Interno fondi istituzionali e le scienze biologiche Programma studiosi della University of Michigan sostenuto questo lavoro.

Worm Preparazione <ol><li> Trasferimento L4 vermi larve di piatti appropriato 18-24 ore prima di imaging 22. Questo vi assicurerà uovo portante adulti per un ampia offerta di embrioni ai primi stadi. </li><li> Preparare i tubi di vaselina e agarosio. Prepariamo vari tubi falcon da 15 ml di fusione vaselina in un bicchiere nel forno a microonde e la distribuzione in aliquote 4-5 ml per provetta. Allo stesso modo si fondono 2-3% (w / v) in soluzione di agarosio (M9 o Egg Buffer) e un&#39;aliquota 4-5 mL in tubi falco. Fare attenzione a non far bollire per eccesso al fine di ridurre al minimo l&#39;evaporazione. Il giorno di imaging, si fondono 1 tubetto di vaselina in A ° 65-70 calore blocco C e sciogliere 1 tubo di agarosio nel forno a microonde, di nuovo fare attenzione a minimizzare bollente. Conservare le provette nel blocco di calore per mantenere la vaselina e la agarosio allo stato fuso. </li><li> Fai Agarose pad. Posizionare una nuova diapositiva microscopia tra 2 scivoli guida, che sono scivoli coperti da un singolo strato di nastro di laboratorio comune aderito alla parte superiore e inferiore di ciascuna unità di guida. Utilizzare una pipetta Pasteur con la fine rotto di mettere 2-3 gocce di fuso agarosio sulla nuova diapositiva. Coprire con un perpendicolare 2 ° diapositiva alla diapositiva originale, in modo da coprire e aiuta a diffondere la agarosio per creare un rilievo sottile quadrato. Il 2 ° scivolo deve poggiare sopra il nastro nelle diapositive guida. La concentrazione di agarosio può essere aumentato al 5% per più spessi cuscinetti. </li><li> Utilizzando un ambito sezionare e un filo di platino &quot;pick&quot;, il trasferimento di due vermi adulti a 9-12μL goccia di tampone M9 o uovo su un mm 18 x 18 coprioggetto mm. </li><li> Tagliare worm apre con un ago (usiamo 27G1 / 2 aghi) o bisturi per liberare gli embrioni. Provate a tagliare a metà del worm. </li><li> Inferiore agarosio pad (con il lato agar verso il basso) sul coprioggetto 18x18 millimetri contenente gli embrioni. Agar Trim si estende dal bordo del vetrino con una lametta. </li><li> Coverslip sigillo utilizzando un pennello o sottile bastone di legno per applicare la vaselina fuso per tutti e quattro i bordi del coprioggetto. </li></ol> Alternative ai monti agar sono appesi gocce 23 se gli embrioni sono sensibili alla pressione (cioè se il guscio dell&#39;uovo non si forma correttamente). L&#39;imaging può essere eseguita anche in utero di seguire la fecondazione o eventi precoci come meiosi. Worms dovrebbe essere anestetizzato con Levamisolo 24. Al fine di aumentare il numero di embrioni da un particolare stadio di sviluppo, diversi worm può essere dissezionato in una sola volta e gli embrioni posizionato insieme delicatamente con un raffinato puntale o un pennello ciglia o pipette a bocca. 4D Nomarski DIC (Differential Interference Contrast) Video <ol start="8"><li> Accendere il microscopio Olympus BX61. Perché la fotocamera è sensibile alle onde EM emesse da altri dispositivi è acceso per ultimo, il bulbo di mercurio (se necessario per GFP o fluorescenza) per primo. Avviare Micro-Manager una volta che tutto è in funzione. Scegliere il file di configurazione appropriato per l&#39;imaging DIC o fluorescenti. La differenza principale è che il file DIC non include il controllo di otturatore fluorescenti. Ogni file seleziona anche il cubo appropriato filtro e del guadagno della telecamera. </li><li> Trova embrioni sul microscopio con obiettivo 10x. Guarda nelle vicinanze di corpi senza fine per i gruppi di giovani embrioni al fine di ottenere più embrioni nel campo dell&#39;imaging. Evitare di embrioni all&#39;interno del worm per i migliori immagini. </li><li> Utilizzando l&#39;interruttore software per un ingrandimento superiore (40x a 100x) e risoluzione (NA 0,9-1,4) obiettivo per l&#39;imaging. </li><li> Regolare Nomarski Ottica DIC (I seguenti siti web contengono spiegazione utile di ottica DIC e la