sistema / Cas9 CRISPR, e poi iniettare stereotassica nel cervello di topo adulto. 

Video: Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals are not viable in those cases where the modified gene is expressed or deleted in the whole organism. Moreover, a variety of compensatory mechanisms often make it difficult to interpret the results. The compensatory effects can be alleviated by either timing the gene expression or limiting the amount of transfected cells.
The method of postnatal non-ventricular microinjection and in vivo electroporation allows targeted delivery of genes, siRNA or dye molecules directly to a small region of interest in the newborn rodent brain. In contrast to conventional ventricular injection technique, this method allows transfection of non-migratory cell types. Animals transfected by means of the method described here can be used, for example, for two-photon in vivo imaging or in electrophysiological experiments on acute brain slices.

This protocol describes a non-viral method of delivery of genetic constructs to a certain area of living rodent brain. The method consists of plasmid preparation, micropipette fabrication, neonatal rat pup surgery, microinjection of the construct, and in vivo electroporation.

Gene consegna di cervello di ratto post-natale da parte di non-ventricolare iniezione plasmidi e Elettroporazione

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Ricerca

Neuroscienze

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to investigate the effects of locally manipulated neurotransmitter and signaling pathways in awake, behaving animals. Moreover, the stereotaxic implantation of electrodes for electrophysiological stimulation and recording studies has been instrumental to our current understanding of neuroplasticity and brain networks in behaving animals. Ever-increasing knowledge about optimizing surgical techniques in rodents1-4, public awareness concerning animal welfare issues and stringent legislation (e.g., the 2010 European Union Directive on the use of laboratory animals5) prompted us to refine these surgical procedures, particularly with respect to implementing new procedures for oxygen supplementation and the continuous monitoring of blood oxygenation and heart rate levels during the surgery as well as introducing a standardized protocol for post-surgical care. Our observations indicate that these modifications resulted in an increased survival rate and an improvement in the general condition of the animals after surgery (e.g. less weight loss and a more active animal). This video presentation will show the general procedures involved in this type of stereotaxic surgery with special attention to our several modifications. We will illustrate these surgical procedures in rats, but it is also possible to perform this type of surgery in mice or other small laboratory animals by using special adaptors for the stereotaxic apparatus6.

Stereotaxic surgery on rodents allows for targeted administration of drugs or electrical stimulation and recordings in awake, behaving animals. In this video presentation we will demonstrate recent procedural refinements to this long-standing procedure that successfully improved survival rate and reduced post-surgical weight loss.

Chirurgia Stereotassica roditori e animali Miglioramenti Esito di assistenza sociale per Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Ampliamento della embrionali e cellule staminali neurali adulte per<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione o Viral iniezione stereotassica

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Iniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione del gene condizionale nel midollo spinale del mouse

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Designing and Implementing Nervous System Simulations on LEGO Robots

We present a method to use the commercially available LEGO Mindstorms NXT robotics platform to test systems level neuroscience hypotheses. The first step of the method is to develop a nervous system simulation of specific reflexive behaviors of an appropriate model organism; here we use the American Lobster. Exteroceptive reflexes mediated by decussating (crossing) neural connections can explain an animal's taxis towards or away from a stimulus as described by Braitenberg and are particularly well suited for investigation using the NXT platform.1 The nervous system simulation is programmed using LabVIEW software on the LEGO Mindstorms platform. Once the nervous system is tuned properly, behavioral experiments are run on the robot and on the animal under identical environmental conditions. By controlling the sensory milieu experienced by the specimens, differences in behavioral outputs can be observed. These differences may point to specific deficiencies in the nervous system model and serve to inform the iteration of the model for the particular behavior under study. This method allows for the experimental manipulation of electronic nervous systems and serves as a way to explore neuroscience hypotheses specifically regarding the neurophysiological basis of simple innate reflexive behaviors. The LEGO Mindstorms NXT kit provides an affordable and efficient platform on which to test preliminary biomimetic robot control schemes. The approach is also well suited for the high school classroom to serve as the foundation for a hands-on inquiry-based biorobotics curriculum.

An approach to neural network modeling on the LEGO Mindstorms robotics platform is presented. The method provides a simulation tool for invertebrate neuroscience research in both the research lab and the classroom. This technique enables the investigation of biomimetic robot control principles.

