Ringraziamo tutti i membri del Lenne e laboratori Bertrand, in particolare, Olivier Blanc per lo sviluppo software e Jérémie Capoulade per la discussione. Ringraziamo anche la funzione di imaging PICsL-IBDM, in particolare Claude Moretti e Brice Detailleur per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da ATIP sovvenzioni dal CNRS (a P.-FL e VB), il Labex INFORM concessione (da P.-FL e VB) e una sovvenzione da Sanofi-Aventis (VB). Noi riconosciamo l&#39;infrastruttura France-Bioimmagini sostenuto dalla Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-InSb-04-01, chiamiamo &quot;Investissements d&#39;Avenir&quot;).

1. Impostazione del foglio leggero e il Sentiero di rilevamento La figura 1 riporta uno schema generale del setup ottico. <ol><li> Posizionare e fissare il microscopio e il laser sul tavolo ottico. </li><li> Combinare laser 488 nm, 561 nm e 405 nm con i corrispondenti specchi dicroici. Dopo gli specchi dicroici, i laser devono essere precisamente co-allineati. Si noti che la scelta di lunghezze d&#39;onda laser, specchi dicroici e filtri ottici è determinato dagli spettri di assorbimento delle etichette fluorescenti specifici usati negli esperimenti. </li><li> Posizionare il filtro sintonizzabile acustico-ottico (AOTF). Utilizzare il foglio di prova forniti dal fornitore per regolare la frequenza e la potenza del AOTF. Quando ben allineato, circa il 90% della potenza del laser viene trasmesso ad un massimo di sintonia come misurato da una PowerMeter. Si noti che alcuni laser possono essere completamente controllati da software, che potrebbe rendere il AOTF inutile. </li><li> Posizionare e fissareil telescopio. Si noti che il telescopio è composto di due lenti che espandono il raggio di una larghezza pari o superiore al diametro della apertura posteriore della lente obiettivo illuminazione. L&#39;obiettivo con lunghezza focale minima dovrebbe venire prima. </li><li> Luogo, allineare e fissare il periscopio portare verso l&#39;alto il percorso ottico più vicino alla apertura posteriore della lente cilindrica. Si noti che i due specchi del periscopio sono montati in modo che il loro asse lungo è che sul l&#39;inclinazione dello specchio per riflettere il fascio completamente espansa. </li><li> Posizionare la lente cilindrica vicino all&#39;uscita periscopio. Si noti che la lente cilindrica focalizza il fascio in una direzione e lascia collimata nell&#39;altra direzione, formando così un foglio leggero. </li><li> Ridefinire il foglio leggero risultante utilizzando la lente dell&#39;obiettivo illuminazione. Si noti che il punto focale dell&#39;immagine dell&#39;obiettivo illuminazione deve coincidere con il punto focale oggetto dell&#39;obiettivo rilevamento. Proiettare il fasciosu uno schermo (ad esempio un muro) ad una lunga distanza. Spostare l&#39;obiettivo illuminazione lungo l&#39;asse ottico di illuminazione avere sullo schermo taglienti contorni del foglio leggero. </li><li> Posizionare la linea quad (405/488/561/638) filtro per le emissioni nel posto riservato al microscopio (cubo). </li><li> Collocare la fotocamera EMCCD alla porta di uscita microscopio. </li><li> Fissare la prima fase di traduzione manuale sul palco microscopio con viti in fori praticati nella fase microscopio. Si noti che il bordo del palco traduzione deve essere posizionata a circa 2 cm di distanza dal centro del palco microscopio, in modo che la cuvetta sia centrata sotto la lente obiettivo rilevamento. </li><li> Fissare la seconda fase di traduzione manuale sul primo. Le direzioni delle due fasi devono essere perpendicolare (X e Y traduzioni). </li><li> Fissare la fase Z piezoelettrico nella parte superiore dei due stadi precedenti. Si noti che un tavolino motorizzato può essere usata al posto della fase piezoelettrico. </li><li> Fissare il Holde cuvettar (vedi figura 2) nella parte superiore degli stadi. La cuvetta baserà quindi all&#39;intersezione del percorso illuminazione e il percorso di rilevamento, che sono perpendicolari l&#39;uno all&#39;altro. </li></ol> 2. Controllo del foglio leggero <ol><li> Riempie una vaschetta di vetro con soluzione fluorescente, e posizionarlo sul supporto del campione all&#39;intersezione dei due percorsi ottici. Il foglio leggero è quindi visibile. Deve essere orizzontale e simmetrica / centrato rispetto alla lente obiettivo