Microscopia elettronica a Cheng lavoro di laboratorio è in parte il supporto anche da finanziamenti NIH (1R01GM082893, 1R01GM098672, 1S10RR026814-01 e P50GM082250 (A. Frankel)), e una borsa di studio UCSF Programma di Ricerca Biomedica Breakthrough, Premio Opportunità e New Technology Award.

1. Preparazione di EM griglie per il rivestimento di carbonio <ol><li> Riempire un grande bicchiere di vetro con acqua distillata. </li><li> Utilizzare una pipetta di vetro per far cadere una sola goccia di collodio (~ 20μl, 2% in acetato di amile, Scienze della Microscopia Elettronica, PA, USA) sulla superficie dell&#39;acqua. Collodio si diffonderà a formare uno strato sottile di plastica l&#39;acqua / aria di superficie; Nota: Una prima goccia di collodio può essere usato per cancellare la superficie dell&#39;acqua da eventuali particelle di polvere. Dopo la rimozione del film dalla prima goccia, la superficie dell&#39;acqua è chiaro di polvere. </li><li> Luogo EM griglie, 400 o 200 mesh Gilder griglie Cu acquistato da Ted Pella Inc. (USA), uno per uno sul foglio di plastica galleggianti sulla superficie dell&#39;acqua; solito posto 50 ~ 100 griglie in un modello stretto di imballaggio, con il lucido lato della griglia rivolto verso il basso nello strato di plastica (Fig. 1A). Nota: 400 reti mesh sono buone per routine negativo griglie macchia EM; che 200 reti mesh sono buoni per la raccolta di immagini coppia tilt. </li><li> Tagliare una tortace di carta con dimensioni leggermente più grandi rispetto alla zona dove sono poste le griglie sul foglio di plastica. Posizionare la carta con cautela sulla parte superiore della griglia (Fig. 1B), e attendere che la carta diventa completamente bagnato (Fig. 1C). Nota: I tipi di carta diversi hanno diversi tassi di assorbimento d&#39;acqua. E &#39;importante che la carta non assorbe l&#39;acqua troppo velocemente. Per esempio, regolare carta da filtro non è buono per questo scopo perché assorbe acqua troppo veloce e fa un sacco di rughe. Il film di carbonio in carta arricciata non è piatto, e quindi non buona per la raccolta di immagini coppia inclinazione casuale per la ricostruzione 3D conica tilt. Si deve verificare i documenti diversi per trovare una adatta. Nel nostro laboratorio, abbiamo usato carte da taccuini comprato al negozio locale. A volte la carta di giornale è stata riscontrata anche per essere adatto. Un&#39;altra opzione è quella di utilizzare la carta di riso relativa spessa utilizzata per la calligrafia cinese / giapponese. </li><li> Rapidamente praticare incisioni sulla pellicola di plastica intorno e vicino ala carta imbevuta. Subito dopo, usare un paio di pinze per prendere la carta con le griglie a sandwich tra il film di plastica e carta. Posizionare la carta in una capsula di Petri con le griglie rivolto verso l&#39;alto per l&#39;essiccazione all&#39;aria (Fig. 1D); Nota: è importante lasciare il giornale con aria secca. Asciugatura troppo veloce genera molte rughe sul giornale. </li></ol> 2. Rivestimento in carbonio griglie <ol><li> Il carbonio-rivestimento macchina utilizzata nel nostro laboratorio è una Cressington 208C Alto Vuoto Turbo Carbon Coater (Ted Pella). Il nostro sistema è equipaggiato con un monitor Cressington spessore del film, che misura lo spessore del film di carbonio rivestito basa sul principio che la frequenza di oscillazione di un cristallo di quarzo è cambiata la massa di un film depositato sulla sua superficie. Tuttavia, il protocollo qui descritto non richiede un monitor di spessore, dal momento che spesso non è disponibile in ogni laboratorio. </li><li> Affinare una canna in carbonio con un temperamatite (Ted Pella) e barre di carbonio carico rivestimento in carbonio machine (Fig. 2A). Due canne, uno con una punta acuminata e l&#39;altra con un finale piatto sono posti uno