Ringraziamo tutti i membri del Lenne e laboratori Bertrand, in particolare, Olivier Blanc per lo sviluppo software e Jérémie Capoulade per la discussione. Ringraziamo anche la funzione di imaging PICsL-IBDM, in particolare Claude Moretti e Brice Detailleur per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da ATIP sovvenzioni dal CNRS (a P.-FL e VB), il Labex INFORM concessione (da P.-FL e VB) e una sovvenzione da Sanofi-Aventis (VB). Noi riconosciamo l&#39;infrastruttura France-Bioimmagini sostenuto dalla Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-InSb-04-01, chiamiamo &quot;Investissements d&#39;Avenir&quot;).

1. Impostazione del foglio leggero e il Sentiero di rilevamento La figura 1 riporta uno schema generale del setup ottico. <ol><li> Posizionare e fissare il microscopio e il laser sul tavolo ottico. </li><li> Combinare laser 488 nm, 561 nm e 405 nm con i corrispondenti specchi dicroici. Dopo gli specchi dicroici, i laser devono essere precisamente co-allineati. Si noti che la scelta di lunghezze d&#39;onda laser, specchi dicroici e filtri ottici è determinato dagli spettri di assorbimento delle etichette fluorescenti specifici usati negli esperimenti. </li><li> Posizionare il filtro sintonizzabile acustico-ottico (AOTF). Utilizzare il foglio di prova forniti dal fornitore per regolare la frequenza e la potenza del AOTF. Quando ben allineato, circa il 90% della potenza del laser viene trasmesso ad un massimo di sintonia come misurato da una PowerMeter. Si noti che alcuni laser possono essere completamente controllati da software, che potrebbe rendere il AOTF inutile. </li><li> Posizionare e fissareil telescopio. Si noti che il telescopio è composto di due lenti che espandono il raggio di una larghezza pari o superiore al diametro della apertura posteriore della lente obiettivo illuminazione. L&#39;obiettivo con lunghezza focale minima dovrebbe venire prima. </li><li> Luogo, allineare e fissare il periscopio portare verso l&#39;alto il percorso ottico più vicino alla apertura posteriore della lente cilindrica. Si noti che i due specchi del periscopio sono montati in modo che il loro asse lungo è che sul l&#39;inclinazione dello specchio per riflettere il fascio completamente espansa. </li><li> Posizionare la lente cilindrica vicino all&#39;uscita periscopio. Si noti che la lente cilindrica focalizza il fascio in una direzione e lascia collimata nell&#39;altra direzione, formando così un foglio leggero. </li><li> Ridefinire il foglio leggero risultante utilizzando la lente dell&#39;obiettivo illuminazione. Si noti che il punto focale dell&#39;immagine dell&#39;obiettivo illuminazione deve coincidere con il punto focale oggetto dell&#39;obiettivo rilevamento. Proiettare il fasciosu uno schermo (ad esempio un muro) ad una lunga distanza. Spostare l&#39;obiettivo illuminazione lungo l&#39;asse ottico di illuminazione avere sullo schermo taglienti contorni del foglio leggero. </li><li> Posizionare la linea quad (405/488/561/638) filtro per le emissioni nel posto riservato al microscopio (cubo). </li><li> Collocare la fotocamera EMCCD alla porta di uscita microscopio. </li><li> Fissare la prima fase di traduzione manuale sul palco microscopio con viti in fori praticati nella fase microscopio. Si noti che il bordo del palco traduzione deve essere posizionata a circa 2 cm di distanza dal centro del palco microscopio, in modo che la cuvetta sia centrata sotto la lente obiettivo rilevamento. </li><li> Fissare la seconda fase di traduzione manuale sul primo. Le direzioni delle due fasi devono essere perpendicolare (X e Y traduzioni). </li><li> Fissare la fase Z piezoelettrico nella parte superiore dei due stadi precedenti. Si noti che un tavolino motorizzato può essere usata al posto della fase piezoelettrico. </li><li> Fissare il Holde cuvettar (vedi figura 2) nella parte superiore degli stadi. La cuvetta baserà quindi all&#39;intersezione del percorso illuminazione e il percorso di rilevamento, che sono perpendicolari l&#39;uno all&#39;altro. </li></ol> 2. Controllo del foglio leggero <ol><li> Riempie una vaschetta di vetro con soluzione fluorescente, e posizionarlo sul supporto del campione all&#39;intersezione dei due percorsi ottici. Il foglio leggero è quindi visibile. Deve essere orizzontale e simmetrica / centrato rispetto alla lente obiettivo