rilevamento. </li><li> Rimuovere la lente cilindrica e acquisire un&#39;immagine per misurare lo spessore del foglio leggero. Si noti che lo spessore del foglio leggero dipende l&#39;apertura numerica (NA) dell&#39;illuminazione lente obiettivo (circa 3-4 micron per NA = 0,3). Si noti che per un dato obiettivo, lo spessore della luce fogli può essere aumentata riducendo la dimensione del fascio entrare apertura posteriore con una fessura. Si noti che microsfere fluorescenti possono essere usate per misurare la scureRisoluzione ial e laterale del microscopio. </li><li> Riposizionare la lente cilindrica prima di iniziare l&#39;esperimento. </li></ol> 3. Il montaggio di C. elegans embrioni I passi seguenti sono raffigurati nella Figura 3. <ol><li> Utilizzare una penna marcatura diamante per tagliare un pezzo di un vetrino di 10 x 20 x 1 mm. </li><li> Preparare 5% bacto-agar in acqua, bollire e mantenerla in un blocco di riscaldamento a 60 ° C. </li><li> Aggiungere 50 ml di poli-L-lisina su un lato del pezzo tagliato di diapositiva, lasciare asciugare. </li><li> Posizionare un vetrino da microscopio in panchina e risolvere il problema. </li><li> Giustapporre il pezzo tagliato di scorrimento con la slitta fissa e aggiungere una goccia di agar fuso sulla parte superiore. Spremere l&#39;agar utilizzando un altro vetrino da microscopio pulito per ottenere un pad agar sottile. </li><li> Lasciare che il pad agar asciugare prima di rimuovere la slitta superiore. </li><li> Tagliare il pad agar sul lato della slitta fissata in modo da lasciare un eccesso di circa 3 mm oagar f e rimuovere delicatamente il vetrino fisso. </li><li> Aggiungere 50 ml di poli-L-lisina sul agar e lasciare asciugare completamente. </li><li> Mettere vermi gravide in M9 mezzo in un vetro da orologio. </li><li> Tagliare i vermi a livello della vulva con un bisturi per liberare gli embrioni. </li><li> Sotto un binoculare identificare gli embrioni allo stadio di interesse e raccoglierli utilizzando una pipetta microcapillare. </li><li> Mettere gli embrioni da parte del agar rivestite con poli-L-lisina che sporge dal pezzo tagliato di diapositiva. Mettere gli embrioni proprio vicino al confine della diapositiva. Non posizionare gli embrioni al confine del agar, perché non sarà abbastanza stabile. Rimuovere delicatamente il liquido in modo che gli embrioni si attacchi sul livello poli-L-lisina. </li><li> Allineare rapidamente gli embrioni per evitare la disidratazione. </li><li> Posizionare il vetrino taglio in un piatto di plastica Petri e aggiungere delicatamente M9 medio per coprire la diapositiva. </li><li> Controllare sotto un binocolo che le uova sono ancora bloccati sul agar. </li&gt; </ol> 4. Registrazione di C. Sviluppo elegans <ol><li> Fissare la precedente preparazione (taglio diapositiva, agar più embrioni) nel supporto del campione e trasferirli in una cuvetta. Figura 4 descrive il titolare casalingo e la Figura 5 mostra una vista della vaschetta in contesto osservazione. </li><li> Fissare la cuvetta sul palco piezoelettrico. </li><li> Identificare la posizione degli embrioni con illuminazione in campo chiaro. </li><li> Avviare il software fatto in casa il controllo della AOTF, la fotocamera e la fase piezoelettrico. Si noti che un software libero, come micromanager, può anche essere usato. </li><li> Selezionare la riga laser e di potenza (AOTF). </li><li> Regolare la posizione del foglio leggero usando la fase 3 direzioni sostenere la lente cilindrica e la lente illuminazione. Spostare la fase lungo la direzione laterale (X) per ottenere il segnale luminoso. Regolare quindi la posizione Z del foglio leggero, e la posizione longitudinale (Y) per ottenere the migliore rapporto segnale-rumore. Si noti che la posizione del fuoco foglio leggero può essere necessario regolare da un embrione all&#39;altro per correggere le differenze di lunghezza di percorso di luce. </li><li> Per acquisire immagini time-lapse, selezionare il tempo di esposizione, guadagno, tempo tra due immagini, così come il numero di immagini da acquisire, e la potenza del laser. Per 2 acquisizione dei colori, selezionare una seconda linea laser. Due immagini a colori vengono acquisite consecutivamente. </li><li> Per acquisire pila az, seleziona anche la distanza tra le due sezioni, e l&#39;inizio e la fine posizioni del piezoelettrico. </li></ol>