contro l&#39;altro. </li><li> L&#39;applicazione di grasso per vuoto a metà della superficie smerigliata di un vetrino e collocarlo accanto alle griglie (Fig. 2B). Solo la metà della superficie smerigliata del vetrino dovrebbe essere coperto con grasso per vuoto. Nota: l&#39;area con grasso vuoto non cambia colore dopo il rivestimento in carbonio. Il contrasto tra le aree adiacenti con e senza grasso per vuoto fornisce una stima dello spessore del carbonio rivestito. </li><li> Posizionare la carta con le griglie sul palco della macchina rivestimento in carbonio. Posizionare il vetrino vicino al griglie (Fig. 2C). Nota: Si può anche griglie primo trasferimento ricoperto con la pellicola di plastica per un vetrino prima del rivestimento, nel caso in cui molte griglie cadere dalla carta. </li><li> Pompa a camera a vuoto, e attendere che il vuoto raggiunge un livello di 10 -5 Torr. Nota: rivestimento con basso vuoto genera spesso molte scintille, risultando a molti grandi particelle di carboniola griglia. </li><li> Aumentare la corrente molto lentamente. La punta affilata della canna di carbonio prima diventare rosso e poi bianco come la corrente aumenta. Non guardare la punta alta luminosità direttamente ad occhio nudo. Fermare l&#39;aumento di corrente quando il rivestimento si avvia. Il vetrino cambia colore dal bianco al grigio chiaro e grigio scuro poi. L&#39;oscurità delle diapositive correla lo spessore del film di carbonio viene rivestito. Spegnere il rivestimento in corso per fermare quando lo spessore desiderato è stato raggiunto (Fig. 2D). Nota: 1) Dopo ripetuti processi di rivestimento in carbonio, il carbonio rivestiti dall&#39;interno della campana di vetro potrebbe oscurare il suo colore. Questo rende il film di carbonio rivestito appaiono più spesso di quanto non sia in realtà. 2) Un asta di carbonio affilata può essere utilizzato per il rivestimento di molti. La nitidezza della punta è gradualmente ridotta dopo ogni rivestimento. La corrente massima è influenzata dalla nitidezza della canna di carbonio. Una canna appena affilato con diametro inferiore richiede un parente minorecorrente per far evaporare carbonio. Più tardi rivestimento può richiedere leggermente superiore in corso. </li><li> Vent la camera a vuoto e rimuovere le griglie rivestito per un uso successivo. Nota 1. Il metodo più accurato per controllare lo spessore di carbonio è quello di utilizzare un monitor di spessore del film. Oppure si può qualitativamente calibrare il colore contro lo spessore esatto misurata dal monitor. Uno spessore di carbonio utile per questa tecnica è tra 3 e 7 nm. </li></ol> Questo è un metodo semplice e facile per preparare una grande quantità di griglie di carbonio rivestiti, di solito circa 100 griglie per la preparazione. Le griglie contengono un sottile strato di plastica, che di solito non influisce sulla qualità dell&#39;immagine negativa macchiato. Tuttavia, griglie preparate in questo metodo non sono adatti per cryoEM. Questo strato di plastica può essere rimosso immergendo le griglie in cloroformio per diverse ore. 3. Preparazione formiato soluzione uranile (0,75%) per negativi EM macchia. Il protocollo è stato dettagliatodescritto in precedenza 5 <ol><li> Pesare 37.5mg di formiato di uranile in un bicchiere piccolo; </li><li> Aggiungere 5 ml di acqua bollente e mescolare per 5 minuti al buio; </li><li> Aggiungere 10μl 5M di NaOH, continuare mescolare per 5 minuti; </li><li> Filtrare la soluzione con una siringa filtro (Fisherbrand, 13mm filtro per siringa, 0.2μm, nylon non sterili, numero di catalogo 09-720-5), e conservare la soluzione filtrata in un tubo Falcon 8ml coperto con un foglio di alluminio; Nota. Uranile polvere formiato può essere acquistato da Scienze della Microscopia Elettronica (Hatfield, PA), numero di catalogo 22451. Formiato