rilevamento. </li><li> Rimuovere la lente cilindrica e acquisire un&#39;immagine per misurare lo spessore del foglio leggero. Si noti che lo spessore del foglio leggero dipende l&#39;apertura numerica (NA) dell&#39;illuminazione lente obiettivo (circa 3-4 micron per NA = 0,3). Si noti che per un dato obiettivo, lo spessore della luce fogli può essere aumentata riducendo la dimensione del fascio entrare apertura posteriore con una fessura. Si noti che microsfere fluorescenti possono essere usate per misurare la scureRisoluzione ial e laterale del microscopio. </li><li> Riposizionare la lente cilindrica prima di iniziare l&#39;esperimento. </li></ol> 3. Il montaggio di C. elegans embrioni I passi seguenti sono raffigurati nella Figura 3. <ol><li> Utilizzare una penna marcatura diamante per tagliare un pezzo di un vetrino di 10 x 20 x 1 mm. </li><li> Preparare 5% bacto-agar in acqua, bollire e mantenerla in un blocco di riscaldamento a 60 ° C. </li><li> Aggiungere 50 ml di poli-L-lisina su un lato del pezzo tagliato di diapositiva, lasciare asciugare. </li><li> Posizionare un vetrino da microscopio in panchina e risolvere il problema. </li><li> Giustapporre il pezzo tagliato di scorrimento con la slitta fissa e aggiungere una goccia di agar fuso sulla parte superiore. Spremere l&#39;agar utilizzando un altro vetrino da microscopio pulito per ottenere un pad agar sottile. </li><li> Lasciare che il pad agar asciugare prima di rimuovere la slitta superiore. </li><li> Tagliare il pad agar sul lato della slitta fissata in modo da lasciare un eccesso di circa 3 mm oagar f e rimuovere delicatamente il vetrino fisso. </li><li> Aggiungere 50 ml di poli-L-lisina sul agar e lasciare asciugare completamente. </li><li> Mettere vermi gravide in M9 mezzo in un vetro da orologio. </li><li> Tagliare i vermi a livello della vulva con un bisturi per liberare gli embrioni. </li><li> Sotto un binoculare identificare gli embrioni allo stadio di interesse e raccoglierli utilizzando una pipetta microcapillare. </li><li> Mettere gli embrioni da parte del agar rivestite con poli-L-lisina che sporge dal pezzo tagliato di diapositiva. Mettere gli embrioni proprio vicino al confine della diapositiva. Non posizionare gli embrioni al confine del agar, perché non sarà abbastanza stabile. Rimuovere delicatamente il liquido in modo che gli embrioni si attacchi sul livello poli-L-lisina. </li><li> Allineare rapidamente gli embrioni per evitare la disidratazione. </li><li> Posizionare il vetrino taglio in un piatto di plastica Petri e aggiungere delicatamente M9 medio per coprire la diapositiva. </li><li> Controllare sotto un binocolo che le uova sono ancora bloccati sul agar. </li&gt; </ol> 4. Registrazione di C. Sviluppo elegans <ol><li> Fissare la precedente preparazione (taglio diapositiva, agar più embrioni) nel supporto del campione e trasferirli in una cuvetta. Figura 4 descrive il titolare casalingo e la Figura 5 mostra una vista della vaschetta in contesto osservazione. </li><li> Fissare la cuvetta sul palco piezoelettrico. </li><li> Identificare la posizione degli embrioni con illuminazione in campo chiaro. </li><li> Avviare il software fatto in casa il controllo della AOTF, la fotocamera e la fase piezoelettrico. Si noti che un software libero, come micromanager, può anche essere usato. </li><li> Selezionare la riga laser e di potenza (AOTF). </li><li> Regolare la posizione del foglio leggero usando la fase 3 direzioni sostenere la lente cilindrica e la lente illuminazione. Spostare la fase lungo la direzione laterale (X) per ottenere il segnale luminoso. Regolare quindi la posizione Z del foglio leggero, e la posizione longitudinale (Y) per ottenere the migliore rapporto segnale-rumore. Si noti che la posizione del fuoco foglio leggero può essere necessario regolare da un embrione all&#39;altro per correggere le differenze di lunghezza di percorso di luce. </li><li> Per acquisire immagini time-lapse, selezionare il tempo di esposizione, guadagno, tempo tra due immagini, così come il numero di immagini da acquisire, e la potenza del laser. Per 2 acquisizione dei colori, selezionare una seconda linea laser. Due immagini a colori vengono acquisite consecutivamente. </li><li> Per acquisire pila az, seleziona anche la distanza tra le due sezioni, e l&#39;inizio e la fine posizioni del piezoelettrico. </li></ol>