Progettazione e implementazione di simulazioni del sistema nervoso su LEGO Robot

We present a method to use the commercially available LEGO Mindstorms NXT robotics platform to test systems level neuroscience hypotheses. The first step ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Infuso stereotassico di Oligomeric amiloide-beta nelle Hippocampus mouse

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

Tecnica mouse Microchirurgia infusione per Targeted Sostanza consegna nel sistema nervoso centrale<i&gt; via</i&gt; Carotide interna

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to the interphotoreceptor/subretinal compartment that has direct exposure to photoreceptors and the retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injections of plasminogen as well as recent preclinical and clinical trials have demonstrated safety and/or efficacy of delivering viral vectors and stem cells to individuals with advanced retinal disease. Mouse models of retinal disease, particularly hereditary retinal dystrophies, are essential for testing these therapies. The most common injection procedure in rodents is to use small transcorneal or transcleral incisions with an anterior approach to the retina. With this approach, the injection needle penetrates the neurosensory retina disrupting the underlying RPE and on insertion can easily nick the lens, causing lens opacification and impairment of noninvasive imaging. Accessing the subretinal space via a transcleral, posterior approach avoids these problems: the needle crosses the sclera approximately 0.5 mm from the optic nerve, without retinal penetration and avoids disrupting the vitreous. Collateral damage is limited to that associated with the focal sclerotomy and the effects of a transient, serous retinal detachment. The simplicity of the method minimizes ocular injury, ensures rapid retinal reattachment and recovery, and has a low failure rate. The minimal damage to the retina and RPE allows for clear assessment of the efficacy and direct effects of the therapeutic agents themselves. This manuscript describes a novel subretinal injection technique that can be used to target viral vectors, pharmacological agents, stem cells or induced pluripotent stem (iPS) cells to the subretinal space in mice with high efficacy, minimal damage, and fast recovery.

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

Un metodo alternativo e validate iniezione per l&#39;accesso ai sottoretinico Spazio<i&gt; via</i&gt; Un approccio Transcleral posteriore

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an approach provides a safe delivery method by-passing the blood brain barrier (BBB), thus allowing treatment with therapeutics with poor BBB-permeability or those for which systemic exposure is not desired, e.g., due to toxicity. CED requires optimization of the catheter design, injection protocol, and properties of the infusate. With this protocol we describe how to perform CED of a solution containing up to 20 &#181;g of an antibody into the caudate putamen of mice. It describes preparation of step catheters, testing them in vitro and performing the CED in mice using a ramping injection program. The protocol can be readily adjusted for other infusion volumes and can be used for injecting various tracers or pharmacologically active or inactive substances, including chemotherapeutics, cytokines, viral particles, and liposomes.

Convection-enhanced delivery (CED) is a method enabling effective delivery of therapeutics into the brain by direct perfusion of large tissue volumes. The procedure requires the use of catheters and an optimized injection procedure. This protocol describes a methodology for CED of an antibody into a mouse brain.

Consegna di anticorpi nel cervello di Murine tramite consegna convezione-migliorato

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...

Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the underlying parenchyma. Previously published protocols recommend using straight needles that should be lowered to a maximum of 1-2 mm from the dural surface. The sudden drop in resistance once the dural membrane has been punctured makes it difficult to maintain the needle in a steady position. Our method, instead, employs a needle bent at the tip that can be stabilized against the occipital bone of the skull, thus preventing the syringe from penetrating into the tissue after perforation of the dural membrane. The procedure is straightforward, reproducible, and does not cause long-lasting discomfort in the operated animals. We describe the intracisternal injection strategy in the context of genetic fate mapping of vascular leptomeningeal cells. The same technique can, furthermore, be utilized to address a wide range of research questions, such as probing the role of leptomeninges in neurodevelopment and the spreading of bacterial meningitis, through genetic ablation of genes putatively implicated in these phenomena. Additionally, the procedure can be combined with an automatized infusion system for a constant delivery and used for tracking cerebrospinal fluid movement via injection of fluorescently labelled molecules.

We describe an intracisternal injection that employs a needle bent at the tip that can be stabilized to the skull, thus eliminating the risk of damage to the underlying parenchyma. The approach can be used for genetic fate mapping and manipulations of leptomeningeal cells and for tracking cerebrospinal fluid movement.

Induzione di cellule leptomeningeali Modifica tramite iniezione intracisternale

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...