soluzione uranile è sensibile alla luce e deve essere tenuto lontano dalla luce diretta, ad esempio coprendo il tubo Falcon con un foglio di alluminio. Una soluzione preparata di recente ha un colore giallo chiaro (Fig. 3A). Soluzione macchia può essere tenuto in panchina per una o due settimane prima del suo inizio precipitazione. Formiato di uranile è acida con un pH ~ 4. L&#39;aggiunta di NaOH il pH aumenta, ma aggiungendo che troppo in frettao in eccesso può causare la macchia a precipitare. Oltre a generare contrasto, formiato di uranile fissa anche il campione. Perché il tasso di fissazione è così rapida, il basso pH non influenza le conformazioni delle proteine ​​generale o la formazione di proteine ​​complesse 7. </li></ol> 4. Protocollo per la preparazione negativo macchia EM griglia. Questo protocollo è stata descritta nel dettaglio in precedenza 5 <ol><li> Glow-scarico griglia di carbonio rivestiti, utilizzando PELCO easiGlow GlowDischarge sistema (Ted Pella Inc., USA). La corrente utilizzata è di 15 mA e griglie sono bagliore scarica per 30 sec. Nota. Glow-griglie di scarico deve essere utilizzato subito dopo la luce di scarico. Spesso usiamo le griglie in meno di 2 ore dopo l&#39;glow discharge. </li><li> Mettere due gocce 20μl di acqua distillata e due gocce di soluzione di 25μl uranile formiato su un pezzo di parafilm (Fig. 3B). </li><li> Tenere un bagliore-scarica griglia utilizzando reverse-force anti-capillare pinze con l&#39;autobon rivestite verso l&#39;alto. Nota: è necessario utilizzare anti-capillare pinze. Altrimenti, campione liquido sarà risucchiata dalle reti dalla forza capillare tra le pinze. </li><li> Applicare il campione 2μl proteina per la luce-scarica griglia e attendere per 30 sec. Nota: Il tempo di attesa e la durata della glow discharge influenza la concentrazione di proteine ​​adsorbite nella griglia. Campioni molto diluiti richiedono tempi più lunghi di adsorbimento. Tuttavia, l&#39;assorbimento prolungato può cambiare la concentrazione del tampone dal vapore acqueo. Per raggiungere una corretta distribuzione delle particelle in griglia richiede un po &#39;di prova e l&#39;approccio di errore. </li><li> Blot fuori l&#39;esempio utilizzando carta da filtro. </li><li> Toccare la superficie della griglia per una goccia d&#39;acqua e poi asciugare l&#39;acqua con carta da filtro. Ripetere con la goccia d&#39;acqua 2. </li><li> Toccare la superficie della griglia per la prima goccia di una breve macchia. Blot fuori la soluzione macchia con carta da filtro. </li><li> Toccare la superficie della griglia per la seconda goccia di colorante per 20 secondi. Blot off soluzione macchia con carta da filtro. </li><li> Asciugare la griglia con un aspirapolvere. Nota: si può anche lasciare le griglie in panchina o in una cappa chimica per asciugare all&#39;aria. Il vantaggio di vuoto a secco è che si possono osservare le griglie in EM immediatamente. L&#39;artefatto possibili generato da una rapida essiccazione è irregolare macchia. </li></ol> 5. Microscopio elettronico a trasmissione <ol><li> Il microscopio usato in questa dimostrazione è un T12 Tecnai (FEI Company), dotato di una fotocamera Gatan 4K x 4K CCD. </li><li> Brevemente verificare l&#39;allineamento del microscopio prima di inserire campione; Nota: Questa è necessaria solo una volta per sessione di EM. In un modello di microscopio, un allineamento perfetto può essere salvato in precedenza. Caricamento di un file di allineamento dovrebbe ripristinare l&#39;allineamento microscopio ad una condizione quasi perfetto. </li><li> Caricare la griglia EM nel singolo titolare di inclinazione del campione standard. </li><li> Inserire il supporto nel CompuStage del T12. Attendere che il ciclo di pompaggio per il completamento. </li><li> Inserire il supporto in colonna. &lt;/ Li&gt; <li> Messa a fuoco del campione e impostare una sfocatura voluta, di solito-1.5um. Nota: messa a fuoco può essere ottenuto sia con messa a fuoco manuale con il metodo del contrasto minimo o con camera CCD per catturare immagini dal vivo e vivere spettro di potenza di calcolo di Fourier. </li><li> Registrare un&#39;immagine con telecamera CCD; </li><li> Nelle immagini di campioni macchiato negativamente le proteine, le proteine ​​sono spesso visti con contrasto bianco, densità cioè bianco su uno sfondo più scuro. Si noti che mentre la concentrazione di proteine ​​in diverse zone della stessa griglia di solito sono abbastanza simili, si fa osservare diversi livelli di macchia in diverse aree della griglia stessa. A volte le zone potrebbe avere macchie irregolari o addirittura colorazione positiva (proteine ​​appare scuro su sfondo chiaro), mentre altre aree sono perfette macchia. Spesso è necessario per cercare la rete per individuare una buona zona per l&#39;imaging. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati Esempi di buone immagini tipiche di negativo stacampioni INED, cavallo milza ferritina (Figura 4A), Fab (Fig. 4B), archaeal proteasoma 20S (Fig. 4C) e nucleosoma (Fig. 4D), sono mostrati. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig1.jpg" /> Figura 1. Preparazione delle griglie di carbonio rivestiti per negativo EM macchia. A) Inserimento EM griglie uno per uno in un modello di imballaggio chiuso sulla superficie del film di collodio. B) Posizionamento di un pezzo di carta leggermente più grande dell&#39;area delle griglie. C) Attendere che la carta viene completamente bagnata. D) Prendete la carta con le griglie per l&#39;aria di essiccazione. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig2.jpg" /> Figura 2. . Rivestimento griglie EM con carbonio A) Imposta l&#39;evaporatore di carbonio: luogo le due barre di carbonio negli apparati di rivestimento, con una sola canna (a sinistra) ad una punta affilata punto. L&#39;asta di altri (a destra) ha una superficie piana ed entrare in contatto con la punta il punto di quello in s di fronte alide. B) Mettete una piccola quantità di grasso vuoto in un lato di un vetrino favorito. L&#39;area all&#39;interno della cornice nera è grasso per vuoto. C) Imposta le griglie per il rivestimento. I vetrini sono usati per tenere la carta in posizione. La freccia indica la zona con grasso per vuoto. D) Dopo il rivestimento, il colore della diapositiva con grasso vuoto coperto non cambia il colore. Il contrasto indica lo spessore del carbonio rivestito. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig3.jpg" /> Figura 3. Illustrando la procedura di colorazione negativa. A) preparata di fresco (a sinistra) soluzione formiato di uranile è trasparente senza segno di precipitati. Dopo 1 ~ 2 settimane, precipitati iniziare ad accumulare in basso nella parte inferiore del tubo. B) Inserire due gocce (~ 25μl) di acqua distillata e due gocce di soluzione di formiato di uranile in un pezzo di parafilm. Usare un paio di anti-capillare pinze per tenere un bagliore scarica carbonio rivestite griglia di EM con il lato di carboniol&#39;alto. Una goccia di campione (~ 2μl) è posto in griglia. C) Dopo aver aspettato per 30 secondi, asciugare la soluzione con un filtro di carta. D) Capovolgere la griglia di toccare il lato campione della griglia con la prima goccia d&#39;acqua. Ripetere il passaggio C e D per completare il processo di colorazione. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig4.jpg" /> Figura 4. Esempi di EM immagini di campioni di proteine ​​negativamente colorati. A) ferritina milza a cavallo, B) frammento di legare l&#39;antigene (Fab), C) archaeal proteasoma 20S e D) nucleosoma. Tutte le immagini sono state registrate con lo stesso ingrandimento. La barra di scala è 20 nm.