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	<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136, 1963-1975 (2009).</li><li>Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet-based+fluorescence+microscopy:+more+dimensions,+more+photons,+and+less+photodamage.">Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage.</a> HFSP J. 2, 266-275 (2008).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li><li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+(iSPIM)+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).</li><li>Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos.">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139, 4271-4279 (2012).</li><li>Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+Imaging+beyond+the+Diffraction+Limit+of+3D+Dynamics+in+Thickly+Fluorescent+Specimens.">Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens.</a> Cell. 151, 1370-1385 (2012).</li><li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiview+light-sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging.">Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9, 730-733 (2012).</li><li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+light-sheet+microscopy.">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9, 755-763 (2012).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+fluorescence+excitation+by+multidirectional+selective+plane+illumination+microscopy+(mSPIM).">Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM).</a> Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive una facile configurazione della microscopia foglio leggero per l&#39;imaging in vivo di C. elegans embrioni. Gli elementi ottici necessari per creare e allineare il foglio leggero, tra cui laser, beam expander, collimazione e lenti di messa a fuoco, possono essere facilmente montati su un banco ottico. In combinazione con un microscopio verticale per il percorso di rilevamento e la fotocamera, questo fornisce una soluzione semplice per impostare un microscopio foglio leggero. Questa geometria rende l&#39;ambiente campione semplice. Il campione vivente è posto in una cuvetta di vetro, che si svolge, posizionato e mosso da un piccolo insieme di pezzi meccanici. Come microscopia illuminazione foglio è una tecnica a largo campo con sezionamento, è necessario solo un singolo asse motorizzato movimento per l&#39;imaging 3D. Questo limita il requisito di sincronizzazione di un singolo elemento di scansione e facilita lo sviluppo di software. Rispetto al ISPIM 6 nostro GEOMET verticaleRY permette l&#39;uso di alta lente obiettivo NA per il rilevamento. Rispetto a configurazioni SPIM con lenti obiettive nel piano orizzontale il montaggio del campione e l&#39;imaging di una serie di embrioni sono più facili. Complessivamente, l&#39;applicazione di questa tecnica è semplice e può essere realizzato con poca esperienza nel settore dell&#39;ottica. Questa è un&#39;alternativa più economica per microscopi confocali con i vantaggi di una maggiore velocità e fototossicità ridotta ma inconveniente di risoluzione assiale inferiore. Abbiamo sviluppato anche un modo semplice e riproducibile per montare C. embrioni elegans per l&#39;imaging in vivo tramite questo sistema. La procedura di montaggio è veloce (15 min) ed è adatto per esperimenti quotidiane. Per C. immagini elegans, i vantaggi di questa semplice impostazione sono almeno due pieghe: (i) in toto l&#39;imaging è possibile senza rotazione e quindi la ricostruzione 3D è semplice; (Ii) il montaggio del campione è semplice e più embrioni può essere ripreso in sequenzasulla stessa diapositiva. Abbiamo mostrato alcuni esempi di filmati time-lapse con una risoluzione temporale sufficiente osservare le divisioni cellulari e variazioni di forma delle cellule. Il potere di microscopia foglio leggero per studiare C. sviluppo elegans è stato recentemente illustrato da altri 6, 7, 8. Pertanto, questa tecnica sarà molto utile per studiare la morfogenesi e patterning del C. elegans embrione. Questo sistema può essere utilizzato anche per analizzare lo sviluppo di altri organismi modello? È importante riconoscere che l&#39;attuazione del foglio illuminazione microscopia per organismo piccola e trasparente come C. elegans è meno severe che per gli organismi più grandi come embrioni di Drosophila. in toto l&#39;imaging di Drosophila normalmente richiede la rotazione e multi-vista ricostruzioni 9, 10. eccitazione da due lati con lenti dell&#39;obiettivo di eccitazione collineari possono anche ridurre gli effetti d&#39;ombra causate dalla attenuatione della luce 11. Tuttavia, la configurazione qui presentata è ancora atto ad immagine un lato degli embrioni di Drosophila, con basso candeggio e bassa photoxicity. Questa configurazione potrebbe essere utile anche per immagini piccole e trasparenti embrioni come ascidie o zebrafish.

