Questo video introduce un metodo rapido ed efficiente per la sintesi di nanoparticelle magnetiche e l'uso della magnetometria per fotografare la trasformazione nell'ambiente biologico. Le nanoparticelle magnetiche hanno attirato una maggiore attenzione per le applicazioni biomediche, ed è importante capire che il destino una volta interiorizzato nelle cellule. Questo si ottiene qui misurando il magnetismo cellulare.
Sia per la sintesi magnetica delle nanoparticelle che per le misurazioni, il risultato potrebbe essere influenzato dalla contaminazione. Utilizzare fiale chimiche ben pulite e assicurarsi che l'apparecchiatura del magnetometro sia priva di contaminazione. Il supporto per campioni di magnetometria viene solitamente utilizzato per campioni di polvere.
Mostriamo come adattare l'uso del supporto a campioni liquidi o biologici. In una fiala di vetro a onde di mana da 30 millilitri sciogliere 400 milligrammi di ferro tre acetilacetonato in 10 millilitri di alcol bendilico. Utilizzando un reattore a microonde, riscaldare la sospensione da 25 gradi Celsius a 250 gradi Celsius ad una velocità di 11,25 gradi Celsius al minuto e mantenerla a 250 gradi Celsius.
Per separare le nanoparticelle, applicare un magnete al neodimio per 30 minuti. Per pellettizzare le nanoparticelle, eseguire una serie di lavaggi utilizzando 10 millilitri del fluido di lavaggio designato e applicando un magnete al neodimio per cinque minuti. Rimuovere il filtrato e aggiungere 12 millilitri da 10 al meno due acido cloridrico molare.
Centrifugare la sospensione e un filtro da 100 kilodalton a 2.200 volte G per 10 minuti. Quindi rimospendare le nanoparticelle in 10 millilitri da 10 a meno due acido cloridrico molare. Preparare la soluzione della molecola di rivestimento come descritto nel manoscritto.
Aggiungere la dispersione acquosa della nanoparticella da 10 millilitri alla soluzione della molecola di rivestimento ad un rapporto di massa di cinque a uno tra le molecole di rivestimento e le nanoparticelle. Quindi agitare la miscela per due ore a temperatura ambiente utilizzando un agitatore magnetico. Una volta completata la reazione, regolare il pH della miscela a sette usando un idrossido di sodio molare.
Quando la coltura di cellule staminali mesenchimali umane è al passaggio cinque e il 90% confluente, rimuovere il mezzo e sciacquare le cellule con RPMI senza siero senza glutammina. Ad ogni pallone da coltura di 150 centimetri quadrati, aggiungere 10 millilitri della sospensione della nanoparticella. Incubare i contenitori a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 30 minuti.
Quindi scartare il mezzo contenente la sospensione della nanoparticella e lavare le cellule una volta con RPMI 1640 privo di siero. Aggiungere DMEM integrato con 10%FBS e 1%penicillina streptomicina. Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per consentire la completa internalizzazione delle nanoparticelle.
Aggiungere 10 millilitri dello 0,05% di tripsidena EDTA preconfeziosi per 37 gradi Celsius a ogni pallone di MSC con etichetta magnetica. Dopo due o tre minuti, quando le cellule vengono staccate, disattivare immediatamente la tripina aggiungendo un terzo del volume di DMEM integrato pre-avvertito. Centrifugare le cellule staccate a 260 volte G per cinque minuti.
Aspirare il mezzo e rimescolare le cellule in un piccolo volume di mezzo di coltura cellulare-sferoide ad una concentrazione di circa 200.000 cellule per 50 microlitri. Aggiungere un millilitro di mezzo di coltura cellulare-sferoide appena preparato a un tubo di centrifuga conica sterile da 15 millilitri. Quindi aggiungere un volume di sospensione cellulare corrispondente a 200.000 celle.
Centrifugare queste cellule etichettate magneticamente a 180 volte G per tre minuti al fine di formare un pellet di cellule nella parte inferiore del tubo. Quindi posizionare il tubo nell'incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, mantenendo il tappo leggermente aperto per lo scambio di gas. Posizionare un dato volume di nanoparticella magnetica o una sospensione fissa a singola cellula-sferoide nel magnetometro del campione vibrante, o VSM, detentore del campione.
Se necessario, il nastro PTFE può essere utilizzato per evitare perdite. Inserire il portacampioni nel VSM e cercare l'offset del campione. Posizionare il campione nella posizione corrispondente al massimo di magnetizzazione.
Eseguire la prima misurazione a un campo magnetico basso tra -1.500 Oersteds e positivo 1.500 Oersteds ad una velocità di 20 Oersted al secondo. Eseguire una seconda misurazione ad alto campo magnetico tra zero Oersted e 30.000 Oersted positivi ad una velocità di 200 Oersted al secondo. 10 microlitri di nanoparticelle disperse in una soluzione acquosa sono stati misurati nel magnetometro a campione vibrante.
La pendenza della seconda parte della curva è la costante diamagnetica, che rappresenta il segnale diamagnetico dall'acqua e il portacampioni. Questa costante diamagnetica è stata sottratta dal momento magnetico della soluzione per ottenere solo il momento magnetico delle nanoparticelle. È stato quindi determinato il momento magnetico alla saturazione.
Le nanoparticelle rivestite sono state internalizzate nelle cellule staminali. Le immagini al microscopio elettronico mostrano le nanoparticelle rivestite di citrati e rivestite di PAA confinate negli endosomi. Dopo che le cellule sono state pellettate dalla centrifugazione, hanno formato una cellula-sferoide che può essere mantenuta in coltura per lunghi periodi di tempo.
I singoli sferoidi cellulari sono stati misurati anche usando il VSM e il momento magnetico di saturazione è stato usato per calcolare la quantità di nanoparticelle in un campione cellulare. L'assorbimento delle nanoparticelle dipende dalla loro concentrazione di incubazione. Una diminuzione del magnetismo delle cellule-sferoidi nel tempo ha indicato la biodegradazione delle nanoparticelle, che è stata confermata dalla microscopia elettronica.
La degradazione era più consistente nelle nanoparticelle rivestite di citrati che nelle nanoparticelle rivestite di PAA. Usando la magnetometria, la degradazione delle nanoparticelle magnetiche all'interno delle cellule può essere quantificata con precisione, e l'impatto del futuro delle nanoparticelle sull'interessato al comportamento grezzo può essere valutato. In questo protocollo, le misurazioni della magnetometria sono state eseguite su sferoidi cellulari, ma possono essere estese alle cellule in sospensione o agli organi.
Con il metodo descritto, sei in grado di esplorare le interazioni di nanoparticelle magnetiche di nuova progettate in diversi sistemi cellulari di interesse, ma puoi anche seguire la loro biodistribuzione e il loro destino in vivo.