<ol>
	<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136, 1963-1975 (2009).</li><li>Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet-based+fluorescence+microscopy:+more+dimensions,+more+photons,+and+less+photodamage.">Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage.</a> HFSP J. 2, 266-275 (2008).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li><li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+(iSPIM)+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).</li><li>Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos.">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139, 4271-4279 (2012).</li><li>Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+Imaging+beyond+the+Diffraction+Limit+of+3D+Dynamics+in+Thickly+Fluorescent+Specimens.">Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens.</a> Cell. 151, 1370-1385 (2012).</li><li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiview+light-sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging.">Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9, 730-733 (2012).</li><li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+light-sheet+microscopy.">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9, 755-763 (2012).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+fluorescence+excitation+by+multidirectional+selective+plane+illumination+microscopy+(mSPIM).">Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM).</a> Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive una facile configurazione della microscopia foglio leggero per l&#39;imaging in vivo di C. elegans embrioni. Gli elementi ottici necessari per creare e allineare il foglio leggero, tra cui laser, beam expander, collimazione e lenti di messa a fuoco, possono essere facilmente montati su un banco ottico. In combinazione con un microscopio verticale per il percorso di rilevamento e la fotocamera, questo fornisce una soluzione semplice per impostare un microscopio foglio leggero. Questa geometria rende l&#39;ambiente campione semplice. Il campione vivente è posto in una cuvetta di vetro, che si svolge, posizionato e mosso da un piccolo insieme di pezzi meccanici. Come microscopia illuminazione foglio è una tecnica a largo campo con sezionamento, è necessario solo un singolo asse motorizzato movimento per l&#39;imaging 3D. Questo limita il requisito di sincronizzazione di un singolo elemento di scansione e facilita lo sviluppo di software. Rispetto al ISPIM 6 nostro GEOMET verticaleRY permette l&#39;uso di alta lente obiettivo NA per il rilevamento. Rispetto a configurazioni SPIM con lenti obiettive nel piano orizzontale il montaggio del campione e l&#39;imaging di una serie di embrioni sono più facili. Complessivamente, l&#39;applicazione di questa tecnica è semplice e può essere realizzato con poca esperienza nel settore dell&#39;ottica. Questa è un&#39;alternativa più economica per microscopi confocali con i vantaggi di una maggiore velocità e fototossicità ridotta ma inconveniente di risoluzione assiale inferiore. Abbiamo sviluppato anche un modo semplice e riproducibile per montare C. embrioni elegans per l&#39;imaging in vivo tramite questo sistema. La procedura di montaggio è veloce (15 min) ed è adatto per esperimenti quotidiane. Per C. immagini elegans, i vantaggi di questa semplice impostazione sono almeno due pieghe: (i) in toto l&#39;imaging è possibile senza rotazione e quindi la ricostruzione 3D è semplice; (Ii) il montaggio del campione è semplice e più embrioni può essere ripreso in sequenzasulla stessa diapositiva. Abbiamo mostrato alcuni esempi di filmati time-lapse con una risoluzione temporale sufficiente osservare le divisioni cellulari e variazioni di forma delle cellule. Il potere di microscopia foglio leggero per studiare C. sviluppo elegans è stato recentemente illustrato da altri 6, 7, 8. Pertanto, questa tecnica sarà molto utile per studiare la morfogenesi e patterning del C. elegans embrione. Questo sistema può essere utilizzato anche per analizzare lo sviluppo di altri organismi modello? È importante riconoscere che l&#39;attuazione del foglio illuminazione microscopia per organismo piccola e trasparente come C. elegans è meno severe che per gli organismi più grandi come embrioni di Drosophila. in toto l&#39;imaging di Drosophila normalmente richiede la rotazione e multi-vista ricostruzioni 9, 10. eccitazione da due lati con lenti dell&#39;obiettivo di eccitazione collineari possono anche ridurre gli effetti d&#39;ombra causate dalla attenuatione della luce 11. Tuttavia, la configurazione qui presentata è ancora atto ad immagine un lato degli embrioni di Drosophila, con basso candeggio e bassa photoxicity. Questa configurazione potrebbe essere utile anche per immagini piccole e trasparenti embrioni come ascidie o zebrafish.