La formazione e la sagomatura di un organismo comporta movimenti delle cellule, forma cambia cellulare, divisione cellulare e la differenziazione cellulare. Comprendere la progressione e il coordinamento di questi processi richiedono strumenti veloci di imaging con possibilità di tre dimensioni e la risoluzione subcellulare. Tra le tecniche con le capacità di imaging in vivo in luce foglio di illuminazione microscopio chiamato anche single / selettiva microscopia illuminazione aereo ha il vantaggio unico di produrre effetti a bassa fototossico e basso photobleaching 1,2. Nel foglio di illuminazione microscopia, il campione è illuminato dal lato da un foglio leggero, che esegue il sezionamento ottico. Il percorso di illuminazione e il percorso di rilevamento sono perpendicolari tra loro e il foglio leggero è allineato a coincidere con il piano focale oggetto della lente obiettivo rilevamento. Il campione è posto all&#39;intersezione dei due percorsi, unND può essere spostato lungo l&#39;asse di rilevamento per consentire l&#39;imaging 3D. Solo il piano di interesse è illuminato e tutti i punti di questo piano vengono rilevati allo stesso tempo. Ciò aumenta notevolmente la velocità di acquisizione e riduce fotoscolorimento nonché fototossicità rispetto alla microscopia confocale 3. In pratica, la microscopia illuminazione foglio è facile da installare e align: per due l&#39;imaging tridimensionale, non scansione è necessaria né per la parte di rilevamento, né per la parte illuminazione; come tecnica a grande campo con sezionamento, imaging tridimensionale può essere ottenuta con un singolo movimento asse della scena tenendo il campione. Qui vi presentiamo la creazione di un microscopio semplice foglio leggero e la sua attuazione in toto per l&#39;imaging di C. elegans embrioni. C. elegans embrioni sono adatti a vivere in vivo imaging a causa della loro trasparenza, lignaggio invariante e stereotipato cellulare posiziona a 4,5. Il setup foglio leggero sviluppato è basato su microscopio verticale standard per il rilevamento. Il protocollo presentato di seguito in dettaglio come costruire e allineare l&#39;eccitazione modulo / percorso, prova e caratterizzare il foglio leggero e montare il campione per l&#39;imaging 3D. Fornisce inoltre esempi di film time-lapse acquisite con l&#39;installazione su diversi ceppi che esprimono marcatori fluorescenti.

