Il lavoro per questo progetto è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institutes of Health R01-NR5339 e l&#39;Università Uniformed Servizi del Health Sciences-R061LD.

1. Isolamento e preparazione delle arterie Pial <ol><li> Mentre il topo è anestetizzato e sicuro inserimento di un catetere in un&#39;arteria e profumato con l&#39;1% blu di Evans in PBS 1X. Vasi piale macchia bene con il colorante blu Evans rendendoli più facili da isolare. </li><li> Estrarre il cervello e conservare a -70 ° C fino al momento dell&#39;uso. In modo ottimale, i cervelli devono essere conservati non più di 2 mesi. </li><li> Utilizzando un microscopio da dissezione rimuovere piale arteriole (diametro medio di 35-50 micron) dalla superficie del cervello. Sfilare delicatamente tutti i blu macchiato arteriole da dorsale e laterale la superficie della corteccia con punta fine pinze. Rimuovere l&#39;eccesso di tessuto aderente corticale prima di mettere nel fissativo. </li><li> Fissare le arteriole raccolte nel 2% paraformaldeide freddo in 0,1 M PBS per 30 min. </li><li> Per preparare il arteriole di sezionamento versare mezzo di inclusione sul congelamento disco / mandrino (fissato a -20 ° C). </li><li> Luogo sezione arteriola piatta sul mandrino uno° attendere che congelare. Saldamente posto la nave in alto a destra sul disco criostato congelamento su mezzi di inclusione con la punta dell&#39;arteria rivolto verso l&#39;alto. Tenerlo con una pinzetta fino a quando non è solidamente congelato. </li><li> Inserire il disco di congelamento con la nave nella testa criostato e tagliare 8 anelli arteriola piale micron con il criostato. </li><li> Montare le sezioni sui vetrini arteriola subbed cromo-potassio gelatina. </li><li> Memorizzare le slide preparate in una scatola di far scorrere in frigorifero a 4 ° C durante la notte. </li></ol> 2. ER-α colorazione immunofluorescenza Giorno 1 <ol><li> Rimuovere le diapositive dal frigorifero; portare ciascuno a temperatura ambiente. </li><li> Per lavare le diapositive versare 1-1,5 ml 0,1 M PBS (sufficiente a coprire tutte le sezioni) lasciate riposare per 10 minuti, scolarle e ripetere la procedura altre due volte. Ogni bordo del vetrino è un marker idrofobo. Di conseguenza, il liquido rimane sulla superficie del vetrino. Ad ogni lavaggio il liquido viene versatoe sostituiti con prodotti freschi 0,1 M PBS. </li><li> Incubare i vetrini in 1 ml di cloruro di ammonio 50mM per 30 minuti a temperatura ambiente per ridurre la fluorescenza endogena. </li><li> Lavare i vetrini in PBS 0,1 M 3x10 min. come descritto al punto 2.2 </li><li> Diapositive in blocco 0,1% Triton-X 100 più 1% di siero normale di capra (NGS) in PBS per 30 min. per ridurre legame non specifico. </li><li> Incubare i campioni con l&#39;anticorpo primario (coniglio policlonale anti-ER-α, 1:500) in PBS + 0,1% Triton-X + NGS 1% durante la notte a 4 ° C. </li></ol> Giorno 2 <ol start="7"><li> Rimuovere le diapositive dal frigorifero; portare ciascuno a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini in PBS 0,1 M 3x10 min. come descritto al punto 2.2 </li><li> Incubare con verde Oregon 488 secondari anti-coniglio in 1% NGS +0,1% Triton-X100 + PBS per 2 ore al buio a temperatura ambiente. Da questo passo, i prossimi passi deve essere fatto al buio. </li><li> Lavare i vetrini in PBS 0,1 M 3x10 min. come descritto al punto 2.2 </li><li> Sotto una ventilated cappuccio, metti 1 goccia di 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e mezzi di montaggio a bordo delle navi e poi mettere un vetrino sopra il campione. </li><li> Applicare smalto trasparente lucido per sigillare i bordi del vetrino. Non spostare le diapositive fino a completa asciugatura, che dura circa 24 ore. </li></ol> 3. Digital Imaging di fluorescenza <ol><li> Per l&#39;imaging ER-α nel vaso piale fetta si usa una Nikon Eclipse 80i digitale microscopio a fluorescenza con filtri per 3 colori (blu, verde e rosso), dotato di una fotocamera digitale. </li><li> Inserire le diapositive preparate con i segmenti colorati nave piale sotto il microscopio e regolare di visualizzare le aree fluorescente di interesse. Inizio con ingrandimento x100 poi aumentare fino a x600 ingrandimenti. </li><li> Utilizzare la fotocamera per catturare immagini in DAPI (blu) e FITC (verde) canali per nuclei cellulari (DAPI) e ER-α (Oregon verde) utilizzando il software Nikon estesa profondità di messa a fuoco per convertire visualizzare piùs su segmenti di flotta in 2-D immagini. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Abbiamo localizzato il recettore degli estrogeni α in piale vasi arteriosi utilizzando sonde fluorescenti e ottimizzato la nostra visualizzazione del recettore digitale utilizzando la microscopia a fluorescenza. Per rilevare la presenza del recettore, un coniglio anticorpo policlonale primario e di un verde Oregon 488 anticorpo marcato secondario è stato utilizzato per immagine i recettori nelle arterie piale isolato dalla superficie del cervello. Inoltre, un nucleare macchia (DAPI) è stato utilizzato per identificare i nuclei delle cellule e determinare se si potesse rilevare recettori situati nel nucleo dal ER-α è stato segnalato per essere presenti nel cyotosol cellulare e il nucleo. Inoltre, abbiamo condotto esperimenti di conferma per convalidare la specificità dell&#39;anticorpo primario e per verificare vincolante del secondario per l&#39;anticorpo primario. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig1.jpg" alt="Figura 1"/><br/&gt; Figura 1. Colorazione di immunofluorescenza per ER-α (verde) e controcolorazione con DAPI (blu) in un anello arteria piale isolato dal cervello di ratto femmina. Fig. 1A mostra le immagini fuse suggerendo la presenza di alcuni estrogeni intranucleari recettore-a (freccia). Fig. 1B e 1C sono l&#39;immagine focalizzata di ER-α che è una combinazione di Z-stack immagini. Le immagini sono state prese a x600 ingrandimenti e sono l&#39;anello dal taglio delle stessa nave su piani diversi. Le frecce indicano il recettore degli estrogeni α. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Colorazione immunofluorescenza per gruppi di controllo in un anello arteria piale isolato dal cervello di ratto femmina. Fig. 2D mostra la nave senza anticorpo primario. 2E figura mostra la nave senza l&#39;anticorpo secondario (autofluorescenza nota distinta lungo il lato endoteliale). Le immagini sono state prese a x600 ingrandimenti e sono l&#39;anello dal taglio della stessa nave nel different aerei.