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	<li>Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advent+of+near-atomic+resolution+in+single-particle+electron+microscopy.">The advent of near-atomic resolution in single-particle electron microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 723-742 (2009).</li><li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy.">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (2), 265-273 (2011).</li><li>Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+cryo+electron+microscopy+of+macromolecular+complexes.">Atomic resolution cryo electron microscopy of macromolecular complexes.</a> Adv. Protein Chem. Struct. Biol. 82, 1-35 (2011).</li><li>Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+viruses.">Cryo-electron microscopy of viruses.</a> Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy.">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Rabl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+gate+opening+in+the+20S+proteasome+by+the+proteasomal+ATPases.">Mechanism of gate opening in the 20S proteasome by the proteasomal ATPases.</a> Mol. Cell. 30 (3), 360-368 (2008).</li><li>Zhao, F. Q., Craig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+time-resolved+changes+in+molecular+structure+by+negative+staining.">Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining.</a> J. Struct. Biol. 141 (1), 43-52 (2003).</li><li>Radermacher, M., Wagenknecht, T., Verschoor, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+from+a+single-exposure,+random+conical+tilt+series+applied+to+the+50S+ribosomal+subunit+of+Escherichia+coli.">Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli.</a> J. Microsc. 146 (Pt. 2), 113-136 (1987).</li><li>Zhao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+adjustment+of+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters.">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring adjustment of a particularly large combination of specific parameters.</a> J. Struct. Biol. 169 (3), 450-454 (2010).</li><li>Nishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+leukocyte+beta2+integrins+by+conversion+from+bent+to+extended+conformations.">Activation of leukocyte beta2 integrins by conversion from bent to extended conformations.</a> Immunity. 25 (4), 583-594 (2006).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Negativo macchia EM è un potente strumento che può essere utilizzato per studiare le strutture 3D di campioni proteina purificata, come l&#39;utilizzo casuale inclinazione conica 8 metodo, che richiede la raccolta di una coppia di immagini con uno da campione inclinato a 60 ° e uno dalla stessa area ma Untilted, per calcolare ricostruzioni 3D di complessi macromolecolari. Inoltre, colorazione negativa EM può avere molte altre applicazioni, come ad esempio screening per bidimensionali (2D) i cristalli di proteine ​​di membrana 9, visualizzando complessi proteici in diverse conformazioni 10, o semplicemente per visualizzare omogeneità e / o eterogeneità del campione di proteine ​​purificate così fornendo feedback di migliorare le procedure di purificazione di proteine, ecc Si può essere un test efficace per biochimici. In questo articolo, abbiamo presentato i protocolli che vanno dalla preparazione del carbonio rivestite griglie di raccolta di immagini di campioni di proteine ​​negativamente colorati in un microscopio elettronico. Come illustrato qui,la procedura è piuttosto semplice e facile da seguire. Se si tenta di calcolare ricostruzioni 3D del campione viene osservato da casuali metodo inclinazione conica, è necessario acquisire immagini coppia tilt. Tuttavia, se l&#39;esecuzione di analisi singola particella è lo scopo, più immagini Untilted sarà sufficiente. In entrambi i casi, l&#39;elaborazione delle immagini è necessario un ulteriore e questo va oltre lo scopo di questo articolo video. Come con qualsiasi metodo, ci sono variazioni ai protocolli. Formiato di uranile funziona molto bene come reagente negativo macchia nella maggior parte dei casi. Acetato di uranile è un altro comunemente usato reagente negativo macchia. Funziona molto simile come formiato di uranile, ma con una granulometria maggiore e, in molti casi, inferiori contrasto rispetto a formiato di uranile. Il vantaggio di utilizzare acetato di uranile è che la soluzione dura più di formiato di uranile. Non c&#39;è bisogno di preparare una soluzione fresca ogni una o due settimane. Sia formiato e acetato di uranile sono acide. Una preoccupazione ovvia è che ilpH basso potrebbe indurre cambiamenti nel campione di proteine ​​oggetto di studio. Entrambe le soluzioni macchia anche funzionare come fissativi proteine. Uno studio precedente ha dimostrato che entrambi i campioni di proteine ​​fissare rapidamente 7. Questo fissaggio rapido rende il basso pH meno importanti. Durante il processo di colorazione, un campione di proteina si fissa prima il pH basso può indurre le eventuali modifiche. Tuttavia, altri reagenti negativi macchia, come molibdato di ammonio e acido fosfotungstico, possono dare risultati migliori per la colorazione dei campioni quando il pH basso è un problema 7. Sia molibdato di ammonio e acido fosfotungstico avere un pH circa neutro, ma il contrasto di campioni di proteina generata da queste macchie è di solito inferiore a formiato di uranile.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Collodio </td><td> Electron Microscopy Sciences, PA, USA </td><td> 12620-30 </td><td> 30ml, 2% in acetato di amile </td></tr><tr><td> Gilder Cu griglie </td><td> Ted Pella Inc., USA </td><td> G400/G200 </td><td> 400/200 mesh </td></tr><tr><td> Cressington 208C Alta Coater Carbon Vacuum Turbo </td><td> Ted Pella Inc., USA </td><td> 9260 </td><td></td></tr><tr><td> Doppia punta canna in carbonio </td><td> Ted Pella Inc., USA </td><td> 58 </td><td></td></tr><tr><td> Uranile formiato </td><td> Electron Microscopy Sciences, PA, USA </td><td> 16984-59-1 </td><td> 99,9% purezza </td></tr><tr><td> PELCO easiGlow GlowDischarge sistema </td><td> Ted Pella Inc., USA </td><td> 91000 </td><td> L&#39;acquisto in farmacia locale </td></tr><tr><td> Whatman # 1 Filtro di carta </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-805E </td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain em: from grid preparation to image acquisition