<table><tbody><tr><td>SPIM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Detection</td></tr><tr><td>upright microscope</td><td>ZEISS</td><td>Axiophot 1</td><td></td></tr><tr><td>100x W objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm)&amp;nbsp;</td><td>NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMCCD back illuminated</td><td>ANDOR</td><td>DU-885K-CS0-#VP</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Illumination</td></tr><tr><td>LASER 488 nm / 60 mW</td><td>TOPTICA</td><td>iBeam smart</td><td></td></tr><tr><td>LASER 405 nm / 120 mW</td><td>TOPTICA</td><td>iBeam smart</td><td></td></tr><tr><td>LASER 561 nm / 500 mW</td><td>COBOLT</td><td>JIVE 500</td><td>&amp;nbsp;for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough</td></tr><tr><td>filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638</td><td>AHF</td><td>F57-405</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic 405</td><td>AHF</td><td>F38-405</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic 488</td><td>SEMROCK</td><td>Di01-R488</td><td></td></tr><tr><td>AOTF</td><td>AA</td><td>AOTFnC-400.650-TN</td><td></td></tr><tr><td>mirror</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lens 50 mm</td><td>THORLABS</td><td></td><td>telescope 5X</td></tr><tr><td>lens 200 mm</td><td>THORLABS</td><td></td><td>telescope 5X</td></tr><tr><td>periscope</td><td>THORLABS</td><td>RS99/M</td><td></td></tr><tr><td>cylindrical lens f=100mm</td><td>THORLABS</td><td>ACY254-100-A</td><td></td></tr><tr><td>10X NA 0,3</td><td>NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xyz stage</td><td>NEWPORT</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Sample</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Bectkton Dickinson</td><td>214010</td><td>5% in water</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L</td><td>Havard Appartus</td><td>30-0019</td><td></td></tr><tr><td>Aspiration tube (mouth pipette)</td><td>Dutsher</td><td>55005</td><td></td></tr><tr><td>M9 medium:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 (3g/L)</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (6g/L)</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCL (5g/L)</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (1 mM final)</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cuvette holder</td><td>HOME MADE</td><td></td><td>made by Brice Detailleur&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>sample holder</td><td>HOME MADE</td><td></td><td>made by Claude Moretti&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>x stage</td><td>NEWPORT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>coverslip 50x20x1 mm</td><td>MARIENFELD</td><td></td><td>cut then in 10x20x1mm</td></tr><tr><td>piezo electric stage with amplifier/controller</td><td>PI</td><td>P-622.ZCD / E-625.CR</td><td></td></tr><tr><td>cuvette 40mmx40mmx10mm</td><td>HELLMA</td><td>704.002-OG.40 mm- 10mm high</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Point Glass Marking Pencil</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>C++ (Qt) home made software</td><td></td><td></td><td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&amp;egrave;s, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

setting up a simple light sheet microscope for in toto imaging of c. elegans development

Tecniche di imaging fototossiche veloci e bassi sono pre-requisito per studiare lo sviluppo di organismi in toto. La microscopia foglio leggero basato riduce fotometabolismo ed effetti fototossiche rispetto alla microscopia confocale, fornendo immagini 3D con una risoluzione sub-cellulare. Presentiamo qui la configurazione di un foglio basato microscopio ottico, che è composto da un microscopio verticale e un piccolo insieme di elementi opto-meccanici per la generazione del foglio leggero. Il protocollo descrive come costruire, allineare il microscopio e caratterizzano il foglio leggero. Inoltre, si descrive come implementare il metodo per l&#39;imaging in toto di C. elegans embrioni utilizzando una semplice camera di osservazione. Il metodo consente la cattura di 3D bicolore film time-lapse over poche ore di sviluppo. Questo dovrebbe facilitare il monitoraggio delle forma della cellula, divisioni cellulari e proteine ​​marcate per lunghi periodi di tempo.