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	<li>Smiley, D. A., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+compounds,+estrogen+receptors+and+vascular+cell+signaling+in+the+aging+blood+vessels.">Estrogen compounds, estrogen receptors and vascular cell signaling in the aging blood vessels.</a> Curr. Med. Chem. 16, 1863-1887 (2009).</li><li>Miller, V. M., Duckles, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+actions+of+estrogens:+functional+implications.">Vascular actions of estrogens: functional implications.</a> Pharmacol. Rev. 60, 210-241 (2008).</li><li>Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrovascular+effects+of+oestrogen:+multiplicity+of+action.">Cerebrovascular effects of oestrogen: multiplicity of action.</a> Clin. Exp. Parmacol. Physiol. 34, 801-808 (2007).</li><li>Stirone, C., Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+estrogen+receptor-a+incerebral+blood+vessels:+regulation+by+estrogen.">Multiple forms of estrogen receptor-a incerebral blood vessels: regulation by estrogen.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E184-E192 (2003).</li><li>Dan, P., Cheung, J. C., Scriven, D. R., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope-dependent+localization+of+estrogen+receptor-alpha,+but+not+-beta,+in+en+face+arterial+endothelium.">Epitope-dependent localization of estrogen receptor-alpha, but not -beta, in en face arterial endothelium.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 1295-1306 (2003).</li><li>Fritschy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+my+antibody+staining+specific?+How+to+deal+with+pitfalls+of+immunohistochemistry.">Is my antibody staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry.</a> Eur. J. Neurosci. 28, 2365-2370 (2008).</li><li>Watanabe, Y., Littleton-Kearney, M. T., Traystman, R. J., Hurn, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+restores+post-ischemic+pial+and+microvascular+dilation.">Estrogen restores post-ischemic pial and microvascular dilation.</a> Am. J. Physiol. Heart and Circ. 281, H155-H160 (2001).</li><li>Li, M., Zeynalov, E., Li, X., Miyazaki, C., Koehler, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+estrogen+on+postischemic+pial+artery+reactivity+to+ADP.">Effects of estrogen on postischemic pial artery reactivity to ADP.</a> Microcirculation. 16, 403-413 (2009).</li><li>Qin, X. Y., Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+restores+postischemic+sensitivity+to+thromboxane+mimetic+U46619+in+rat+pial+artery.">Estrogen restores postischemic sensitivity to thromboxane mimetic U46619 in rat pial artery.</a> Cereb. Blood. Flow. Metab. 25, 1041-1046 (2005).</li><li>Miyazaki, C., Koelher, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+HET0016+and+estrogen+on+pial+artery+vasodilatory+capacity.">Effects of HET0016 and estrogen on pial artery vasodilatory capacity.</a> FASEBJ Abstracts. , (2007).</li><li>Daneshtalab, N., Dore, J. J. E., Smeda, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection:+procedures+in+immunohistochemical+studies.">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: procedures in immunohistochemical studies.</a> J. Pharmacol. Toxical. Methods. 61, 127-135 (2010).</li><li>Lorincz, A., Nusser, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+immunoreactants.">Specificity of immunoreactants.</a> J. Neurosci. 28, 9083-9086 (2008).</li></ol>