terminologia; <a href="http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html">http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html</a> http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html) <ol class="lalpha"><li> Sul nostro Olympus BX61 i componenti importanti sono: <ol><li> Polarizzatore - cursore sotto il condensatore </li><li> Prism condensatore Wollaston - torretta sul condensatore, proprio sotto il palco. </li><li> Obiettivo prisma Wollaston - cursore sotto i cubi filtro </li><li> 2 ° polarizzatore (Analyzer) - cubo filtro nella posizione DIC </li></ol></li><li> Passa Cubo Filtro per DIC per posizionare il Analyzer (2 polarizzatore nd) nel percorso della luce (programma dovrebbe fare questo in fase di start up). </li><li> Assicurarsi che i due polarizzatori sono allineati correttamente (incrociate). Quando entrambi i prismi di Wollaston sono fuori dal percorso della luce del campo di vista dovrebbe essere buio. Se necessario, ruotare il polarizzatore sotto il condensatore fino a quando questo è corretto. </li><li> Inserire il (superiore) Prisma obiettivo Wollaston nel percorso della luce. </li><li> Ruotare la torretta sul condensatore per selezionare il prisma Wollaston che corrisponde l&#39;obiettivo si sta utilizzando. </li><li> Regolare il cursore di sotto di questa torretta per abbinare NA della lente. </li><li> Attenzione che il condensatore sia ottimale illuminazione Koehler. </li><li> Regolare il superiore Wollaston Prism per ottenere un contrasto ottimale ruotando la manopola sul cursore. </li><li> Altre impostazioni di avvio controllato da software includono guadagno della telecamera (impostato a 0) e passare al salvataggio dei file come 8-bit non 16-bit dei file tiff. </li></ol></li><li> Regolare il livello di luce per dare un&#39;immagine piacevole. (Di solito usano 4,7 Volt) (controllato via software). Noi preferiamo per illuminare il campione in modo che i pixel più luminosi sono appena al di sotto dei livelli di saturazione. Buoni risultati DIC ottica in un&#39;immagine con un 3-dimensionale guardare dove i granuli di tuorlo nell&#39;embrione si distinguono chiaramente. In alternativa può essere descritto come se la luce che illumina il campione sembra brillare da un angolo in modo che una parte del campione (o caratteristiche del campione) è acceso vivaci e il lato opposto è in ombra e appare più scura. </li><li> Seleziona regione di interesse (ROI) per includere gli embrioni si vuole l&#39;immagine, fare clic sul pulsante di ROI per ridurre la finestra. </li><li> Aprire il multi-dimensionale finestra di acquisizione. Seleziona Z-stack (fette) e punti di Tempo. </li><li> Usa manopola di focus microscopio per trovare il fondo dell&#39;embrione (ultimo piano focale con alcuni granuli di tuorlo a fuoco). Clicca in basso su Seleziona. Ripetere l&#39;operazione per identificare e impostare la parte superiore dell &#39;embrione. Noi di solito uso 1 passo micron e finisce con circa 20 piani focali. In genere raccogliere molteplici piani focali ad ogni punto di tempo, perché gli embrioni e le cellule sono relativamente spesso. Inoltre soprattutto quando le cellule cominciano a dividersi in diversi orientamenti che possono spostare le altre cellule nell&#39;embrione intorno movimento dentro o fuori del piano focale originale. Se il microscopio non ha un motore a fuoco è possibile regolare manualmente la messa a fuoco di seguire il cellulare o il processo si è interessati. </li><li> Indicare il numero di punti di tempo e l&#39;intervallo di tempo necessario. Noi di solito utilizzare intervallo di 15 secondi e impostare un max di 500 punti del tempo. Si comincia con gli intervalli di tempo più di quanto abbiamo bisogno e fermare l&#39;acquisizione quando desiderato. Se siete di imaging più piani focali, assicurarsi che ci sia abbastanza tempo per acquisire tutti i piani focali nell&#39;intervallo di tempo tra i punti. </li><li> Selezionare o creare un percorso per salvare i dati. Assicurarsi che il software sia impostato per visualizzare solo l&#39;ultima immagine. Dare un nome al file