Singolo microscopio elettronico di particelle (EM), sia macchiato negativo o congelati campioni biologici idratata, è diventato uno strumento versatile nel campo della biologia strutturale 1. Negli ultimi anni, questo metodo ha ottenuto grande successo nello studio delle strutture delle proteine ​​e dei complessi macromolecolari 2, 3. Rispetto alle elettroni cryomicroscopy (cryoEM), nella quale sono incorporate congelati campioni di proteine ​​idratata in un sottile strato di ghiaccio vitreo 4, colorazione negativa è più semplice un metodo di preparazione del campione in cui sono incorporati campioni di proteine ​​in un sottile strato di sale essiccato metalli pesanti per aumentare la campione di contrasto 5. Il contrasto maggiore di macchia negativa EM consente l&#39;esame di campioni biologici relativamente piccolo. Oltre a determinare tridimensionali (3D) la struttura di proteine ​​purificate o complessi di proteine ​​6, questo metodo può essere utilizzato per scopi molto più ampio. Per esempio, macchia negativa EM può essere facilmente utilizzato per visualizzare purificatacampioni di proteine, ottenendo informazioni quali l&#39;omogeneità / eterogeneità del campione, la formazione di complessi proteici o assiemi di grandi dimensioni, o semplicemente per valutare la qualità di un preparato proteico. In questo articolo il video, vi presentiamo un protocollo completo per utilizzare un EM di osservare campione di proteine ​​negativamente macchiato, dalla preparazione griglie di carbonio rivestiti per negativi macchia EM ad acquisire immagini di campione negativamente macchiato in un microscopio elettronico operato a 120kV tensione di accelerazione. Questi protocolli sono stati utilizzati nel nostro laboratorio di routine e può essere facilmente seguita da nuovi utenti.