Le opinioni espresse sono quelle degli autori e non riflettono la politica ufficiale o la posizione dell &#39;Università Uniformed Servizi di Scienze della Salute, il Dipartimento della Difesa, o il governo degli Stati Uniti.

In precedenza, abbiamo dimostrato che dopo la lesione transitoria globale cerebrale ischemico dell&#39;arteria piale la capacità di cambiare diametro in risposta ad entrambi vasodilatatori 7, 8 e 9 è vasocostrittori marcatamente depressa nei giovani ratti ovariectomizzati. Replezione estrogeni cronica ripristina risposte vasomotorie 7-9. Inoltre, la sostituzione degli estrogeni ritardato inverte gli effetti benefici degli estrogeni sulla capacità di vasodilatazione delle arterie piale 10 che ci porta a chiedersi se a lungo termine l&#39;esaurimento degli estrogeni colpisce ER-α densità nel cerebrovasculature. Abbiamo pianificato di utilizzare l&#39;etichettatura immunofluorescenza combinata con western blotting per valutare le variazioni ER-α espressione in risposta a esaurimento estrogeni cronica. Perché abbiamo avuto qualche difficoltà nella visualizzazione di gruppi distinti di recettori abbiamo modificato il metodo che noi dimostriamo qui. Pertanto, il nostro obiettivo primario in questo studio era quello di sviluppare prima un metodo relativamente semplice per ottimizzare la visualezazione dei recettori nelle arteriole piale. In accordo con diversi rapporti 6,11,12 abbiamo ritenuto necessario per effettuare le regolazioni per il tipo di tessuto siamo stati sondaggio, lo spessore del campione, la distribuzione di ER-α nel serbatoio, così come il grado di legame non specifico . Il nostro metodo è molto efficace per visualizzare la presenza di ER-α a fette nave piale. Ma, come altri hanno già sottolineato il successo nell&#39;uso di questi metodi è altamente dipendente dalla specificità e le concentrazioni degli anticorpi, la posizione subcellulare delle proteine ​​di interesse, fissazione e protocolli di blocco e la manipolazione dei tessuti 12. Prima di visualizzazione dei nostri preparativi nave abbiamo trascorso il tempo di elaborare tutte queste variabili. Abbiamo evidenziato come abbiamo bisogno di regolare alcuni del nostro approccio in questo documento. Abbiamo deciso di visualizzare in modo ottimale ER-α nelle arteriole piale e questo ha presentato alcune sfide.In primo luogo, la dimensione media di un&#39;arteria ratto piale è compresa tra 35-50 micron rendendo l&#39;isolamento e la rimozione dalla superficie del cervello un po &#39;difficile. Abbiamo scoperto che la perfusione con Evans colorante blu prima del sacrificio rende dissezione delle arterie più facile. Blu di Evan possono influenzare la fluorescenza, ma riteniamo che il vantaggio di utilizzare questo colorante superano gli svantaggi minori. Nel nostro protocollo i vasi vengono lavati più volte. Questo riduce al minimo il colorante residuo nei vasi e riduce i possibili effetti del colorante sulla fluorescenza. Un&#39;altra difficoltà che abbiamo incontrato era che lo spessore dei segmenti nave piale reso chiara visualizzazione dei recettori difficile. Inoltre, non siamo riusciti a ottenere immagini particolarmente chiare, probabilmente dovuto al fatto che la ER-α era sparso per tutta strati di cellule diverse. Abbiamo provato a lavorare con fette vaso longitudinale (come altri hanno), ma a causa delle piccole dimensioni piale era difficile da gestire e prevenire i vasi torsione dei vasi durante il montaggiosu diapositive anche utilizzando un microscopio. Infine, siamo riusciti a modificare la nostra tecnica utilizzando un criostato e il taglio della nave trasversale in 8 anelli di micron di spessore. Gli anelli sono più facili da gestire e diverse possono essere montate su una diapositiva. Una volta che abbiamo acquisito i vasi abbiamo sentito la necessità di testare l&#39;efficacia del primo flash congelamento del tessuto poi fissa i vasi come suggerito da Danseshatalb e collaboratori 11. Anche se abbiamo trovato immunofluorescenza sfondo leggermente meno, abbiamo anche notato che