La formazione e la sagomatura di un organismo comporta movimenti delle cellule, forma cambia cellulare, divisione cellulare e la differenziazione cellulare. Comprendere la progressione e il coordinamento di questi processi richiedono strumenti veloci di imaging con possibilità di tre dimensioni e la risoluzione subcellulare. Tra le tecniche con le capacità di imaging in vivo in luce foglio di illuminazione microscopio chiamato anche single / selettiva microscopia illuminazione aereo ha il vantaggio unico di produrre effetti a bassa fototossico e basso photobleaching 1,2. Nel foglio di illuminazione microscopia, il campione è illuminato dal lato da un foglio leggero, che esegue il sezionamento ottico. Il percorso di illuminazione e il percorso di rilevamento sono perpendicolari tra loro e il foglio leggero è allineato a coincidere con il piano focale oggetto della lente obiettivo rilevamento. Il campione è posto all&#39;intersezione dei due percorsi, unND può essere spostato lungo l&#39;asse di rilevamento per consentire l&#39;imaging 3D. Solo il piano di interesse è illuminato e tutti i punti di questo piano vengono rilevati allo stesso tempo. Ciò aumenta notevolmente la velocità di acquisizione e riduce fotoscolorimento nonché fototossicità rispetto alla microscopia confocale 3. In pratica, la microscopia illuminazione foglio è facile da installare e align: per due l&#39;imaging tridimensionale, non scansione è necessaria né per la parte di rilevamento, né per la parte illuminazione; come tecnica a grande campo con sezionamento, imaging tridimensionale può essere ottenuta con un singolo movimento asse della scena tenendo il campione. Qui vi presentiamo la creazione di un microscopio semplice foglio leggero e la sua attuazione in toto per l&#39;imaging di C. elegans embrioni. C. elegans embrioni sono adatti a vivere in vivo imaging a causa della loro trasparenza, lignaggio invariante e stereotipato cellulare posiziona a 4,5. Il setup foglio leggero sviluppato è basato su microscopio verticale standard per il rilevamento. Il protocollo presentato di seguito in dettaglio come costruire e allineare l&#39;eccitazione modulo / percorso, prova e caratterizzare il foglio leggero e montare il campione per l&#39;imaging 3D. Fornisce inoltre esempi di film time-lapse acquisite con l&#39;installazione su diversi ceppi che esprimono marcatori fluorescenti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td>SPIM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Detection</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>upright microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axiophot 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm)&#160;</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>EMCCD back illuminated</td>
			<td>ANDOR</td>
			<td>DU-885K-CS0-#VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Illumination</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 488nm / 60mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 405nm / 120mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td>LASER 561nm / 500mW</td>
			<td>COBOLT</td>
			<td>JIVE 500</td>
			<td>&#160;for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F57-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 405</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F38-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 488</td>
			<td>SEMROCK</td>
			<td>Di01-R488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>AOTF</td>
			<td>AA</td>
			<td>AOTFnC-400.650-TN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 50mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 200mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>periscope</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>RS99/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cylindrical lens f=100mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>ACY254-100-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>10X NA 0,3</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>xyz stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sample</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Bectkton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td>5% in water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Poly-L-Lysine solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L</td>
			<td>Havard Appartus</td>
			<td>30-0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Aspiration tube (mouth pipette)</td>
			<td>Dutsher</td>
			<td>55005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>M9 medium:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>KH2PO4 (3g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Na2HPO4 (6g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>NaCL (5g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>MgSO4 (1mM final)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Brice Detailleur&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>sample holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Claude Moretti&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>x stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>coverslip 50x20x1mm</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td></td>
			<td>cut then in 10x20x1mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>piezo electric stage with amplifier/controller</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-622.ZCD / E-625.CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette 40mmx40mmx10mm</td>
			<td>HELLMA</td>
			<td>704.002-OG.40 mm- 10mm high</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Diamond Point Glass Marking Pencil</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td>C++ (Qt) home made software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&#232;s, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting up a simple light sheet microscope for in toto imaging of c. elegans development