Tre esperimenti di registrazione time-lapse in 3D di tre diversi C. elegans ceppi illustrano il tipo di dati che può essere ottenuto usando la configurazione microscopio foglio leggero sopra descritto. Abbiamo verificato che in queste condizioni gli embrioni si sviluppano a velocità normale e sopravvivere imaging, coerente con i rapporti precedenti che indicano che l&#39;imaging SPIM provoca solo bassi livelli di fototossicità in C. elegans embrioni 6,7. Il primo ceppo esprime un istone fuso con GFP (zuIs178, stIs10024). Registrazione è stata effettuata per 2 ore con una pila di fette 20 (distanza tra le sezioni 1 micron) preso ogni 37 sec. Figura 6 illustra un piano della pila a tempi diversi. Entrambi i nuclei interfasiche (freccia) e condensato cromatina mitotico (testa di freccia) sono chiaramente visibili. Il secondo ceppo esprime un tubulina fuso con GFP (ruIs57) e un istonefusa alla mCherry (itIs37, stIs10226). La registrazione è stata effettuata durante 16 min con una pila di 20 fette (distanza tra le sezioni 1 micron) preso ogni 105 sec. Figura 7 illustra diversi piani dello stack e diversi punti temporali. Il film associato 1 visualizza ricostruzioni 3D a 3 punti temporali successivi. Durante la divisione, il fuso mitotico (verde) e cromosomi condensati (rosso) sono chiaramente visibili, permettendo il tracciamento degli orientamenti divisione cellulare durante lo sviluppo. Il terzo ceppo esprime l&#39;apolipoproteina VIT-2 fuso con GFP (pwIs23) e una membrana legata mCherry (ltIs44). La registrazione è stata effettuata durante 25 min con una pila di 10 fette (distanza tra le sezioni 1 micron) preso ogni 30 sec. Figura 8 illustra diversi piani dello stack e diversi punti temporali. I movimenti veloci delle particelle tuorlo lipoproteina (verde) all&#39;interno delle cellule possono essere facilmenteseguita. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1: configurazione ottica SPIM composto di illuminazione e di rilevamento unità, anteriore e vista basso. Nell&#39;unità di illuminazione, i laser combinate dagli specchi dicroici entrano AOTF, che controlla la potenza di ogni laser indipendente. Poi, il telescopio aumenta la dimensione del fascio da 4 volte e il periscopio lo porta all&#39;altezza del microscopio. La lente cilindrica forma il foglio leggero, che è riorientato dall&#39;obiettivo illuminazione. L&#39;unità di rilevazione è integrato nel microscopio verticale ed è composta principalmente dalla lente di rilevamento, il filtro, la lente del tubo e la EMCCD. Il campione viene posizionato all&#39;intersezione tra l&#39;illuminazione e rilevazione percorsi. Una fase piezoelettrico consente verticale (Z) spostamenti del campioneper l&#39;acquisizione 3D. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2:. Cuvette supporto Il supporto è costituito da 3 lastre di alluminio ed è avvitato sulla scena piezoelettrico. La cuvetta di vetro è detenuto da una molla (in rosso). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3: Montaggio protocollo di C. embrioni elegans per esperimenti SPIM. Un pezzo tagliato di vetro è rivestita con poli-L-lisina. Un pad di agar è posizionato sulla superficie rivestita. Poli-L-lisina viene aggiunto sul tampone agar. Infine, C. elegans embrioni sono allineate sul rivestita pad agar poli-L-lisina. Figura 4: Supporto del campione. Il titolare si adatta alle dimensioni interne della cuvetta vetro. Due molle (in rosso) tenere il vetrino (descritto in Figura 3). Questo supporto viene poi messo dentro la provetta di vetro. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5:... Supporto del campione nel contesto osservazione embrioni sono immobilizzati sul vetrino secondo il protocollo riassunto in Figura 3 La slitta è tenuto dal titolare esempio descritto in Figura 4 Il porta campione viene inserito nella cuvetta di vetro, dal titolare descritto in Figura 2. Il foglio leggero è orizzontale ed illuminates gli embrioni dal lato. La lente obiettivo rilevamento è verticale, sopra il campione. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6: La registrazione di un C. elegans embrione esprime una fusione istone :: GFP immagini unico piano di un embrione transgenico che esprime un istone :: fusione GFP (zuIs178; stIs10024) in diversi punti temporali immagini estratte da una registrazione time-lapse in 3D:.. pile realizzate in 20 fette ( distanza tra le sezioni 1 micron); tempo di esposizione per fetta: 30 msec; intervallo di tempo tra pile: 37 sec; tempo di acquisizione totale: 2 ore. Arrow: nucleo interfasico, punta di freccia: condensato cromatina mitotico. A t = 0 min l&#39;embrione è allo stadio di 2 cellule e at = 120 min dell&#39;embrione contiene circa 70 celle come previsto nelle normali s sviluppopeed (notare che solo le cellule contenute in un unico piano sono visibili nelle immagini e non tutte le cellule dell&#39;embrione). Il potere di illuminazione era il 30 μW a 488 nm (misurata all&#39;uscita dell&#39;obiettivo illuminazione). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure6.avi" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare questo video.</a> <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7: Registrazione di una C. elegans embrione esprimendo un tubulina :: GFP fusion e un istone :: mCherry fusione. immagini estratte da una registrazione time-lapse in 3D di una C. elegans embrione esprimendo un tubulina :: GFP fusione (ruIs57) e un istone :: mCherry fusione (itIs37, stIs10226). Condizioni di registrazione: acquisizione di una pila di 20 fette (distanza tra fette di 1micron) ogni 105 secondi; tempo totale di acquisizione: 16 min; tempo di esposizione: 200 msec per ciascun canale. Pannello una mostra 10 fette della stessa risma. Pannello B mostra la stessa fetta ogni 210 sec. Il potere di illuminazione era il 30 μW e 300 μW, per 488 e 561 nm laser, rispettivamente (misurati all&#39;uscita dell&#39;obiettivo illuminazione). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure7.avi" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare questo video.</a> <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig8highres.jpg" width="500" /> Figura 8: La registrazione di un C. elegans embrione esprimendo un VIT-2 :: GFP fusion e una membrana mirati mCherry. immagini estratte da una registrazione time-lapse in 3D di una C. elegans embrione esprime una fusione VIT-2 :: GFP (PWIS23) e un mCherry membrana targeting (ltIs44). Condizioni di registrazione: acquisizione di una pila di 10 fette (distanza tra le sezioni 1 micron) ogni 30 secondi; tempo totale di acquisizione: 25 min; tempo di esposizione per canale: 200 msec. Pannello A mostra i primi 5 fette della stessa pila. Pannello B mostra la stessa fetta ogni 30sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure8.avi" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare questo video.</a>