i recettori colorati meno intensamente rendendo la visualizzazione dei recettori più difficile. Di conseguenza, preferiamo prima di congelare l&#39;intero cervello e immagazzinare fino al momento (generalmente compresa tra 1-2 mesi). Abbiamo poi tirare fuori i vasi, come descritto e fissare i vasi prima di affettare con il criostato. come abbiamo dimostrato qui. Un passo necessario è quello di eseguire i controlli sia con il primario e l&#39;anticorpo secondario separatamenteper determinare la specificità e l&#39;immunofluorescenza sfondo. Recettore α-anticorpi possono essere difficili da lavorare. In effetti, abbiamo provato tre diversi anticorpi primari (1 e 2 monoclonale policlonali) prima eravamo soddisfatti del successo della nostra colorazione recettore. Come parte dei nostri controlli abbiamo prima verificato la specificità dell&#39;anticorpo primario per omissione l&#39;aggiunta dell&#39;anticorpo primario. La figura 2D mostra la nave senza anticorpo primario. Non ci sono macchie e solo un segnale po &#39;di storia. Dal momento che l&#39;anticorpo primario è policlonale, vi è una certa diffusa non specifica colorazione di fondo. In secondo luogo, abbiamo aggiunto l&#39;anticorpo primario, ma non l&#39;anticorpo secondario (Fig. 2E). Si può vedere un bel margine che rappresenta il autofluoresence lungo i confini endoteliale dei vasi. Ciò è coerente con il lavoro di Dan e collaboratori 5. Tuttavia, né i piccoli punti di immunofluorescenza che rappresentano ER-α, né l&#39;arbitro aspetto granularenando la presenza di numerosi recettori possono essere rilevati senza la combinazione di entrambi gli anticorpi primari e secondari. Abbiamo notato un modello distinto di autofluoresence lungo i margini endoteliale dei vasi. Questi test indipendente per la specificità degli anticorpi sono importanti in quanto confermano la specificità dell&#39;anticorpo per ER-α e l&#39;anticorpo secondario si lega al primario. In conclusione, come dimostrato da altri 4, 5 vasi sanguigni del cervello contengono numerosi ER-α sottotipo di recettori. Nelle nostre mani, preparare 8μm fette trasversale da isolate arterie piale migliora colorazione e la visualizzazione dei recettori. I metodi tradizionali l&#39;uso di microscopia confocale per esaminare i campioni. Avere la capacità di visualizzare seriale sezioni ottiche da campioni di spessore è un vantaggio importante della microscopia confocale. Tuttavia, l&#39;acquisto di un buon microscopio confocale può essere molto costoso. Utilizzando estesa Profondità (FES) del software, abbiamo trovato chepotrebbero ridurre i nostri costi attrezzature. Utilizzando un microscopio a fluorescenza con EDF abbiamo ottenuto immagini chiare e sono in grado di visualizzare piale arteriosa ER-α su più livelli con Z-stack. Un vantaggio significativo del software EDF è che permette la cattura delle immagini in un modo efficace per creare un 3-D immagine dalle immagini. Per i laboratori che non hanno accesso a un microscopio confocale o i fondi per acquistare un microscopio digitale a fluorescenza con il software appropriato può essere una soluzione pratica e meno costoso a seconda degli obiettivi del ricercatore.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> EVANS BLU </td><td> Sigma </td><td> E-2129 </td></tr><tr><td> PBS 10X </td><td> Sigma </td><td> P-5493 </td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Fisher Scientific </td><td> T353 </td></tr><tr><td> Tissue-Tek ottobre Compound </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> Cloruro di ammonio </td><td> Sigma </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td></tr><tr><td> Siero di capra normale </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td></tr><tr><td> ER-α anticorpo policlonale di coniglio </td><td> Santa Cruz </td><td> H-184 </td></tr><tr><td> Oregon verde 488 capra anti IgG di coniglio </td><td> Invitrogen </td><td> O-11038 </td></tr><tr><td> Vectashield montaggiomedio per fluorescenza con DAPI </td><td> Vector Lab </td><td> H-1200 </td></tr></tbody></table>