e fare clic su Acquisisci. Monitorare l&#39;acquisizione automatica delle immagini per i primi punti poco tempo per assicurarsi che funzioni correttamente. </li><li> Clicca fermare quando si desidera interrompere l&#39;acquisizione, passare a obiettivo 10x e preparare diapositiva successiva. </li><li> Una volta fatto l&#39;imaging rimuovere i componenti DIC dal percorso della luce. Olio pulito fuori obiettivo, se necessario. Spegnere tutto a partire con la fotocamera. </li></ol> GFP Film <ol start="20"><li> Avviare microscopio e trovare gli embrioni come sopra. Utilizzare file di configurazione che include software di controllo di otturatore fluorescenti. </li><li> Assicurarsi che il prisma superiore DIC (slider) non si trova nel percorso della luce. </li><li> Passa Cubo filtro per FITC / GFP (impostata automaticamente all&#39;avvio) </li><li> Variazione del guadagno telecamera a 255 e file di immagine TIFF a 16 bit (impostato automaticamente all&#39;avvio con questo file di configurazione). </li><li> Spegnere la luce bianca. </li><li> Fare clic su Live Imaging a immagine di anteprima. Lavorare velocemente per ridurre al minimo l&#39;esposizione alla luce. In alternativa utilizzare immagini Snap per raccogliere singola immagine. </li><li> La regolazione della potenza della lampadina Mercury / filtri a densità neutra, tempo di esposizione per ottenere una buona immagine. In generale, si consiglia di utilizzare la luce minima di raggiungere il campione di acquisire i dati che si desidera ridurre fotodanneggiamento alla cella e photobleaching dei segnali di fluorescenza. </li><li> Impostare l&#39;intervallo di tempo, il numero di punti di tempo e numero di piani focali. Spesso usiamo gli intervalli di 50-10 secondi e 1-3 piano focale. </li><li> Seleziona il ROI e impostare i parametri per l&#39;acquisizione dell&#39;immagine come descritto in precedenza in Piazza di 13-19. </li></ol> Film analisi <ol start="29"><li> I dati verranno salvati nella cartella con il nome inserito e contengono una serie di file tiff per ogni immagine della pila 4D, un file di testo e un file XML contenente i metadati quali i livelli di esposizione e intervalli di tempo. </li><li> Le immagini TIFF possono essere aperti da ImageJ attraverso due metodi. Il primo (metodo a) è il più semplice e anche leggere i metadati di ogni file. Il secondo (metodo b) è in grado di utilizzare la memoria virtuale per aprire i file che sono più grandi rispetto alla quantità di memoria allocata per ImageJ, ma non include i metadati. <ol class="lalpha"><li> Utilizzando Micro-Plugin Manager <ol><li> Micro-Manager è costruito su e usa ImageJ (si installa una nuova versione di ImageJ, che sarà diverso da qualsiasi altra versione che potrebbe essere installato in precedenza) e include un plugin per aprire i dati. In alternativa è possibile copiare il contenuto della cartella Micro-Manager-1.3/plugins nella cartella plugins di un&#39;altra versione di ImageJ. </li><li> Vai al menu Plugin, selezionare Micro-Manager e quindi Aprire Micro-File Manager. </li><li> Selezionare la cartella contenente i dati che si desidera visualizzare e fare clic su OK. </li><li> Gioca attraverso le dimensioni Z e T. </li></ol></li><li> Utilizzando LOCI plugin per aprire i filmati con Importatore BioFormats. <ol><li> Trasferire i file xml e txt dalla cartella contenente i file tiff e rinominare i due file che corrisponda al nome del set di dati. </li><li> All&#39;interno di ImageJ, andare al Plugin menu a tendina, selezionare LOCI e poi o Browser dati o Bio-Formati Importatore. </li><li> Trovare la cartella con il tuo stack tiff. Fare clic sul primo file tiff, quindi aprire. </li><li> Visualizza stack con HyperStack. Sotto l&#39;organizzazione del set di dati: selezionare i file di gruppo con dimensioni Swap nomi simili, e aperto tutte le serie. Sotto la gestione della memoria: Seleziona: Usa stack virtuale (in particolare per grandi insiemi di dati). Fare clic su OK </li><li> Il plugin determinare le dimensioni del set di dati (numero di punti di tempo e di piani focali) e visualizzare