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Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Questo protocollo descrive la configurazione di un microscopio foglio leggero e la sua applicazione per l&#39;imaging in vivo di C. elegans embrioni.

Impostazione di un semplice foglio microscopio ottico per<em&gt; In Toto</em&gt; Imaging di<em&gt; C. elegans</em&gt; Sviluppo

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

23.1K Views.  UMR7288 CNRS, Aix-Marseille Université.  Questo protocollo descrive la configurazione di un microscopio foglio leggero e la sua applicazione per l'imaging in vivo di C. elegans embrioni. 

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The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the lumen and basolateral membranes contacting each other and/or the extracellular matrix. How this distinctive membrane asymmetry is established and maintained during organ morphogenesis is still an unresolved question of cell biology. This protocol describes the C. elegans intestine as a&#160;model for the analysis of polarized membrane biogenesis during tube morphogenesis, with emphasis on apical membrane and lumen biogenesis. The C. elegans twenty-cell single-layered intestinal epithelium is arranged into a simple bilaterally symmetrical tube, permitting analysis on a single-cell level. Membrane polarization occurs concomitantly with polarized cell division and migration during early embryogenesis, but de novo polarized membrane biogenesis continues throughout larval growth, when cells no longer proliferate and move. The latter setting allows one to separate subcellular changes that simultaneously mediate these different polarizing processes, difficult to distinguish in most polarity models. Apical-, basolateral membrane-, junctional-, cytoskeletal- and endomembrane components can be labeled and tracked throughout development by GFP fusion proteins, or assessed by in situ antibody staining. Together with the organism&#39;s genetic versatility, the C. elegans intestine thus provides a unique in vivo model for the visual, developmental, and molecular genetic analysis of polarized membrane and tube biogenesis. The specific methods (all standard) described here include how to: label intestinal subcellular components by antibody staining; analyze genes involved in polarized membrane biogenesis by loss-of-function studies adapted to the typically essential tubulogenesis genes; assess polarity defects during different developmental stages; interpret phenotypes by epifluorescence, differential interference contrast (DIC) and confocal microscopy; quantify visual defects. This protocol can be adapted to analyze any of the often highly conserved molecules involved in epithelial polarity, membrane biogenesis, tube and lumen morphogenesis.

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

The transparent C. elegans intestine can serve as an "in vivo tissue chamber" for studying apicobasal membrane and lumen biogenesis at the single-cell and subcellular level during multicellular tubulogenesis. This protocol describes how to combine standard labeling, loss-of-function genetic/RNAi and microscopic approaches to dissect these processes on a molecular level.