imaging of estrogen receptor-&alpha; in rat pial arterioles using a digital immunofluorescent microscope

Molti degli effetti degli estrogeni sulla reattività vascolare sono mediati attraverso l&#39;interazione con i recettori degli estrogeni 1, 2, 3. Anche se due sotto-tipi esistenti (recettore-α e β), il recettore degli estrogeni α è stato identificato sia nella muscolatura liscia e nelle cellule endoteliali dei piale segmenti arteriosi con colorazione fluorescente in combinazione con la microscopia confocale a scansione laser 4. Inoltre, ER-α si trova nel nucleo e nel citoplasma delle arterie basilare ratto 5. I recettori sono abbondanti e reagiscono brillantemente, ma chiara visualizzazione di gruppi distinti di recettori è difficile, probabilmente a causa del numero situato in molti strati di cellule di segmenti di flotta piale. Inoltre, molte relazioni con tecniche di immunoistochimica in coppia con microscopia confocale mal dettaglio i requisiti fondamentali per la riproduzione di esperimenti 6. Il nostro scopo per questo articolo è quello di descrivere una tecnica semplice per ottimizzare le tha colorazione e la visualizzazione di ER-α utilizzando sezioni trasversali delle arteriole piale ottenere dal cervello dei topi femmina. Per prima cosa profumato ratti con il blu di Evans colorante per identificare con facilità le arterie superficie piale che isoliamo sotto un microscopio da dissezione. L&#39;utilizzo di un criostato per tagliare 8 sezioni trasversali micron delle arterie ci permette di ottenere sezioni sottili nave in modo che gli aerei nave differenti sono visualizzati in modo più chiaro. Tagliando la nave piuttosto che l&#39;uso di un segmento piccolo vaso ha il vantaggio di facilitare la visualizzazione degli strati muscolari endoteliali e liscia. Inoltre, l&#39;uso di un microscopio digitale immunofluorescenza con il software di profondità estesa produce immagini chiare di 10-12 aerei nave diversa ed è meno costosa rispetto all&#39;uso di un microscopio confocale a scansione laser.

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Imaging of Estrogen Receptor-&#945; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

L&#39;obiettivo di questo articolo è quello di dimostrare un metodo per ottimizzare la rilevazione immunofluorescenza del recettore degli estrogeni-α (ERα) nel ratto fette piale arteriosa utilizzando un microscopio digitale immunofluorescenza.

Imaging del recettore dell&#39;estrogeno α in Rat Arteriole Pial utilizzando un microscopio digitale immunofluorescenza

Many of estrogen's effects on vascular reactivity are mediated through interaction with estrogen receptors 1, 2, 3. Although two sub-types exist (estrogen ...

imaging-estrogen-receptor-rat-pial-arterioles-using-digital

Research

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Biology

Imaging of Estrogen Receptor-&alpha; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

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Video: Imaging of Estrogen Receptor-α in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

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Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

La quantificazione di espressione della proteina e co-localizzazione Usando multiplex immunoistochimica di colorazione e multispettrale Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

Implementazione di un sistema coerente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) su un Ti: zaffiro e OPO laser basata su standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

Visualizzazione e la quantificazione dello strato acellulare nelle arteriole del muscolo Cremaster Rat

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Un rapido protocollo automatizzato per Fibra muscolare Analisi Popolazione nel ratto muscolari sezioni trasversali utilizzando una catena pesante della miosina immunoistochimica

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

Micron-scala Phenotyping tecniche di mais fasci vascolari basato su x-Ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Imaging del recettore dell'estrogeno α in Rat Arteriole Pial utilizzando un microscopio digitale immunofluorescenza

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