Tecniche di imaging fototossiche veloci e bassi sono pre-requisito per studiare lo sviluppo di organismi in toto. La microscopia foglio leggero basato riduce fotometabolismo ed effetti fototossiche rispetto alla microscopia confocale, fornendo immagini 3D con una risoluzione sub-cellulare. Presentiamo qui la configurazione di un foglio basato microscopio ottico, che è composto da un microscopio verticale e un piccolo insieme di elementi opto-meccanici per la generazione del foglio leggero. Il protocollo descrive come costruire, allineare il microscopio e caratterizzano il foglio leggero. Inoltre, si descrive come implementare il metodo per l&#39;imaging in toto di C. elegans embrioni utilizzando una semplice camera di osservazione. Il metodo consente la cattura di 3D bicolore film time-lapse over poche ore di sviluppo. Questo dovrebbe facilitare il monitoraggio delle forma della cellula, divisioni cellulari e proteine ​​marcate per lunghi periodi di tempo.

Tre esperimenti di registrazione time-lapse in 3D di tre diversi C. elegans ceppi illustrano il tipo di dati che può essere ottenuto usando la configurazione microscopio foglio leggero sopra descritto. Abbiamo verificato che in queste condizioni gli embrioni si sviluppano a velocità normale e sopravvivere imaging, coerente con i rapporti precedenti che indicano che l&#39;imaging SPIM provoca solo bassi livelli di fototossicità in C. elegans embrioni 6,7. Il primo ceppo esprime un istone fuso con GFP (zuIs178, stIs10024). Registrazione è stata effettuata per 2 ore con una pila di fette 20 (distanza tra le sezioni 1 micron) preso ogni 37 sec. Figura 6 illustra un piano della pila a tempi diversi. Entrambi i nuclei interfasiche (freccia) e condensato cromatina mitotico (testa di freccia) sono chiaramente visibili. Il secondo ceppo esprime un tubulina fuso con GFP (ruIs57) e un istonefusa alla mCherry (itIs37, stIs10226). La registrazione è stata effettuata durante 16 min con una pila di 20 fette (distanza tra le sezioni 1 micron) preso ogni 105 sec. Figura 7 illustra diversi piani dello stack e diversi punti temporali. Il film associato 1 visualizza ricostruzioni 3D a 3 punti temporali successivi. Durante la divisione, il fuso mitotico (verde) e cromosomi condensati (rosso) sono chiaramente visibili, permettendo il tracciamento degli orientamenti divisione cellulare durante lo sviluppo. Il terzo ceppo esprime l&#39;apolipoproteina VIT-2 fuso con GFP (pwIs23) e una membrana legata mCherry (ltIs44). La registrazione è stata effettuata durante 25 min con una pila di 10 fette (distanza tra le sezioni 1 micron) preso ogni 30 sec. Figura 8 illustra diversi piani dello stack e diversi punti temporali. I movimenti veloci delle particelle tuorlo lipoproteina (verde) all&#39;interno delle cellule possono essere facilmenteseguita. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1: configurazione ottica SPIM composto di illuminazione e di rilevamento unità, anteriore e vista basso. Nell&#39;unità di illuminazione, i laser combinate dagli specchi dicroici entrano AOTF, che controlla la potenza di ogni laser indipendente. Poi, il telescopio aumenta la dimensione del fascio da 4 volte e il periscopio lo porta all&#39;altezza del microscopio. La lente cilindrica forma il foglio leggero, che è riorientato dall&#39;obiettivo illuminazione. L&#39;unità di rilevazione è integrato nel microscopio verticale ed è composta principalmente dalla lente di rilevamento, il filtro, la lente del tubo e la EMCCD. Il campione viene posizionato all&#39;intersezione tra l&#39;illuminazione e rilevazione percorsi. Una fase piezoelettrico consente verticale (Z) spostamenti del campioneper l&#39;acquisizione 3D. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2:. Cuvette supporto Il supporto è costituito da 3 lastre di alluminio ed è avvitato sulla scena piezoelettrico. La cuvetta di vetro è detenuto da una molla (in rosso). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3: Montaggio protocollo di C. embrioni elegans per esperimenti SPIM. Un pezzo tagliato di vetro è rivestita con poli-L-lisina. Un pad di agar è posizionato sulla superficie rivestita. Poli-L-lisina viene aggiunto sul tampone agar. Infine, C. elegans embrioni sono allineate sul rivestita pad agar poli-L-lisina. Figura 4: Supporto del campione. Il titolare si adatta alle dimensioni interne della cuvetta vetro. Due molle (in rosso) tenere il vetrino (descritto in Figura 3). Questo supporto viene poi messo dentro la provetta di vetro. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5:... Supporto del campione nel contesto osservazione embrioni sono immobilizzati sul vetrino secondo il protocollo riassunto in Figura 3 La slitta è tenuto dal titolare esempio descritto in Figura 4 Il porta campione viene inserito nella cuvetta di vetro, dal titolare descritto in Figura 2. Il foglio leggero è orizzontale ed illuminates gli embrioni dal lato. La lente obiettivo rilevamento è verticale, sopra il campione. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6: La registrazione di un C. elegans embrione esprime una fusione istone :: GFP immagini unico piano di un embrione transgenico che esprime un istone :: fusione GFP (zuIs178; stIs10024) in diversi punti temporali immagini estratte da una registrazione time-lapse in 3D:.. pile realizzate in 20 fette ( distanza tra le sezioni 1 micron); tempo di esposizione per fetta: 30 msec; intervallo di tempo tra pile: 37 sec; tempo di acquisizione totale: 2 ore. Arrow: nucleo interfasico, punta di freccia: condensato cromatina mitotico. A t = 0 min l&#39;embrione è allo stadio di 2 cellule e at = 120 min dell&#39;embrione contiene circa 70 celle come previsto nelle normali s sviluppopeed (notare che solo le cellule contenute in un unico piano sono visibili nelle immagini e non tutte le cellule dell&#39;embrione). Il potere di illuminazione era il 30 μW a 488 nm (misurata all&#39;uscita dell&#39;obiettivo illuminazione). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure6.avi" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare questo video.</a> <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7: Registrazione di una C. elegans embrione esprimendo un tubulina :: GFP fusion e un istone :: mCherry fusione. immagini estratte da una registrazione time-lapse in 3D di una C. elegans embrione esprimendo un tubulina :: GFP fusione (ruIs57) e un istone :: mCherry fusione (itIs37, stIs10226). Condizioni di registrazione: acquisizione di una pila di 20 fette (distanza tra fette di 1micron) ogni 105 secondi; tempo totale di acquisizione: 16 min; tempo di esposizione: 200 msec per ciascun canale. Pannello una mostra 10 fette della stessa risma. Pannello B mostra la stessa fetta ogni 210 sec. Il potere di illuminazione era il 30 μW e 300 μW, per 488 e 561 nm laser, rispettivamente (misurati all&#39;uscita dell&#39;obiettivo illuminazione). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure7.avi" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare questo video.</a> <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig8highres.jpg" width="500" /> Figura 8: La registrazione di un C. elegans embrione esprimendo un VIT-2 :: GFP fusion e una membrana mirati mCherry. immagini estratte da una registrazione time-lapse in 3D di una C. elegans embrione esprime una fusione VIT-2 :: GFP (PWIS23) e un mCherry membrana targeting (ltIs44). Condizioni di registrazione: acquisizione di una pila di 10 fette (distanza tra le sezioni 1 micron) ogni 30 secondi; tempo totale di acquisizione: 25 min; tempo di esposizione per canale: 200 msec. Pannello A mostra i primi 5 fette della stessa pila. Pannello B mostra la stessa fetta ogni 30sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure8.avi" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare questo video.</a>