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Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Campioni di proteine ​​di visualizzazione negativo microscopia elettronica macchia (EM) è diventato un metodo popolare di analisi strutturale. È utile per l&#39;analisi quantitativa strutturale, come ad esempio calcolare una ricostruzione 3D delle molecole in fase di studio, e anche per l&#39;esame qualitativo della qualità della preparazione delle proteine. In questo articolo presentiamo protocolli dettagliati per la preparazione delle griglie EM, colorazione del campione e visualizzando il campione in un microscopio elettronico. Gli utenti meno esperti possono seguire questi protocolli in modo semplice e di utilizzare negativo EM macchia come un test di routine, oltre ad altri saggi biochimici, per valutare i loro campioni di proteine.

Visualizzazione proteine ​​e complessi macromolecolari di Negative EM Stain: dalla preparazione alla griglia Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

visualizing-proteins-macromolecular-complexes-negative-stain-em-from

Research

JoVE Journal

Bioengineering

58.3K Views.  University of California San Francisco. Campioni di proteine ​​di visualizzazione negativo microscopia elettronica macchia (EM) è diventato un metodo popolare di analisi strutturale. È utile per l'analisi quantitativa strutturale, come ad esempio calcolare una ricostruzione 3D delle molecole in fase di studio, e anche per l'esame qualitativo della qualità della preparazione delle proteine. In questo articolo presentiamo protocolli dettagliati per la preparazione delle griglie EM, colorazione del ...

Video: Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Cella Co-cultura Patterning Uso acquose due sistemi monofase

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

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Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their extracellular matrix (ECM) environment. Eukaryotic cells constantly sense their local microenvironment through surface mechanosensors to transduce physical changes of ECM into biochemical signals, and integrate these signals to achieve specific changes in gene expression. Interestingly, physicochemical and mechanical parameters of the ECM can couple with each other to regulate cell fate. Therefore, a key to understanding mechanotransduction is to decouple the relative contribution of ECM cues on cellular functions.
Here we present a detailed experimental protocol to rapidly and easily generate biologically relevant hydrogels for the independent tuning of mechanotransduction cues in vitro. We chemically modified polyacrylamide hydrogels (PAAm) to surmount their intrinsically non-adhesive properties by incorporating hydroxyl-functionalized acrylamide monomers during the polymerization. We obtained a novel PAAm hydrogel, called hydroxy-PAAm, which permits immobilization of any desired nature of ECM proteins. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing allows to independently control the morphology of single-cells, the matrix stiffness, the nature and the density of ECM proteins. We provide a simple and rapid method that can be set up in every biology lab to study in vitro cell mechanotransduction processes. We validate this novel two-dimensional platform by conducting experiments on endothelial cells that demonstrate a mechanical coupling between ECM stiffness and the nucleus.

We present a new polyacrylamide hydrogel, called hydroxy-PAAm, that allows a direct binding of ECM proteins with minimal cost or expertise. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing facilitates independent control of many cues of the natural cell microenvironment for studying cellular mechanostransduction.

Preparazione di idrossi-PAAM idrogel per dissociare gli effetti di meccanotrasduzione Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Migliorare 2D e 3D della pelle<em&gt; In Vitro</em&gt; modelli con Macromolecole affollamento

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

3D Stem magnetica cellulare Aggregazione e bioreattore maturazione per la cartilagine Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualizzazione di formazione di aderenze in cellule per mezzo di avanzati filatura microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale disco

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Rilevamento dell'endotossina in Nano-formulazioni utilizzando dosaggi di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their biocompatibility, biodegradability, non-immunogenicity, non-toxicity, and ability to entrap both hydrophilic and hydrophobic compounds. The classical hydration of thin lipid films in an organic solvent is applied herein as a technique to encapsulate tarin, a plant lectin, in nanoliposomes. Nanoliposome size, stability, entrapment efficiency, and morphological characterization are described in detail. The nanoliposomes are prepared using 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt; DSPE-MPEG 2000), and cholesterylhemisuccinate (CHEMS) as the main constituents. Lipids are first dissolved in chloroform to obtain a thin lipid film that is subsequently rehydrated in ammonium sulfate solution containing the protein to be entrapped and incubated overnight. Then, sonication and extrusion techniques are applied to generate nanosized unilamellar vesicles. The size and polydispersity index of the nanovesicles are determined by dynamic light scattering, while nanovesicle morphology is assessed by scanning electron microscopy. Entrapment efficiency is determined by the ratio of the amount of unencapsulated protein to original amount of initially loaded protein. Homogeneous liposomes are obtained with an average size of 155 nm and polydispersity index value of 0.168. A high entrapment efficiency of 83% is achieved.