l&#39;intervallo tra una serie di &lt;&gt; parentesi. Fare clic su OK o alterare il numero dei punti di tempo e / o piani focali per aprire. </li><li> Confermare quale dimensione corrisponde a ciascuna serie. </li><li> Gioca attraverso le dimensioni Z e T. </li></ol></li></ol></li></ol> Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Stills Figura 1. Da un filmato che illustra Nomarski DIC normale eventi cellulari nei primi mesi del C. elegans sviluppo embrionale: la migrazione pronucleo (0-5:45), prima divisione asimmetrica (6:45-14:45) e asincroni seconda divisione (14:45-27:00). I dati sono stati raccolti con una lente 60x 1,35 NA. 20 piani focali ad intervalli di 1 micron, sono stati raccolti ogni 15 secondi con 40 ms di esposizione. Le immagini sono state ruotate in modo che posteriore è a destra e ventrale è in basso. Bar scala rappresentano il 10 micron. <img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Stills da un film fluorescente che illustra i movimenti dinamici di una GFP-etichettata subunità del complesso passeggeri cromosoma (AIR-2) presenti sui cromosomi di metafase anafase a presto (dalla A alla C) prima di apparire sul midzone mandrino fino in anafase citocinesi completa (C a F). I dati sono stati raccolti con una lente 60x 1,35 NA. Un unico piano focale sono stati raccolti ogni 10 secondi con 50 l&#39;esposizione msec. Le immagini sono state ruotate in modo che posteriore è a destra. Bar scala rappresentano il 10 micron. Movie 1 Movie Nomarski di Wild-Type Embryo. Film corrispondente alla figura 1. Posteriore è in fondo a destra e ventrale è in basso a sinistra. Mostra un unico piano focale di dati originale. Immagine è stato raccolto ogni 15 secondi e riprodurre è fissato a 14 fotogrammi al secondo. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2625/Movie1.mp4">Clicca qui per vedere video</a> Movie 2 Film fluorescente di Wild-Type embrione che esprimono GFP:: AIR-2. Film corrispondente alla Figura 2. Posteriore è in alto a destra. Film è stato raccolto come un unico piano focale. Immagine è stato raccolto ogni 10 secondi e riprodurre è fissato a 14 fotogrammi al secondo. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2625/Movie2.mp4">Clicca qui per vedere video</a>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Una considerazione importante per vivere time-lapse imaging è quello di preservare l&#39;integrità e la vitalità della cellula e dell&#39;organismo. Microscopia DIC offre il vantaggio che il campione non è esposta alla luce ultravioletta e il riscaldamento eccessivo dalla fonte di illuminazione. Microscopia DIC ben si adatta a rilevare la migrazione cellulare e cambia la forma delle cellule, come citocinesi e di individuare alcune strutture subcellulari, come il fuso mitotico e la membrana nucleare. Imaging di fluorescenza di proteine ​​giornalista integra microscopia DIC identificando ulteriori compartimenti subcellulari e consentendo la visualizzazione di proteine ​​specifiche. Per mitigare i rischi di fototossicità e danni per l&#39;embrione durante imaging di fluorescenza, di solito aumentare il guadagno digitale della fotocamera per compensare la ridotta intensità della luce UV e la durata di illuminazione. Per i deboli giornalisti transgenici fluorescenti, gli algoritmi di deconvoluzione per riassegnare out-of-focus algoritmi di luce o deblurring per ridurre sfondo può migliorare la qualità delle immagini catturate. Mentre i microscopi avanzate come i sistemi confocale o multiphoton a volte sono necessarie, abbiamo trovato che molti giornalisti fluorescenti possono essere ripreso questa impostazione epifluorescente microscopio, producendo immagini di alta qualità. Micro-Manager (http://www.micro-manager.org), oltre ad essere gratuito, salva i file direttamente in formato tiff invece di formati di file proprietari di molti pacchetti software commerciali. Questo semplifica notevolmente le analisi dei nostri dati, eliminando la fase di conversione file necessario per leggere i file di immagine in ImageJ, Photoshop e altri software di editing delle immagini.