Il c. elegans intestino come un modello per intercellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo a livello di singola cellula: etichettatura da macchiatura dell'anticorpo, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Neuroscienze

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

Microscopia isotropica leggera e analisi di lignaggio cellulare automatizzate al catalogo Caenorhabditis elegans embriogenesi con risoluzione subcellulare

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Imaging basato su smartphone per il saggio di evitamento del prato di C. elegans

A Smartphone-Based Imaging Method for C. elegans Lawn Avoidance Assay

When exposed to toxic or pathogenic bacteria, the nematode Caenorhabditis elegans displays a learned lawn avoidance behavior, in which the worms gradually leave their food source and prefer to remain outside the bacterial lawn. The assay is an easy way to test the worms' ability to sense external or internal cues to properly respond to harmful conditions. Though a simple assay, counting is time consuming, particularly with multiple samples, and assay durations that span overnight are inconvenient for researchers. An imaging system that can image many plates over a long period is useful but costly. Here, we describe a smartphone-based imaging method to record lawn avoidance in C. elegans. The method requires only a smartphone and a light emitting diode (LED) light box, to serve as a transmitted light source. Using free time-lapse camera applications, each phone can image up to six plates, with sufficient sharpness and contrast to manually count worms outside the lawn. The resulting movies are processed into 10 s audio video interleave (AVI) files for every hourly time point, then cropped to show each single plate to make them more amenable for counting. This method is a cost-effective way for those looking to examine avoidance defects and can potentially be extended to other C. elegans assays.

Autore in primo piano: un metodo di imaging basato su smartphone per il saggio di evitamento del prato di C. elegans  

This article describes a simple, low-cost method of recording the lawn avoidance behavior of Caenorhabditis elegans, using readily available items such as a smartphone and a light emitting diode (LED) light box. We also provide a Python script to process the video file into a format more amenable for counting.

Un metodo di imaging basato su smartphone per il saggio di evitamento del prato di C. elegans

When exposed to toxic or pathogenic bacteria, the nematode Caenorhabditis elegans displays a learned lawn avoidance behavior, in which the worms gradually ...

Comportamento

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans has emerged as one of the best models for studying development. From an optical point of view, its size and transparent body make this nematode an ideal specimen for DIC (Differential Interference Contrast or Nomarski) microscopy. This article illustrates a protocol for growing C. elegans nematodes, preparing and mounting their embryos, performing 4D microscopy and cell lineage tracing. The method is based on multifocal time-lapse records of Nomarski images and analysis with specific software. This technique reveals embryonic developmental dynamics at the cellular level. Any embryonic defect in mutants, such as problems in spindle orientation, cell migration, apoptosis or cell fate specification, can be efficiently detected and scored. Virtually every single cell of the embryo can be followed up to the moment the embryo begins to move. Tracing the complete cell lineage of a C. elegans embryo by 4D DIC microscopy is laborious, but the use of specific software greatly facilitates this task. In addition, this technique is easy to implement in the lab. 4D microscopy is a versatile tool and opens the possibility of performing an unparalleled analysis of embryonic development.

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Here, we present a protocol for preparing and mounting Caenorhabditis elegans embryos, recording development under a 4D microscope and tracing cell lineage.

Microscopia 4D: svelare lo sviluppo embrionale di Caenorhabditis elegans utilizzando la microscopia Nomarski

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Biologia

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Microscopia time-lapse di Embriogenesi All&#39;inizio del Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Impostazione di un semplice foglio microscopio ottico per

Riepilogo

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Il c. elegans intestino come un modello per intercellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo a livello di singola cellula: etichettatura da macchiatura dell'anticorpo, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

Microscopia isotropica leggera e analisi di lignaggio cellulare automatizzate al catalogo Caenorhabditis elegans embriogenesi con risoluzione subcellulare

Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

Un metodo di imaging basato su smartphone per il saggio di evitamento del prato di C. elegans

Un metodo di imaging basato su smartphone per il saggio di evitamento del prato di C. elegans

Un metodo di imaging basato su smartphone per il saggio di evitamento del prato di C. elegans

Microscopia 4D: svelare lo sviluppo embrionale di Caenorhabditis elegans utilizzando la microscopia Nomarski

Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source

Microscopia time-lapse di Embriogenesi All'inizio del Caenorhabditis elegans