This study describes classical hydration using the thin lipid film method for nanoliposome preparation followed by nanoparticle characterization. A 47 kDa-hydrophilic and globular protein, tarin, is successfully encapsulated as a strategy to improve stability, avoid fast clearance, and promote controlled release. The method can be adapted to hydrophobic molecules encapsulation.

Preparazione e caratterizzazione dei nanoliposomi per l'entratura delle proteine globulari bioattive

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol applies a macromolecular crowding (MMC) technique to mimic this physiological crowding through the addition of neutral polymers (crowders) to cell cultures in vitro. Previous studies using Ficoll or dextran as crowders demonstrate that the expression of collagen I and fibronectin in WI38 and WS-1 cell lines are significantly enhanced using the MMC technique. However, this technique has not been validated in primary hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts (hHSFs). As hypertrophic scarring arises from the excessive deposition of collagen, this protocol aims to construct a collagen-rich in vitro hypertrophic scar model by applying the MMC technique with hHSFs. This optimized MMC model has been shown to possess more similarities with in vivo scar tissue compared to traditional 2-dimensional (2-D) cell culture systems. In addition, it is cost-effective, time-efficient, and ethically desirable compared to animal models. Therefore, the optimized model reported here offers an advanced &#8220;in vivo-like&#8221; model for hypertrophic scar-related studies.

This protocol describes the use of macromolecular crowding to create an in vitro human hypertrophic scar tissue model that resembles in vivo conditions. When cultivated in a crowded macromolecular environment, human skin fibroblasts exhibit phenotypes, biochemistry, physiology, and functional characteristics resembling scar tissue.

In vitro Modello di umano cutaneous ipertrofico cicatrici utilizzando Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Using Magnetometry to Monitor Cellular Incorporation and Subsequent Biodegradation of Chemically Synthetized Iron Oxide Nanoparticles

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized in cells and then left within. One challenge is to assess their fate in the intracellular environment with reliable and precise methodologies. Herein, we introduce the use of the vibrating sample magnetometer (VSM) to precisely quantify the integrity of magnetic nanoparticles within cells by measuring their magnetic moment. Stem cells are first labeled with two types of magnetic nanoparticles; the nanoparticles have the same core produced via a fast and efficient microwave-based nonaqueous sol gel synthesis and differ in their coating: the commonly used citric acid molecule is compared to polyacrylic acid. The formation of 3D cell-spheroids is then achieved via centrifugation and the magnetic moment of these spheroids is measured at different times with the VSM. The obtained moment is a direct fingerprint of the nanoparticles&#8217; integrity, with decreasing values indicative of a nanoparticle degradation. For both nanoparticles, the magnetic moment decreases over culture time revealing their biodegradation. A protective effect of the polyacrylic acid coating is also shown, when compared to citric acid.

Iron oxide nanoparticles are synthesized via a nonaqueous sol gel procedure and coated with anionic short molecules or polymer. The use of magnetometry for monitoring the incorporation and biotransformations of magnetic nanoparticles inside human stem cells is demonstrated using a vibrating sample magnetometer (VSM).

Utilizzo della magnetometria per monitorare l'incorporazione cellulare e la successiva biodegradazione delle nanoparticelle di ossido di ferro sintetizzate chimicamente

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Visualizzazione proteine ​​e complessi macromolecolari di Negative EM Stain: dalla preparazione alla griglia Image Acquisition

Visualizzazione proteine e complessi macromolecolari di Negative EM Stain: dalla preparazione alla griglia Image Acquisition