Olympus BX61 microscopio con Hamamatsu Orca-ER fotocamera. Piano di fluorite 10x (NA 0,3) e PlanAchromat 60x (NA 1,35) lenti dell&#39;obiettivo Micro-Manager 1.3.46 (http://www.micro-manager.org) Immagine J 1,43 (http://rsbweb.nih.gov/ij) loci_tools.jar (http://www.loci.wisc.edu) Agarosio - biologia molecolare / elettroforesi su gel di grado Fisher Superfrost / Plus preparati microscopici (Catalogo # 12-550-15) Laboratorio nastro (Fisher Catalogo # 15-901 Series) 18 millimetri x 18 mm # 1.5 Coprivetrini M9 (242 mM KH 2 PO 4, 40 mM Na 2 HPO 4, 9 mm g NaCl, 19 mM di NH 4 Cl MgSO 4) (Http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm). Uovo Buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 25 HEPES mM, pH 7.3) 25. Vaselina Pennello / Stick Lamette da barba Calore blocco Microscopio da dissezione Worm 22 Filo di platino raccogliere 22 27G1 / 2 Precision Glide Ago (Beckton Dickinson) o un bisturi con lama piccola

imaging c. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software

Processi cellulari, come il montaggio dei cromosomi, segregazione e citocinesi, sono intrinsecamente dinamica. Time-lapse imaging di cellule viventi, mediante fluorescenza marcata proteine ​​reporter o contrasto interferenziale differenziale (DIC) microscopia, consente per l&#39;esame della progressione temporale di questi eventi dinamici che altrimenti è dedotto da analisi di campioni fisso 1,2. Inoltre, lo studio della normativa di sviluppo di processi cellulari rende necessario condurre esperimenti di time-lapse su un organismo intatto durante lo sviluppo. L&#39;embrione Caenorhabiditis elegans è leggero trasparente ed ha un rapido programma di sviluppo invariante con una cella conosciuto lignaggio 3, fornendo così un modello ideale esperimento per lo studio delle domande di biologia cellulare e dello sviluppo 4,5 6-9. C. elegans è modificabile alla manipolazione genetica in avanti genetica (sulla base di mutagenesi casuale 10,11) e genetica inversa per indirizzare geni specifici (sulla base di RNAi mediato da interferenze e mirati mutagenesi 12-15). Inoltre, gli animali transgenici possono essere facilmente create per esprimere proteine ​​fluorescenti tag o giornalisti 16,17. Queste caratteristiche si combinano per rendere più facile identificare i percorsi genetici che regolano processi cellulari fondamentali e dello sviluppo in vivo 18-21. In questo protocollo presenteremo i metodi per l&#39;imaging dal vivo di C. embrioni elegans utilizzando ottiche DIC o fluorescenza GFP su un microscopio composto epifluorescente. Dimostriamo la facilità con cui microscopi prontamente disponibili, tipicamente utilizzato per l&#39;imaging campione fisso, può essere applicato anche per time-lapse analisi utilizzando software open-source per automatizzare il processo di imaging.

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Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Il<em&gt; C. elegans</emEmbrione&gt; è un potente sistema per lo studio della biologia cellulare e dello sviluppo. Vi presentiamo un protocollo per l&#39;imaging dal vivo di<em&gt; C. elegans</em&gt; Embrioni utilizzando ottiche DIC o fluorescenza con microscopi epifluorescente facilmente disponibili e software open-source.

Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

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Biology

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

27.7K Views.  University of Michigan. Il C. elegans è un potente sistema per lo studio della biologia cellulare e dello sviluppo. Vi presentiamo un protocollo per l'imaging dal vivo di C. elegans Embrioni utilizzando ottiche DIC o fluorescenza con microscopi epifluorescente facilmente disponibili e software open-source.

Video: Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generazione di Stabile transgenici C. elegans Utilizzando Microiniezione

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

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Biologia

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

La preparazione di Drosophila Gli embrioni per Live-Imaging Utilizzando il protocollo goccia

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The apertureless near-field microscope is a light scattering-type instrument that provides infrared spectra at circa 20 nm resolution. A complete list of components and a step-by-step protocol for use is provided.  Common errors in assembly and instrument tuning are discussed.  A representative data set that shows the secondary structure of an amyloid fibril is presented.  

The assembly of a nearfield infrared microscope for imaging protein aggregates is described.

Assemblea, Tuning e utilizzo di un microscopio Apertureless Near Field Infrared for Imaging Proteine

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

L&#39;uso della microscopia Time lapse di visualizzare anossia indotta Suspended Animation in<em&gt; C. elegans</em&gt; Embrioni

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemiotassi Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Antibody colorazione in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Uso di &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Misurare gli effetti dei batteri su<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamento utilizzando un saggio di ritenzione dell&#39;uovo

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un modello di anossia-fame per ischemia / riperfusione in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

Impostazione di un semplice foglio microscopio ottico per<em&gt; In Toto</em&gt; Imaging di<em&gt; C. elegans</em&gt; Sviluppo

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

Flusso di lavoro per High-contenuti, Quantificazione singola cella di fluorescenti Marcatori da Universal Microscopio dati, supportati da Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...