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Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Questo protocollo descrive la configurazione di un microscopio foglio leggero e la sua applicazione per l&#39;imaging in vivo di C. elegans embrioni.

Impostazione di un semplice foglio microscopio ottico per<em&gt; In Toto</em&gt; Imaging di<em&gt; C. elegans</em&gt; Sviluppo

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

setting-up-simple-light-sheet-microscope-for-toto-imaging-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

23.1K Views.  UMR7288 CNRS, Aix-Marseille Université.  Questo protocollo descrive la configurazione di un microscopio foglio leggero e la sua applicazione per l'imaging in vivo di C. elegans embrioni. 

Video: Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generazione di Stabile transgenici C. elegans Utilizzando Microiniezione

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Ricerca

Biologia

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

I componenti principali del microscopio ottico

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Generazione di transgenici C. elegans Di Trasformazione Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi di screening per identificare fenotipi postembrionale in C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Un metodo per la coltura embrionale<em&gt; C. elegans</em&gt; Celle

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Misurazioni delle risposte allo stress fisiologico in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

Misurazione della tossicità del Peptide RAN in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample chamber-based setups, which are specifically designed to preserve the three-dimensional integrity of the specimen and usually feature sample rotation, are the best choice in developmental biology. For instance, they have been used to document the entire embryonic morphogenesis of the fruit fly Drosophila melanogaster and the red flour beetle Tribolium castaneum. However, many available live imaging protocols provide only experimental frameworks for single embryos. Especially for comparative studies, such approaches are inconvenient, since sequentially imaged specimens are affected by ambient variance. Further, this limits the number of specimens that can be assayed within a given time. We provide an experimental framework for simultaneous live imaging that increases the throughput in sample chamber-based setups and thus ensures&#160;similar ambient conditions for all specimens. Firstly, we provide a calibration guideline for light sheet fluorescence microscopes. Secondly, we propose a mounting method for multiple embryos that is compatible with sample rotation. Thirdly, we provide exemplary three-dimensional live imaging datasets of Drosophila, for which we juxtapose three transgenic lines with fluorescently labeled nuclei, as well as of Tribolium, for which we compare the performance of three transgenic sublines that carry the same transgene, but at different genomic locations. Our protocol is specifically designed for comparative studies as it pro-actively addresses ambient variance, which is always present in sequential live imaging. This is especially important for quantitative analyses and characterization of aberrational phenotypes, which result e.g., from knockout experiments. Further, it increases the overall throughput, which is highly convenient when access to light sheet&#160;fluorescence microscopes is limited. Finally, the proposed mounting method can be adapted for other insect species and further model organisms, e.g., zebrafish, with basically no optimization effort.

Light sheet-based fluorescence microscopy is the most valuable tool in developmental biology. A major issue in comparative studies is ambient variance. Our protocol describes an experimental framework for simultaneous live imaging of multiple specimens and, therefore, addresses this issue pro-actively.

Imaging live simultaneo di più embrioni di insetti nei microscopi a fluorescenza a fogli di luce a camera campione

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.